免疫層析試紙檢測技術研究進展

王寅彪，劉 肖，李青梅，郭軍慶

·綜述·

免疫層析試紙檢測技術研究進展

王寅彪1，2，劉 肖2，李青梅2，郭軍慶2

目的 探討免疫層析試紙檢測在即時檢測中的研究現狀及未來的發展方向和應用價值。方法 參閱國內外發表的文獻，綜述免疫層析試紙在抗原、抗體、半抗原檢測領域的應用及利用新納米材料提高檢測敏感度的設計策略。結果 傳統的免疫層析試紙主要以膠體金作為示蹤物利用競爭法或夾心法對半抗原、抗原和抗體等進行檢測，但存在敏感度不足及定量檢測受限等問題，結合不同納米材料進行新型試紙研發將有助于克服這些缺陷，向更高敏感性、定量、多聯的檢測方向發展。結論 免疫層析試紙是進行即時檢測和現場檢測的重要工具，未來可用于對大規模群體實施檢測，獲取大數據，建立疾病或食品安全預警評價信息平臺。

免疫色譜法；免疫層析試紙；綜述

Abstract：Objective This paper aimed to review the current use and future development of immunochromatographic strip in instant testing. Methods Advanced research papers were studied and reviewed for summarizing the use of strip test in detecting antigens，antibodies，and haptens，and novel strategies in enhancing sensitivity of the strip test utilizing new nano-materials. Results Conventional strip test mainly used colloidal gold as tracers or competition format for detecting antigens，antibodies，and haptens.However， it was limited by relatively low sensitivity and difficulty of quantitate detection.Combination of different newly-developed nano-materials with strip will be helpful for more sensitive，quantitative，and multiplex detection. Conclusion Immunochromatographic strip is an important application for instant testing and site detection，and will be used for detecting large population for acquiring big data and establishing prewarning platforms of disease prevention and food safety surveillance.

Key words：immunochromatography；immunochromatographic test strip；review

免疫層析試紙檢測技術是基于單克隆抗體技術、免疫標記技術及免疫層析技術發展起來的一種新型的簡化檢測技術，可用于抗原、抗體及半抗原的定性、半定量及定量檢測，具有簡便、特異、快速、敏感的特點，且不依賴于專業技術人員及昂貴的儀器設備［1］。試紙由樣品墊、膠金墊、NC膜及吸水紙等材料依附在有一定硬度的支架上組成，對樣品進行檢測時，在吸水紙的吸引作用及毛細管作用下，液體樣品依次通過樣品墊、膠金墊、NC膜，到達吸水紙端。NC膜上固化有兩道線：檢測線和質控線。質控線顯色指示測試有效，檢測線則根據檢測模式的不同而呈現紅色或不顯色，以指示陽性或陰性結果。免疫層析試紙的檢測原理主要有兩種：夾心法和競爭法。利用夾心法檢測時，膠體金標記的抗體或抗原與相應的被檢測物（analyte）結合后，可以被檢測線上的另外一株抗體攔截顯色，同時多余的金標抗體或金標抗原被質控線上的抗體攔截顯色。若樣品中不含被檢測物，則不能與金標抗體或金標抗原結合，不被檢測線攔截顯色，而質控線上的抗體則與金標抗體或抗原結合顯色。即陰性樣品僅有質控線顯色，檢測線不顯色；陽性樣品在檢測線和質控線同時顯色［2］。利用競爭法檢測時，當樣品中的被檢測物與金標抗體結合后，就能阻斷金標抗體與檢測線上的固化物（BSA-analyte）結合，此時膠體金顆粒不在檢測線上聚集，也就不顯色，多余的金標抗體與質控線上的抗體結合，使金顆粒聚集顯色。而如果樣品中不含有被檢測物，那么也就不能阻斷金標抗體與檢測線上的固化物結合，此時檢測線上將發生膠體金的聚集顯色，同樣，質控線也因金顆粒的聚集而顯色；即檢測陰性樣品時，結果同時出現檢測線和質控線；檢測陽性樣品時，僅出現質控線，不出現檢測線，與夾心法的結果判定恰恰相反［3］。試紙檢測的樣品類型包括血液、尿液、乳液、口腔液等，可用于食品及水質安全檢測、環境監測、傳染病檢測及慢性非傳染性疾病檢測。

1 膠體金試紙檢測

傳統的即時檢測試紙主要以膠體金作為標記物，以檢測線和質控線的顯色情況及強度進行定性和半定量檢測，已在抗原檢測、抗體檢測和半抗原檢測領域發揮顯著作用。

1.1 抗原檢測 抗原檢測試紙的檢測靶標可以是微生物抗原，如病毒、細菌以及非微生物抗原，如自身抗原、腫瘤抗原等。常見的檢測模式有3種：①金標單抗，多抗攔截；②金標多抗，單抗攔截；③金標單抗，識別不同位點的單抗攔截。最早出現的抗原檢測試紙主要是針對人絨毛膜促性腺素（human chorionic gonadotropin，HCG）、A群鏈球菌及衣原體的檢測［4］。近年來，免疫層析試紙檢測技術被廣泛應用于傳染病病原體、腫瘤及心血管疾病檢測方面。Reid等制備了檢測口蹄疫病毒的層析試紙，可檢測7種血清型的口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease viruses，FMDV）［5］。Niu等制備了檢測食物中金黃色葡萄球菌的試紙，檢測限達103 CFU·mL-1，可快速評價食品及水質安全［6］。Gholamzad等分別利用雙抗體夾心法和競爭法建立了檢測金黃色葡萄球菌腸毒素B的膠體金檢測試紙，檢測限分別達到10 ng·mL-1和 25 ng· mL-1［7］。Ma等 制 備 了 用 于 檢 測HIV-1 p24抗原的膠體金試紙，檢測限達25 pg·mL-1，為HIV感染的早期診斷提供了高效便捷的方法［8］。Wu等利用雙抗體夾心法制備了檢測前列腺特異抗原（prostate-specific antigen，PSA）的膠體金試紙，可作為監測前列腺癌病情變化和療效觀察的有效工具［9］。

1.2 抗體檢測 抗體檢測試紙的檢測靶標一般為IgA、IgG及IgE等。常見的檢測模式有兩種：①金標抗原，二抗／SPA攔截；②金標 SPA或二抗，抗原攔截。Yang等利用金標蛋白抗原或多肽建立了檢測O型FMDV病毒抗體的膠體金試紙檢測方法，其中金標多肽檢測試紙可特異區分疫苗免疫抗體與野毒感染抗體［10-11］。Cheng等以金標二抗，抗原攔截的模式建立了檢測H5和H6亞型禽流感抗體的膠體金試紙診斷方法，與血凝抑制試驗符合率非常高［12］。Zhang等制備了檢測血清旋毛蟲抗體的膠體金試紙，利用結合哺乳動物IgG的SPA作為攔截線，可檢測人、寵物、動物血清旋毛蟲抗體［13］。Xiang等表達了丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）不同的蛋白抗原，以高免疫原性的蛋白抗原建立了雙抗原夾心膠體金試紙用于HCV抗體的檢測，為臨床監測HCV感染提供了簡便方法［14］。

1.3 半抗原檢測 半抗原檢測試紙的檢測靶標通常為抗生素、農藥、獸藥、生物毒素、激素等小分子物質。常見的檢測模式有兩種：①金標單抗，人工抗原攔截；②金標人工抗原，單抗攔截。利用競爭法原理，張改平等制備了檢測鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇等β-激動劑的膠體金試紙條，實現了對此類瘦肉精產品的定性及半定量檢測［15］。Li等建立了檢測苯乙醇胺A的膠體金快速檢測方法，因篩選的單抗具有高親和力，使得檢測限達 0.1 ng·mL-1［16］。Wang等建立了半定量檢測奶粉中大豆致敏蛋白glycinin和β-conglycinin的試紙檢測技術［17］。Hua等建立了檢測農產品中8種有機磷農藥的膠體金試紙檢測方法［18］。近來，用于細菌性疾病治療的抗生素殘留問題越來越受到重視，因此研究人員先后制備了檢測慶大霉素、四環素、氯霉素、氟苯尼考等抗生素的膠體金試紙［19-21］。谷物中極低濃度真菌毒素即可對人或動物機體產生毒害，Sun等制備了可同時檢測谷物中赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的膠體金免疫層析試紙［22］。

1.4 其他檢測 除對抗原、抗體及半抗原進行檢測外，免疫層析試紙在其他檢測領域，尤其是對金屬離子及核酸檢測方面也存在廣泛應用。Tang等以競爭法模式建立了檢測水中重金屬鉛的膠體金試紙檢測方法，檢測限達50 ng·mL-1，該法需要 TiO2對樣品中的鉛進行富集［23］。Liu等制備了檢測水樣及血液樣品中鉻離子Cr3+的膠體金試紙，檢測時需要通過預處理將樣品中Cr6+的還原為Cr3+，定性檢測限達50 ng·mL-1，定量檢測的線性范圍為 5～80 ng·mL-1［24］。核酸檢測包括 3個主要步驟：樣品制備（核酸提取與純化）、擴增（PCR／LAMP）及檢測（熒光信號、濁度），將其檢測步驟與免疫層析試紙結合可制備出核酸檢測試紙（nucleic acid lateral flow，NALF）［25］。核酸試紙檢測存在抗體依賴和抗體非依賴兩種模式。抗體依賴模式建立在夾心法基礎上，首先使用兩種小分子半抗原，硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）和生物素（Biotin）分別標記上下游擴增引物，再使用對應的抗體作為金標抗體及檢測線上的攔截抗體。抗體非依賴模式則利用金標寡核苷酸與檢測線上的寡核苷酸分別結合擴增片段的兩端，擴增產物僅需在室溫條件下與金標寡核苷酸進行3 min孵育雜交即可用于檢測［26］。Roskos等利用親和素標記納米微球，生物素和地高辛標記引物，抗地高辛抗體作為檢測線制備了檢測結核分枝桿菌基因組DNA的試紙，并且將63℃的LAMP擴增與試紙整合形成了可移動小型設備，為核酸即時檢測提供了更方便快速的方法［27］。

2 新型試紙檢測

現有的膠體金試紙檢測存在兩個局限：一是定量檢測受限；二是敏感性稍低。克服兩個局限的方法有：①篩選利用高親和力的單抗；②利用更為敏感的納米材料作為標記物；③利用更為精密的試紙信號讀取儀；④利用新的顯色增強策略。新型試紙檢測技術主要針對傳統試紙的這兩種局限而不斷改良，向著多靶標、定量、高敏感性檢測方向發展。已用于提高試紙檢測敏感性的新材料有：磁顆粒、熒光微球、量子點、上轉換熒光粉、碳納米顆粒、銪納米顆粒等；此類免疫層析技術雖然需要使用配套的儀器對結果信號（磁信號、電化學信號、化學發光信號、熒光信號）進行讀取，但可在不影響特異性的前提下，顯著提升敏感性，而且可實現定量的檢測分析。試紙閱讀儀通過將檢測線和質控線的顏色強度轉變為光密度值實現定量分析。鑒于被分析物濃度、反應時間和溫度對結果的影響較大，故通常采用檢測線光密度與質控線光密度的比值進行定量判定［28］。Hou等使用智能手機作為試紙閱讀器實現了對HCG抗原和癌胚抗原的檢測，該模式既可以利用LED依據顏色變化判定結果，又可以利用UV-LED結合內置軟件進行定量分析［29］。

Zhao等利用紅外—可見光上轉換材料標記單抗，以競爭法模式制備了檢測作物中黃曲霉毒素AFB1的定量檢測試紙，檢測限（0.03 ng·mL-1）比常規膠體金試紙（0.25 ng·mL-1）低近 10倍［30］。Sakurai等利用熒光微球（fluorescent beads）標記單抗建立的試紙檢測方法可以對鼻拭子樣品對季節性流感進行快速分型并且可檢測大多數H5亞型的流感病毒，檢測敏感度較膠體金標記的試紙檢測方法提高 10～100倍［31-32］。

Taranova等利用多色（紅綠黃）量子點建立了檢測牛奶中氧氟沙星、氯霉素、鏈霉素三類抗生素的多聯試紙檢測方法（含3道 T線），既可以根據類似于交通信號燈一樣的顏色變化進行定性判定，又可以通過測量熒光強度實現定量檢測，三類抗生素檢測限分別達 0.3 ng·mL-1、0.12 ng·mL-1、0.2 ng·mL-1，比酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）敏感 80～200倍［33］。Wang等利用多色量子點標記不同單抗，噴附兩種單抗混合物作為T線，通過檢測量子點熒光強度建立了定量多聯檢測多種腫瘤標志物的試紙檢測方法，對甲種胎兒球蛋白和癌胚抗原的檢測限分別達到了3 ng·mL-1和2 ng·mL-1。作者提出將T線加寬并使用雙層結合墊（conjugate pad）可實現對3種及3種以上腫瘤標志物進行多聯定量檢測［34］。

Chen等利用超順磁性納米顆粒標記單抗，以雙抗體夾心法制備了檢測腫瘤標志物——糖類抗原72-4（carbohydrate antigen 72-4，CA 72-4）的磁性免疫層析試紙，既可以肉眼判定結果，也可以使用測定器（magnetic assay reader，MAR）檢測磁性強度進行定量分析，檢測限達 0.38 IU·mL-1［35］。Duan等利用Fe3O4磁納米顆粒代替膠體金制備了納米酶試紙條，應用于埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）GP蛋白的檢測，比常規試紙檢測敏感度提升100倍，對新布尼亞病毒的檢測敏感度與 ELISA相當［36］。該試紙既可以通過磁納米顆粒分離富集樣品，又可以利用磁納米顆粒的類過氧化物酶活性催化DAB、TMB、AEC等底物增強顯色。

Song等首先向細菌培養物中加入FITC，非特異性地標記O157型大腸桿菌，再利用FITC標記的特異性抗體及T線上的特異性單抗建立了檢測大腸桿菌O157型的試紙檢測方法，使得檢測線出現了FITC的熒光信號增強效果，檢測敏感度比常規膠體金試紙高10倍，與 ELISA相當［37］。

Hwang等將拉曼訊號分子（Raman reporter）如Cy5修飾到中空的金納米顆粒表面再與單抗進行標記，制備了表面增強拉曼光譜標記偶聯物用于葡萄球菌腸毒素 B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）的檢測，檢測限低達0.001 ng·mL-1，比常規ELISA檢測方法低3個數量級［38］。SEB是一種熱穩定型腸毒素，劑量低于1 ng·mL-1即可造成中毒。使用小型輕便的拉曼光譜計進行閱讀，真正實現了既具高敏感性又能定量地檢測。Yao等則將熒光染料Cy5修飾的單抗用作檢測線，使用膠體金標記單抗檢測癌胚抗原，檢測結果既可通過顏色變化進行定性判定，又可通過檢測Cy5熒光的淬滅進行定量分析。該方法與以往嘗試給單抗負載更多的Cy5以提高試紙檢測敏感性的方式不同，它利用的是膠體金納米顆粒的熒光淬滅能力，與傳統試紙檢測方式相比，該法可將檢測敏感度提高2個數量級［39］。

Han等制備了可定性及半定量檢測動物體液（血液、尿液、乳液）中存在的三類（β-激動劑、磺胺類、四環素類）26種藥物的膠體金多聯檢測試紙（含3道T線）。他采用凍干的金標單抗而非直接噴附在膠金墊上的模式，這使得金標單抗與樣品中的被分析物有充分的結合時間，從而也使檢測敏感度提高了 10倍［40］。

Kuang等制備了用于檢測飲用水中重金屬鉛的顯色增強型的免疫層析試紙，比常規競爭法檢測試紙敏感度提升 4倍，檢測限達 0.19 ng·mL-1［41］。該檢測方法不需要采用TiO2對樣品中的鉛進行富集，采用較大金納米顆粒標記山羊抗小鼠抗體作為增強信號，以較小金納米顆粒標記OVA單抗及重金屬鉛單抗，較小的金納米顆粒流動較快，當其被檢測線捕獲后，會出現顯色，當較大的金標山羊抗小鼠抗體流動到檢測線時會與已結合的金標單抗反應，從而實現信號增強。

Wang等將拉曼訊號分子異硫氰基—孔雀石綠修飾到中空的金納米顆粒表面，金標特異性的核酸探針，以生物素標記的引物進行核酸擴增，鏈霉素標記的特異寡核苷酸作為檢測線，建立了檢測Kaposi肉瘤相關皰疹病毒DNA和桿菌性血管瘤病DNA的多聯試紙，檢測敏感度比利用金納米顆粒及銀納米顆粒建立的多聯檢測試紙高1萬倍［42］。

鑒于腫瘤特異性標志物的缺乏，Warren分別利用血漿凝血酶和間質金屬蛋白酶多肽底物將PEG包裹的氧化鐵納米顆粒與生物素標記的熒光素進行連接，通過靜脈注射進入小鼠體內，30 min后收集尿液，利用免疫層析試紙進行檢測，最低檢測限低于1 nM，實現了對血栓塞及直腸癌的篩查［43］。

3 結語

免疫層析試紙檢測具有輕簡、快速、特異、敏感等特點，非常適用于現場檢測和即時檢測，已在抗原、抗體及半抗原檢測領域取得顯著成績。未來試紙檢測技術的發展要在保證傳統優勢的基礎上，利用新材料、新的設計策略向更高敏感性、定量、多聯檢測方向發展，試紙的數字化檢測可以在互聯網+時代背景下對大規模群體實施檢測，獲取大數據，用于建立預警評價信息平臺。

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Research Advance of Immunochromatographic Strip Test

WANG Yin-biao1，2，LIU Xiao2，LI Qing-mei2，GUO Jun-qing2
（1.School of Public Health，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China；2.Henan Academy of Agricultural Sciences，Henan Provincial Key Laboratory of Animal Immunology，Zhengzhou 450002，China）

R115；R446.6

A

1672-688X（2017）03-0236-05

10.15926／j.cnki.issn1672-688x.2017.03.022

國家重點研發計劃（2016YFD0500700）

2017-06-12

1.新鄉醫學院公共衛生學院，河南新鄉453003 2.河南省農業科學院，河南省動物免疫學重點實驗室，河南鄭州450002

王寅彪（1986—），男，河南新鄉人，博士，講師，從事衛生檢驗與檢疫工作。

郭軍慶，男，博士，研究員，E-mail：guojunqing2008＠gmail.com