硅藻量化研究的法醫學探討

劉泉，柯技，王樹法

1.湖北警官學院，湖北武漢 430034；2.湖北三真司法鑒定中心，湖北武漢 430034

硅藻量化研究的法醫學探討

劉泉1,2，柯技1,2，王樹法1,2

1.湖北警官學院，湖北武漢 430034；2.湖北三真司法鑒定中心，湖北武漢 430034

硅藻量化研究有助于提高硅藻判斷生前溺死的準確性。全文通過分析了幾種硅藻的常用檢驗方法、消化方式、富集方式的優缺點，探討了硅藻量化的最佳檢驗方法和步驟；同時，還探討了影響硅藻數量的環境因素問題，并針對這些問題提出了相應的解決對策，為硅藻量化研究檢驗條件的優化提出了自己的見解。

硅藻；量化；溺死；法醫學

硅藻是一種廣泛存在于各種水域中的單細胞生物，自1904年首次被人在溺死尸體肺組織內檢出后，逐漸成為溺死死亡診斷的重要手段[1]。有人通過實驗發現，非溺死者的內臟中也有硅藻，從而對硅藻診斷溺死提出異議[2]。但大量實驗表明，非溺死者與溺死者內臟硅藻數量存在顯著差異[3-4]，所以目前硅藻的檢驗仍不失為一種鑒別生前溺死與其它死因的有效手段。在實際工作中，依靠硅藻診斷生前溺死需結合案情及尸體檢驗情況，但水中尸體常常高度腐敗，這類案件又可能因種種原因無法得到有效的案情，這就導致需要單純依靠內臟里的硅藻來判斷是否為生前溺死。那么內臟中硅藻應達到多少量，才能區別生前溺死與死后拋尸呢？硅藻的量化研究就是為了解決這一難題。目前有關這方面的研究已成為熱點，筆者所在課題組在這方面也有了初步的實踐。該文將對硅藻量化中涉及的硅藻檢驗方法的選擇和硅藻量化影響因素等方面進行初步的探討，以期為硅藻量化研究的法醫學檢驗提出自己的建議。

1 硅藻的特點

硅藻無處不在，地球上凡是有水滯留的地方，幾乎都能見到硅藻的蹤跡。在顯微鏡下，硅藻是一種單細胞藻類，約有170個屬5 500個物種。根據硅藻的形態，可以分為中心目硅藻和羽紋目硅藻。中心目硅藻大多分布于海洋中，殼面紋飾主要呈輻射狀排列；羽紋目硅藻大多數分布于淡水中，殼面紋飾主要呈左右對稱排列。硅藻體積非常小，直徑約從1～200 μm，因此部分硅藻可隨溺液進入體內，分布到全身各個器官。硅藻的結構具有特征性，除了少數的種類外，硅藻的細胞結構有兩大特點，一個是細胞壁由兩個似培養皿的半壁套合而成；另一個是細胞壁的成分高度硅質化，并形成有物種特征性的各種紋路[5]。硅藻細胞壁的主要成分是果膠質和硅質，果膠質位于內層，硅質位于外層。它的細胞壁硅質成分與法醫息息相關，由于其主要是SiO2，不易受到外界因素的影響而破壞，因此可以在尸體中長期保存。這些特征使得硅藻對于晚期尸體生前溺水的診斷具有重要意義。

2 硅藻量化檢驗方法類別的選擇

目前，用于硅藻檢驗的方法很多，這些檢驗方法綜合起來大致分為3類：通過形態特征來識別硅藻的檢驗方法；通過特征性DNA片段來識別硅藻的檢驗方法；通過化學成分來識別硅藻的檢驗方法。這些方法都可以對硅藻進行定性檢測，準確性已被大家公認。但要做硅藻的量化的檢驗，不僅要識別硅藻，還要能計數，即需要對檢出的硅藻進行適度的定量，那么以上的方法就不全適用了。計數方式可以有相對計數或絕對計數。相對計數是指通過實際檢測結果與理論值按百分比做的結果。在硅藻檢驗中，相對計數是實驗人員通過將檢測到硅藻的某個值與一個基本值作百分比而得出的結果。觀察形態來計個數、測DNA的含量和測化學成分的含量等檢驗方法在理論上均可采用相對計數法。但實際操作中實施起來卻有很多問題。首先，各種方法的基本值（即死后拋尸的人體內硅藻含量）是很難確定的。有些也許有少量生前吸入的硅藻，但更多的是沒有硅藻。當基本值為0時，無法百分比化。其次，測DNA含量或化學成分的含量受很多實驗操作方面的影響，比如PCR的內環境，循環次數等，這樣就會造成同一樣品多次檢測結果之間存在差異的情況，穩定性較差。絕對計數是指按照實際看到的結果來計數。在硅藻檢驗中，絕對計數是指實驗人員看到了多少個硅藻就是多少個，這種方式簡單易行，但只適用于通過硅藻形態特征來識別的檢驗方法。通過DNA片段或化學成分來識別的檢驗方法，是間接識別，不能看到硅藻的形態，只能通過設備上的數字來分析讀取，因此無法使用絕對計數法。另外，直接識別硅藻形態進行計數還可以方便的對不同類型的硅藻進行分類，有助于落水地點的判斷。因此，通過硅藻形態特征來識別的檢驗方法更適合用于硅藻量化研究的檢驗，它能對看到的硅藻直接計數，有助于硅藻量化研究的開展。

3 通過形態特征識別硅藻的檢驗方法有關步驟的選擇

3.1 幾種消化方式的比較

通過形態特征來識別硅藻的第一步是將硅藻從內臟中提取出來。通常采取的方法是將可能存有硅藻的器官組織破壞，富集其中的硅藻。目前常用的方法有以下幾種：強酸消化法、酶消化法、物理消化法和多方法聯用。強酸消化法是指使用濃酸破除有機質，從而保留硅藻形態的消化方法。該方法有成本低、消化時間短、消化完全、便于開展等優點，目前為基層普遍采取的一種方式。盡管傳統認為由于硅藻細胞壁有硅質，能抵御強酸的腐蝕，但在實踐中有人發現通過強酸消化最后檢測到的多是一些耐酸性的無機硅藻，而其他類型硅藻則被破壞[6]。為了提高檢出率，有些法醫工作者對基于強酸消化的方法進行了改良，主要通過減少強酸的用量和消化時間，增加其它類型的消化方式，以此來保留對酸較敏感的硅藻類型。但其依然有使用局限性：①使用酸，依然會破壞部分硅藻；②強酸在消化中可能會噴出，同時還會產生污染氣體，對人和環境造成損害；③操作繁瑣，容易污染，產生假陽性。酶消化法是指使用蛋白酶對組織進行消化。目前常用的蛋白酶有蛋白酶K和胰蛋白酶等。有實驗顯示蛋白酶K消化后能顯示出絕大多數的硅藻，且硅藻結構幾乎都被保持。梁新華等[7]發現通過胰蛋白酶消化后，硅藻檢出率大于強酸消化法。從現有報道可以看出，蛋白酶消化法對硅藻的檢出率優于強酸消化法，且操作簡便，更加安全。但蛋白酶消化法也有缺點，如成本相對較高、消化組織時間相對較長。物理消化法主要有高溫灰化法和浸漬法。高溫灰化法是將組織用特殊的東西加熱直至呈灰，然后再用強酸消解后過濾鏡檢。它的主要優點是操作簡單、干擾少。但該方法過程繁瑣，灰化過程需要特殊設備，灰化溫度和時間較難控制，如操作不當易造成大量硅藻被破壞，檢出率低。浸漬法是將組織用蒸餾水浸漬過夜，或用硝酸鈉處理后在37℃溫箱中浸漬24 h左右，然后取浸漬液離心鏡檢。此法基本是所有檢測方法里最簡單易行的，但檢出率卻不高。每一種消化方式都有各自的優缺點，如果結合各自的特點，將不同類型的消化方式聯合起來使用，就可以提高硅藻的檢出率。如使用濃硝酸消解檢材組織時，同時還在密閉的空間內用微波對組織加熱加壓，檢驗效果較好。整個過程有用酸量少，時間短，硅藻種類、數量和完整性均保存較好的特點。強酸消化法除了可以與物理消化法聯用，還可以與酶消化法聯用。Kakizaki等[8]應用蛋白酶K和鹽酸共同消解組織，發現這種方法組織需要量較傳統方法少，時間較單純蛋白酶消化法短，硅藻破壞較少，對環境污染更小。硅藻量化研究需要的消化方式能盡量完整的保存硅藻，這樣計算出來的硅藻數量才能更接近實際情況。從現有消化方式來看，酸消化法和物理消化法會對硅藻的破壞或損耗較大，而其他方式相對來說更利于硅藻數量和結構的保存，更適用于硅藻量化的研究。

3.2 幾種富集方式的比較

通過各種方式將可能含有硅藻的組織消化后，通常會使用普通離心機離心消化液的方式來使硅藻富集于沉淀中，便于鋪片鏡檢。王會品等[9]研究發現4 000 r/min離心15 min一次硅藻損失在29.94%～49.60%之間，大量的硅藻存在于被棄去的上清液中，而很多消化法為了清洗消化液離心次數往往不止一次，造成硅藻檢出率進一步下降。廣州市刑事科學技術研究所通過研究發現傳統離心方法被棄去的上清中硅藻的最長徑＜40 um的硅藻占被棄硅藻的90.00%以上，而進入體循環的硅藻多是小體積硅藻，如進入腦和骨髓中的硅藻大多直徑在10 μm以下，因此離心富集硅藻對體內硅藻檢驗極其不利。王玉仲等人[10]用濾膜孔徑為0.45 μm的濾膜對微波消解消化過的硅藻進行富集，然后檢驗，發現硅藻檢出率顯著優于傳統強酸檢測方法。從王玉仲等人使用濾膜的指標來看，我們可以推測這種濾膜富集法可以富集大多數長徑在40 μm以下的硅藻，富集率應該優于傳統離心方法。

4 影響硅藻量化的因素

影響硅藻量化的因素除了消化、富集的方法以外，主要還有取材及環境因素。目前，硅藻檢驗取材有相應的標準參考，因此在這里，主要討論環境因素對硅藻量化檢驗的影響，它會直接影響到硅藻量化的結果與結果的判定。

4.1 環境因素對硅藻數量與種類的影響

4.1.1 光照 硅藻同一般藻類一樣，需要依靠光能進行光合作用產生自身所需的有機物。光線的強度和光周期的變化會直接影響硅藻的生存和生長。一般來說，在其它條件適宜的情況下，適宜的光照強度會使得適合該光照強度的硅藻生長最快。例如尖刺擬菱形藻在光照度在7 000 lx時生長速率達到最大，而東方彎桿藻和月形藻適宜的光照度在500～1 500 lx的范圍。有的硅藻適宜的光照強度不是一定的，它會隨著溫度的變化而變化，如中肋骨條藻，在溫度較低時低光照強度繁殖最快，而溫度較高時，高光照強度比低光照強度繁殖的速度更快。光周期是指光照與非光照相互相互變化的規律。它會影響細胞內有機物的合成和代謝及細胞分裂模式。

4.1.2 溫度 硅藻生長需要一個適宜的溫度，在適宜溫度范圍內硅藻生長速度最快，超過或低于這個溫度，硅藻都無法正常生長。絕大多數硅藻適宜溫度范圍在15～30℃，硅藻水華暴發時水體表面大都在20～30℃間[11]。在適宜溫度范圍內，溫度越高，硅藻生長速率越快。超過一定溫度后，硅藻的蛋白質和核酸會受到不可逆的影響，從而生長速率急劇下降。當低于一定溫度時，硅藻的新陳代謝會受到抑制，生長速度變慢，但不一定死亡，可能存在“冬眠”狀況，等待溫度合適繼續生長。

4.1.3 水體的流動或攪動 空氣中的CO2會隨著水體的流動或攪動進入到水體中，為硅藻提供光合作用必需的物質——CO2。一般來講，水體的流動或攪動越大，二氧化碳含量越多，越有利于硅藻的生長。同時，水體的運動也可帶走硅藻的代謝產物，使得硅藻周圍的水體維持在一個適宜的水平。另外，水體的流動或攪動可能會把位于水體下層的硅藻移動到中上層中，從而使硅藻多樣性指數上升。在泥沙較多的水域，水體的流動或攪動會使泥沙含量升高，水體透明度降低，降低光進入水中的強度，從而影響硅藻的生長。

4.1.4 其他 水中pH值、鹽度和污染情況[12]也都會不同程度的影響到不同種類硅藻的生長與繁殖。

4.2 環境因素對硅藻量化影響的對策

由于以上環境變化因素的存在，法醫檢案提取檢材時，如果只提取發現可疑溺水者水域局部范圍的水，可能會造成檢測出水樣中硅藻的種類和數量與溺死者臟器中不一致的情況。建議提取水樣前，應綜合分析溺死者水域的情況，合理布局，有針對性的提取和分析，這樣才能保證判斷的準確性。同時，鑒定人員還應該結合尸檢的情況，將死后經過時間考慮在內。如果存在季節交替或溫度驟變的情況，可能會導致溺死者溺水當時水域與檢查時水域中硅藻的種類和數目的差異。

因此要充分考慮以上情況，綜合判斷，才能在實際檢案中得出更加準確的判斷，同時才有利于減少硅藻量化過程中的偏差。

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Study on Forensic Medicine of Quantitative Study of Diatom

LIU Quan1,2,KE Ji1,2,WANG Shu-fa1,2
1.Hubei University of Police,Wuhan,Hubei Province,430034 China；2.Hubei Sanzhen judicial expertise center,Wuhan,Hubei Province,430034 China

The quantitative study of diatom contributes to improving the judgment accuracy of drowning before one’s death,and the paper discusses the best test method and procedure of diatom quantitative study by analyzing the common test method,digestive method and advantages and disadvantages of concentration method of some diatoms,at the same time,the paper studies the environment factor issues of influencing the number of diatoms,and puts forwards the corresponding solutions according to these issues and puts forwards their own opinions of optimization of quantitative research test conditions of diatoms.

Diatom;Quantitative;Drowning;Forensic medicine

R4

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.01.30

2017-01-03；

2017-01-22

湖北省教育廳科學研究計劃項目指導項目（項目編號：B2014013）。

劉泉（1982.9-），女，湖北天門人，博士，講師，研究方向：法醫學。