哺乳動物克隆技術研究進展

張榮華，王 曦，李武峰

（1.山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801；2.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西太原030032）

哺乳動物克隆技術研究進展

張榮華1，2，王 曦2，李武峰1

（1.山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801；2.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西太原030032）

自首例克隆羊“多莉”誕生以來，哺乳動物克隆技術研究就廣受關注，應用此技術已獲得了小鼠、水牛以及家兔等動物。總結了近年來克隆過程中的關鍵技術和獲得的研究成果，不僅更進一步了解了胚胎發育、細胞生長等生物現象，同時也為將來解決克隆中存在的問題，如成功率低、胎盤肥大、重編程異常、出生死亡率高等奠定了理論基礎，開拓了新的思路。隨著哺乳動物克隆技術的迅速發展，其在多個領域應用前景廣闊，如利用克隆技術進行快速大規模的品種改良、有效地保護瀕危動植物，并可將核移植技術應用于疾病的治療，通過克隆生物反應器生產所需的物質，具有重要的實踐意義。

哺乳動物；克隆技術；胚胎重組

希臘語“klon”就是克隆，指用小枝丫去增殖，開始于植物學[1]。動物克隆廣義上講是指動物的無性繁殖，18世紀興起了微生物學，科學家們觀察到低等動物一般通過分裂、出芽和斷裂3種方式進行繁殖，這些都是“克隆”——無性繁殖[2]。目前人們研究的克隆是人為干預的無性繁殖。此技術發展至今，可用胚胎細胞或體細胞進行克隆而獲得個體。具體的克隆大致可分為細胞核移植[3]和胚胎分割[4]2種。通常人們所謂的哺乳動物克隆是指前一種，并且也獲得了很多克隆動物。

克隆試驗的成功無論是在理論還是應用方面都具有重大意義。理論上，它打破了傳統思維，即動物細胞的生長、分化是不可逆的。證實了已分化的體細胞核與受精卵相似，在適當的條件下，可以恢復其全能性，發育成為新的個體。同時，此理論為遺傳學、基因表達調控等方面提供了新的思路。應用上，克隆技術可以加快優良家畜品種的繁殖。自然繁殖時，優良家畜都是經過多次雜交、基因重組產生的。此過程耗時長，成本高，工作量大，而且因基因突變導致優良性狀消失的概率大。而利用體細胞克隆技術則可解決以上問題。此外，克隆技術可以用于保護瀕危動物，通過構建基因庫，利用克隆擴大動物的群體。在醫學研究方面，利用克隆技術培育器官，避免了排異性，提高了安全性且可以保證大量供應。

本文介紹了目前克隆技術各過程的主要方法與存在的問題，并指出進一步的研究方向。

1 哺乳動物克隆研究進展

1.1 哺乳動物胚胎克隆

胚胎克隆即采用專門的方法和技術建立胚胎的無性繁殖系，以獲得具遺傳同質性動物（克隆動物）的過程。胚胎克隆從廣義來講，可分為胚胎分割以及細胞核移植，狹義的即胚胎細胞核移植技術。該技術是將早期胚胎細胞的細胞核或卵裂球，通過融合、激活和體外培養等方法，移植到去核卵母細胞中，構成新合子，然后移植給受體。此生物技術所獲得的后代將與核供體基因型相同[5]。提出胚胎克隆的理論基礎是胚胎細胞與受精卵一樣，都具有發育全能性。但因為早期試驗條件有限，且哺乳動物的受精過程在體內發生，所以，首次胚胎細胞核移植成功是在1952年BRIGGS等[6]研究的兩棲類動物——美洲豹蛙。隨后體外受精兔也獲得成功，為哺乳動物胚胎細胞核移植技術奠定了基礎。

1.2 哺乳動物胚胎干細胞的核移植技術

胚胎干細胞是一種可分化成多種功能型細胞的細胞類型[7]。目前，從組織中已分離出了胚胎干細胞（ES）和成體干細胞。其中，胚胎干細胞是從早期胚胎中分離出的高度未分化、具有發育全能性和多能性的一類細胞[8]。ES細胞的多能性是指它具有發育成為不止一種細胞或組織的能力。ES細胞的全能性概念是它可以在某條件下去分化，再生為機體內的各組織甚至可發育成完整個體的能力[9]。

根據以上的理論基礎，動物克隆的方法之一就是胚胎干細胞核移植技術[10]。研究者們用ICM細胞為供體構成克隆胚，發育成正常仔鼠。CAMPBELL等[11]將ES細胞傳至3代后進行核移植，也獲得4只綿羊。另外，此方法在兔、山羊和牛等動物上都取得了進展，但此技術仍不成熟，尚待進一步研究[12]。

1.3 哺乳動物體細胞的核移植技術

體細胞核移植技術（SCNT）是將一個動物的體細胞核移植入去核的卵母細胞中，重構克隆胚，發育為與供體動物細胞基因完全相同的后代[13]。

早期人們認為，細胞的分化程度越高，其全能性越差，甚至已高度分化的體細胞則完全喪失全能性。因此，人們的研究集中在胚胎干細胞上。直到BRINSTER[14]研究發現，體細胞可脫分化抑制重新發育分化，打破了以往的觀念。而體細胞的核移植研究技術是在1997年WILMUT等[15]宣布世界首例體細胞克隆綿羊“多莉”誕生，才變成焦點。應用此技術已成功獲得了大鼠、兔、騾子、馬、水牛、歐洲盤羊[16]和非洲野貓等動物。同時，此技術還可保護珍稀的瀕臨滅絕的動物，例如雪貂[17]。

SCNT技術的應用領域十分廣泛，如加速繁殖優良畜種，培育轉基因品種[18]，利用克隆技術治療疾病[19]，保護瀕危物種等。但總的來說效率很低。KISHIGAMI等[20]研究指出，利用SCNT技術克隆出的動物常有異常，如胎盤肥大、胎兒患呼吸疾病等問題，且克隆動物成活率僅為2%。現在許多學者正努力探究著影響體細胞克隆成功率的因素，如核供體、核受體、供受體間的相互作用及核移植操作技術等。

2 核移植的受體細胞選擇與去核

2.1 核移植受體細胞的選擇

克隆技術的第一步就是選擇受體細胞。早期人們使用去核受精卵，但因為受精卵已被激活，重編程能力差，所以，越來越多的試驗使用MⅡ期成熟卵母細胞為受體。這是因為MⅡ期的卵母細胞周期長，并且去分化的必備因子——MPF活性高，對供體細胞核的重新編程更有利[21]。

WILLADSEN[22]第1次用去核的成熟卵母細胞作受體，獲得了克隆綿羊。之后CHESNé等[23]先將卵母細胞注射HCG，再培養16 h用作受體，囊胚率為47%，并得到了胚胎克隆兔。陳大元等[24]將卵母細胞培養大約19 h，選擇第一極體剛形成的做胞質受體，囊胚率約26.63%，并獲得克隆牛。

同樣，MⅡ期卵母細胞做核受體前，進行激活或未激活的結果也大不相同。研究證明，在激活后的卵母細胞中，成熟促進因子濃度降低，不足以支持重構胚的發育。所以，大多采用未激活的MⅡ期卵母細胞作為核受體。

許多試驗發現，體內、外成熟的卵母細胞也有差異。當卵母細胞體外培養技術成熟時，用此細胞做核受體，克隆成功率大大提高。如牛、豬、羊等的卵母細胞體外培養技術較成熟，所以，成功克隆的案例較多。但很多物種的體外培養技術還不夠完善，需進一步研究。

2.2 核移植受體細胞的去核

受體細胞的去核技術對核移植至關重要，主要有以下幾種去核方法。

2.2.1 盲吸去核法 此方法是除去第一次減數分裂后卵母細胞形成的紡錘體。此時紡錘體在第一極體下方，除去第一極體以及下方約1/4的胞質，以達到去核的目的。但目前只有鼠卵母細胞可以觀察到紡錘體，因此，稱為盲吸法[25]。此方法可以避免熒光染料和紫外照射對卵母細胞不利的影響。但后續研究發現，兔的紡錘體不一定在第一極體下方，可能位于對面，造成盲吸法的效率降低。所以，人們逐漸放棄使用盲吸法去核。

2.2.2 半卵去核法 其是先在極體上部做切口，再從切口處吸出第一極體及1/2的胞質，最后熒光染料Hoechst33342確認。但由于卵母細胞胞質減少而且熒光染料對核受體有不利影響[26]，所以，該去核法使用很少。

2.2.3 切割去核法 它是對半卵去核法的改進。具體方法：沿極體與卵母細胞相交處，將卵母細胞平分，將無極體附著的半卵作為核移植受體細胞[27]。此方法操作的基礎是卵母細胞與第一極體黏著在一起，并無透明帶，卵母細胞要用植物凝集素（PHA）和鏈霉蛋白酶預處理。此方法的優點是去核率高，甚至可達90%，沒有熒光染料和紫外照射的影響[28]。最具有商業意義的是該法在體視顯微鏡下就可完成。

2.2.4 高速離心去核法 此方法的原理是卵母細胞的細胞核、質與極體的質量不同，不同轉速可使細胞核與極體一同離心排出。具體過程：將卵母細胞用含有細胞松弛素B的培養液培養，梯度離心后取約1/3的部分作為核受體胞質。它的優點是可一次性處理大量核受體，但還未得到克隆后代，有待進一步驗證。

2.2.5 化學誘導去核 該方法可一次性制備大量的卵母細胞，并對操作的技能要求較低，造成的機械性傷害小[29]。方法是先將MⅡ期卵母細胞激活，再在成熟液中添加抑制劑脫羰秋水仙堿，使其排放第二極體。此化學物質使核染色質進入第二極體，從而去核。但大量的試驗表明，此方法去核率僅為54%，除了小鼠和豬外，未獲得其他克隆動物。

此外，還有功能性去核法，它利用的是紫外線或激光照射使核變性，從而達到去核目的[30]；擠壓法是指在卵母細胞發育的過程中，當多數的卵母細胞準備排出第一極體時，破壞透明帶并擠壓，使極體與尚未分離的核一同排出。

同時，為了能夠精確去核，利用卵母細胞MⅡ期染色體是由紡錘體連接在赤道板上的原理[31]，通過尋找紡錘體定位染色體。所以，研究者發現了幾種示核法。熒光染料法是使用熒光染料Hoechst 33342處理卵母細胞后，可通過紫外線觀察到極體與卵母細胞中期板的相對位置，從而協助去核成功。但染料和紫外線都會對卵母細胞有一定的不利影響，從而妨礙胚胎發育成熟。極化顯微鏡法是利用構成紡錘體的蛋白有極性的特點，設計了極化顯微鏡，可在普通光路下觀察到極體和中期板。由于它破壞性小，很多核移植試驗采用此方法。

3 核移植供體細胞的選擇與分離

3.1 哺乳動物核移植中供體細胞的選擇

大量研究表明，不同的供體細胞類型適用于不同的物種。供體細胞大致分為胚胎分裂球、胚胎干細胞（ES）和體細胞。首例克隆成體的綿羊多莉，使用的供體細胞是乳腺上皮細胞。另外，皮膚成纖維細胞、巨噬細胞、間質細胞和一些器官細胞等體細胞都已被證實可用做核供體細胞。相同的試驗條件下，成體干細胞作為供體的胚胎發育率比分化完全的體細胞高5～10倍，說明外遺傳修飾作用會促使分化成各種表型細胞，影響克隆的成功率。

供體細胞的發育周期也是重要因素，不同時期，核內的DNA含量不同，使得核移植效率也大不同。WILMUT等[15]研究認為，血清饑餓法誘導細胞進入并停留在G0期，才能得到克隆羊多莉。但KUES用0.2%的血清對豬胎兒成纖維細胞饑餓處理5 d后，細胞凋亡率約為40%[32]。LAI用秋水仙素處理供體細胞，發現重組胚中排出極體的細胞大多來自G2/M期，少數來自G0/G1期。隨后愈來愈多的研究者認為，G0/G1期的細胞并不是克隆成功的必備條件[33]。

有研究表明，細胞培養的傳代數也影響著克隆結果。ROH等[34]發現，早期細胞（8～16代）比晚期細胞（17～32代）有利于克隆，因為培養時間越長，供體細胞內染色體的畸形率越高。而CAPECCHI則認為，長時間的傳代培養可以增加細胞數量，并且減少以后發生基因修飾的機會，利于核移植[33]。后來經大量試驗證實，10代左右最好，盡量少于15代。

除了以上的因素，供體細胞仍有許多因素影響著克隆效率，如動物年齡等。

3.2 核移植中供體細胞的分離

將合適的供體細胞分離成單個細胞是制備供體細胞的過程之一。胚胎未發生致密化時，去除透明帶后進行吹打，即可得到分散的卵裂球。隨后發現用不含Ca2+，Mg2+的培養液短時間處理供核細胞，或用胰蛋白酶消化、免疫外科、顯微外科等方法也可分離供體細胞。但當胚胎細胞連接變緊密，形成橋粒，發生了致密化緊縮后，就無法用常規方法分離，增加了很大的難度。

4 核移植與激活

4.1 核移植的方法

4.1.1 細胞融合法 誘導融合最早使用的是滅活后的仙臺病毒，但其毒性大，融合率不穩定。后來研究者使用毒性相對較小的聚乙烯乙二醇（PEG）融合，但融合效率低，無法推廣。直到WILLADSEN[22]利用直流電誘導細胞融合，此方法效率高，更安全穩定，被廣泛使用。

4.1.2 細胞注入法 此方法是第一次成功克隆哺乳動物采用的胚胎重建法。但由于對受體細胞損傷太大，進行了改良。改進后先用細玻璃針把供體細胞的細胞膜弄破，將供體核注入到受體細胞內。而且發現將供體細胞注入受體細胞內再將核吸出，更利于重建后的發育。目前，最先進的胞質內注射儀器是Piezo，可以很大程度上減小傷害[35]。

除了以上2種主要的核移植方法，利用激活抑制劑（MG132）、四倍體囊胚腔、去除透明帶等方法都成功進行了核移植。

4.2 克隆胚胎的激活

激活是使克隆胚胎進一步發育的必經過程，原因是未激活的卵母細胞中成熟促進因子（MPF）濃度較高，導致它停留在MⅡ期階段[36]。在受精過程中，精子的進入導致卵母細胞中Ca2+周期性波動，當Ca2+濃度升高時伴隨MPF濃度降低。基于此，研究者們發現了2條激活思路分別為產生Ca2+波動和降低MPF的水平。

激活方法分為物理激活和化學激活。物理激活又包括機械法、溫度變化刺激和電激活等。很多細胞通過機械刺激得到激活，如豬、牛等，但很少得到囊胚。溫度變化激活是指用溫度刺激卵母細胞，最早使用于兔的未受精卵，在10℃處理后發現其中的18%發育為囊胚[37]。需注意的是，溫度激活的時間不可過長，否則會影響細胞活性。電激活是利用直流高壓電脈沖，在細胞膜上造成可恢復微孔，使融合液中的Ca2+進入細胞內，升高其濃度。雖然電脈沖無法形成Ca2+濃度波動，只能瞬間性的升高，但少次的電脈沖就可激活大部分的卵母細胞[38]。電刺激的使用最為廣泛，1989年，ONODERA等[39]開始對兔卵母細胞使用，一直到現在，小鼠、牛、豬等卵母細胞都成功激活。

化學激活包括乙醇、Ca2+載體和IP3等。激活不同物種的卵母細胞可以用無特異性、不同濃度的乙醇介導。它的原理是在細胞膜上形成三磷酸肌醇（IP3），促使細胞內存儲的Ca2+釋放，引發濃度波動[40]。Ca2+載體是一類很有效的化學激活物。使用Ca2+載體——A23187激活小鼠卵母細胞，發現在無Ca2+的培養液中激活率比含Ca2+培養液中更高，說明Ca2+載體可增強胞質內存儲的Ca2+釋放，且抑制蛋白質合成[41]。IP3是另一種引發Ca2+波動的物質，與受精過程更相似。但IP3只能對卵母細胞激發，對原核期胚胎無作用，所以，需要與其他物質一同激活。

由于僅使用單一方法激活并不徹底，所以，多數試驗采用聯合方法。PARRISH等[42]用6-DMAP方法結合電脈沖對牛卵母細胞激活，使其發生有絲分裂。MITALIPOV等[43]用IP3和6-DMAP聯合方法激活兔卵母細胞，成功激活84%卵母細胞。大多數的融合-激活是先進行2次電脈沖后再使用化學試劑激活。

5 胚胎的體外培養及胚胎移植

核移植后進行科學的胚胎體外培養是提高克隆效率的重要步驟。目前的技術無法完全模擬胚胎在體內的發育環境[44]，但科學的體外培養條件也可以大大降低胚胎死亡率，提高穩定性。影響體外培養環境的因素很多，如培養環境的氣體濃度，低氧氣濃度可提高胚胎的發育能力。還有體外培養時間，試驗發現，豬和兔培養24 h后移植受體體內最佳，而牛、羊等家畜則所需時間更長[45]。影響因素中最重要的一個是培養液的選擇。目前體外培養液大約有3種，一是簡單型培養液，含有基礎培養液和牛血清白蛋白、胎牛血清；二是復雜培養液，在簡單型培養基中添加了維生素、嘌呤、TCM199等營養成分；三是共培養液，因為適量的體細胞可除去不利影響因子，所以，在簡單培養液中加部分飼養細胞，促進了胚胎發育。除了以上因素，胚胎質量、重構程序、受體供體發展階段等都是影響體外胚胎培養的因素。

體外培養后，通過手術移植或非手術移植將胚胎植入受體動物。

6 克隆技術存在的問題

6.1 成功率低

克隆成功率僅為1%～3%的原因有很多。一是妊娠早期易流產；二是胎盤發育異常；三是懷孕周期長、體質弱導致難產、出生后死亡率高。四是表觀修飾異常，導致基因重組排列，增加了胎兒發育異常或死亡[46]。

6.2 端粒酶活性問題

端粒對保護染色體至關重要，每次細胞復制，端粒核苷酸就會減少50～100 bp。而端粒的產生則需端粒酶，它決定著細胞的活性大小。SHIELS等[47]研究發現，造成克隆羊多莉壽命短的原因是它的端粒比同齡羊要短。但也有研究證明并非都如此，如克隆牛[48]。甚至克隆鼠的端粒比正常鼠的還要長，平均壽命也延長了7個月[49]。因此，研究者認為，動物的端粒酶活性應該是可控的。

另外，還存在供體與受體細胞發育周期不完全一致、線粒體來源不確定和基因印記擾亂等問題，有待于對細胞活動及相關技術深入研究。

7 克隆技術的發展前景

哺乳動物克隆不僅僅為生物學帶來了新的探究領域，更為醫學、畜牧業等提供了新的方法思路，應用前景十分廣闊。

在生物學領域上克隆涉及學科廣泛，如細胞學、胚胎發育學、分子生物學和遺傳修飾學等，可加深對細胞發育、全能多能性和核質相互關系等基本問題的認識。醫學家將克隆技術應用于治療，從病人體內取體細胞，植入去核的細胞中重建，最后分化成所需的類型用于治療，有助于人們探究腫瘤、細胞衰老等疾病。同時發現，轉基因生物反應器可以用于生產所需的藥物蛋白，并降低成本。還可以與生物反應器相結合，進行基因修飾后，利用膀胱、乳腺等動物器官生產所需的蛋白，提高轉基因技術的效能。在畜牧業方面，克隆技術可以快速的選育優良品種，并且大量擴增遺傳性狀優良的動物。克隆技術亦可促進瀕危物種的擴繁和保存，減少科學研究中所需試驗動物的數量，如歐洲盤羊。

8 結語

在哺乳動物克隆過程中，選擇科學合理的技術可以大大的提高成功率。但有些克隆步驟仍不夠完善，克隆結果存在一定的缺陷，如胎盤肥大、基因異常、生產率低等。隨著克隆技術的進一步發展，它的過程與機制會徹底清晰，更好的提高應用價值。

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Research Progress of Mammalian Cloning Technology

ZHANGRonghua1，2，WANGXi2，LIWufeng1

（1.College ofLife Science，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu 030801，China；2.Institute ofAnimalHusbandry and Veterinary，ShanxiAcademy ofAgriculturalSciences，Taiyuan 030032，China）

Since the birth ofthe firstcloned sheep"Dolly",mammalian cloning technology has attracted much attention.Using this technology,mouse,buffalo,rabbits and other animals had been obtained.In this paper,the key techniques and achievements ofcloning in recent years were summarized,which was not only to further understand the embryonic development,cell growth and other biological phenomena,for the future to solve the problems in cloning,such as low success rate,placentalhypertrophy,reprogramming abnormalities, high mortality and lay the theoreticalbasis,opened up new ideas.And with the rapid developmentof mammalian cloning technology,it had a good prospectin many fields.Such as the use ofcloning technology for rapid and large-scale varieties ofimproved,optimized and effective protection of endangered plants and animals,and nuclear transplantation technology for the treatment of diseases,cloning bioreactorproduction ofthe required material,has a very significantpracticalsignificance.

mammals;cloning techniques;embryo recombination

S811.4

：A

：1002-2481（2017）09-1577-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.09.42

2017-04-21

山西省農業科學院科技自主創新能力提升工程項目（2017zzcx-02）

張榮華（1992-），女，山西太原人，在讀碩士，研究方向：生物化學與分子生物學。李武峰為通信作者。