豬場大腸桿菌滅活苗的制備與免疫效果觀察

王富貴（山東省安丘市金冢子畜牧獸醫管理站 262100）

豬場大腸桿菌滅活苗的制備與免疫效果觀察

王富貴（山東省安丘市金冢子畜牧獸醫管理站 262100）

本研究從惠豐豬場發病仔豬中分離到致病性大腸桿菌，并對血清型菌株O64、O9、O149進行培養，經甲醛滅活，以鋁膠佐劑，制成滅活菌，經檢驗該疫苗合格，對同型菌的攻毒保護率80%。

大腸桿菌、仔豬、免疫

仔豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一組腸道傳染性疾病，常見的有仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病三種，以發生腸炎、腸毒血癥為特征，主要發生在0～70日齡的仔豬[1]。大腸桿菌屬于條件性致病菌，當環境因素惡劣或機體抵抗力下降時，容易引發該病發生，尤其是冬季，天氣寒冷，氣溫劇變，保溫不良，空氣流通不暢，更易引發此病，造成新生仔豬大批死亡或生長發育不良，嚴重影響養豬業的發展，給養豬戶造成巨大的損失[2]?；葚S豬場，母豬群5500頭，存欄量47000頭，品種為長白、大約克和杜洛克, 年產仔豬約120000頭。2015年該豬場豬群健康，年出欄量10萬頭，說明該豬場免疫程序在2015年前都對預防大腸桿菌病起到過一定的作用。2016年，該豬場突然暴發仔豬黃白痢病，主要表現為一窩仔豬出生時體況正常，于12h之后，突然有一兩頭表現全身衰竭，很快死亡。以后其他仔豬相繼發生腹瀉，糞便呈黃色漿狀，含有凝乳小片。有的轉為拉灰白色粘稠糞便為特征[3]，致使仔豬發育停滯、消瘦、抵抗力下降?；葚S豬場也曾用疫苗預防和藥物治療仔豬黃白痢，但效果不佳。為此，從該豬場分離篩選出致病性大腸桿菌株制成鋁膠苗用于該豬場后，仔豬黃白痢得到有效的控制。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）用滅菌棉簽從該場典型黃白痢病仔豬肛門拭取20個糞樣，置無菌試管中作為病料。（2）麥康凱和伊紅美藍瓊脂培養基(上海市醫學化驗所試劑廠)產品型號：20151224，20種大腸桿菌0抗原單價血清(中監所)，腸桿菌科生化編碼鑒定管，鋁膠佐劑(浙江省軍區后勤部衛生防疫檢疫所)產品型號：20160104。

1.2 試驗動物

15～18日齡小鼠20只，健康家兔10只(杭州市蕭山區獸醫衛生防疫站)，免疫與非免疫2日齡仔豬各15只，妊娠母豬90頭(惠豐豬場)均為3胎內的年輕母豬)。

1.3 純菌株的制備

取病料分別于麥康凱和伊紅美藍瓊脂平板劃線，經37℃培養18～24 h后，從麥康凱瓊脂平板上鉤取單個粉紅色、圓形、稍隆起、邊緣整齊、表面光滑的中等大小菌落或從伊紅美藍瓊脂上挑取紫黑色、帶金屬光澤閃亮的疑似菌落，涂片，革蘭氏染色，油鏡鏡檢。將檢出兩端鈍圓的G﹣短小桿菌再接種于麥康凱瓊脂培養基上培養，37℃培養18～24h，重復2～3次，確認無雜菌后后分別移至瓊脂斜面上，作為純菌種[4]。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 生化試驗 參考獸醫微生物學及免疫實驗指導的方法，將個菌株分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖等糖的發酵生化管中做糖發酵試驗；同時菌株分別做三糖鐵試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、吲哚試驗、V-P試驗、M．R．試驗、尿素酶試驗，設對照組并記錄結果。

1.4.2 致病性試驗 將生化鑒定后的菌株分別接種于普通肉湯，37℃培養18h后備用。取15～18g健康小鼠10只，分成兩組，試驗組和對照組個5只小鼠，試驗組每只小鼠腹腔注射0.2ml疑似分離菌株肉湯培養液，對照組不注射，兩組隔離飼養觀察，每6h觀察小鼠情況，選擇致病小鼠的大腸桿菌菌株為該場致病菌株[5]。

1.4.3 血清型鑒定 待檢菌株的處理：將純化的待檢菌液涂布于普通瓊脂平板上，于37℃恒溫箱中培養18h后，用適量5g?L石炭酸生理鹽水洗下菌苔，制成濃稠菌懸液；121℃高壓滅菌2h，破壞K抗原后即為待檢菌的O抗原，4℃保存備用[6]。血清學鑒定：按照鑒定血清說明書分別做玻板凝集和試管凝集實驗，鑒定惠豐豬場豬大腸桿菌致病菌株血清型。

1.5 大腸桿菌滅活苗的制備

1.5.1 擴菌培養 用接種環分別鉤取適量不同血清型的菌株，劃線于營養瓊脂平板表面，在37℃條件下培養24h后，以滅菌生理鹽水洗下制成懸濁液[7]；再取懸濁液均勻涂布于營養瓊脂平板表面，在37℃條件下培養24h，以滅菌生理鹽水洗下菌落。分別置于滅菌瓶中，用麥氏比濁管法測定其含菌數，使各血清型的菌液含菌數相等[8]。

1.5.2 滅活 將不同血清型的菌株培養液混合，以滅菌生理鹽水稀釋至含細菌總數為200億/ml。加入甲醛溶液使其在菌液中的最終濃度為0.5%，37℃滅活24～48h，其間振蕩數次。再加入等菌液體積20%滅菌氫氧化鋁膠，最后加入柳硫汞使最終濃度為0.01%，混勻、檢驗、分裝。

1.6 惠豐豬場大腸桿菌滅活苗的檢驗

1.6.1 性狀和無菌檢驗 肉眼直接觀察滅活苗性狀；混勻并取適量滅活苗，均勻涂布于麥康凱瓊脂平板上，37℃培養72h后觀察及顯微鏡檢查。

1.6.2 安全性檢查 取10只小白鼠，分別皮下注射菌苗0.5ml/只，連續觀察7d；取10只家兔，皮下注射滅活苗2ml/只，觀察7d，期間每4h測1次體溫；妊娠母豬10頭，產前15d，肌肉注射4ml/頭，連續觀察20d。

1.6.3 攻毒試驗 隨機選取免疫母豬和非免疫母豬所產2日齡仔豬各l5頭，分別用制苗細菌懸液，按100億/頭進行攻毒，觀察仔豬哺乳期內的生長情況，記錄仔豬發生黃白痢的頭數和死亡情況，測定其對仔豬的保護率。

1.7 滅活苗的應用試驗

1.7.1 試驗對象 惠豐豬場，選擇健康的妊娠母豬80頭，隨機分為4組。

1.7.2 免疫方法 第一組用本滅活苗免疫，妊娠母豬產前40d和15d分別肌肉注射，4ml/頭。第2組用本滅活苗免疫，妊娠母豬產前40d和15d分別肌肉注射，2ml/頭。第3組用市售大腸桿菌多價滅活苗進行免疫作對照。第4組不免疫作為對照。

1.7.3 效果判定 每天觀察試驗母豬所產仔豬，記錄哺乳期內仔豬黃白痢的發生情況和仔豬發育情況，綜合判定滅活苗的免疫效果。

2 結果

2.1 糖發酵與生化試驗結果

各菌均可發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖 甘露醇，產酸產氣；少數菌株發酵蔗糖，只產酸或產酸并產氣；M．R．試驗陽性；V-P試驗陰性；產生靛基質；尿素酶試驗陰性；硝酸鹽還原試驗陽性；吲哚試驗陽性；枸櫞酸鹽利用試驗陰性；三糖鐵斜面、底層產酸變黃，有氣體，無變黑現象。從惠豐豬場共分離到致病性大腸桿菌17株，用玻片凝集法進行血清型鑒定，結果為：O64(7株)，O9(4株)，0149(5株)，一株未知。

2.2 無菌檢驗

滅活苗靜置后分層，上層為澄清液體，下層為乳白色沉淀物，振搖混勻呈均一渾濁液；麥康凱培養基上無菌生長。

2.3 安全性檢查

試驗用的10只小白鼠、10只家兔觀察7d均無異常；產前15d妊娠母豬注射后部分母豬有一過性的厭食反應，注射部位輕微紅腫，無其他不良反應，胎兒、新生仔豬在哺乳期內均正常。

2.4 攻毒試驗

攻毒試驗結果見表1。

由表1可以看出攻毒后免疫組新生仔豬在哺乳期內發病3頭，其中2頭死亡，死亡率和致死率分別為13.35%、66.67%；攻毒后對照組新生仔豬在哺乳期內發病13頭，其中7頭死亡，死亡率和致死率分別為46.46%、61.62%。對比差異顯著，說明滅活苗對哺乳期內的新生仔豬具有較好的保護作用。

2.5 應用試驗

惠豐豬場大腸桿菌滅活苗在豬場免疫試驗結果見表2

表2說明4個組的臨床發病及死亡情況，2組全期發病率為15.42%，較1、4組分別下降了8.46%和24.09% ，經X2檢驗組間差異顯著(P<0.05)；2組全期死率為6.07%，較4組下降了10.51%，組間差異極顯著(P<0.01)，較一和3組分別下降了3.88%和1.55% ，組間差異顯著(P<0.05)，說明該滅活苗免疫效果良好。

3 討論

3.1 試驗結果分析

從應用試驗結果可以看出：用4ml/頭量本豬場大腸桿菌滅活苗時免疫效果較市售疫苗效果好，市售疫苗預防免疫接種效果較空白組也很明顯的，故單從實驗結果推斷此次仔豬大腸桿菌病的暴發并非市售疫苗的質量問題。其發病原因可有以下可能：（1）預防接種時，疫苗劑量達不到標準,造成母豬抗體水平不高致使仔豬所獲得的母源抗體水平也相對較低,不足以抵抗外界存在的病毒侵襲。（2）日常消毒工作不嚴格與外界環境隔離工作沒做好，導致發病。（3）母豬營養水平低，新生仔豬吃初乳太遲或食入量太少，導致體內抗體水平低導致發病。四是自然界中大腸桿菌血清型(O抗原型)多達數萬種，某一血清型的大腸桿菌的抗體對其相應血清型的大腸桿菌免疫效果最好，而對其它血清型的大腸桿菌免疫效果不一。

綜上所述，本次惠豐豬場仔豬大腸桿菌病的暴發原因是多方面的，只有更加嚴格的執行好各種疾病的免疫程序，做好各種衛生消毒及管理工作，減少環境誘因和應激反應才能有效的預防各種疾病，給豬場帶來更大的效益。

3.2 惠豐豬場發病的原因及補救措施

（1）仔豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一組腸道傳染性疾病，嚴重影響養豬業生產的健康發展，對規?；B豬業的危害尤為嚴重[9]。但大腸埃希氏菌易產生耐藥性，且常呈多重耐藥，藥物治療費用較高且效果不佳，應該預防為主。大腸埃希氏菌的血清型較多，現發現的致病性大腸埃希氏菌血清型數量近百余種，不同地區豬場的菌型不盡相同，不同血清型菌株的抗原種類不同。因此，不同血清型之間的交叉免疫能力較弱，使用普通疫苗，往往因菌型差異起不到有效的預防效果，免疫結果很不理想。因此，從特定豬場分離出的致病性大腸埃希氏菌優勢血清型菌株制成滅活苗，免疫該豬場妊娠母豬，可較好地預防仔豬黃白痢的發生，提高仔豬成活率，它克服了普通疫苗由于血清型差異而造成的免疫效果不佳[10]。（2）仔豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌感染所致，也與仔豬的抵抗力、環境及飼養管理密切相關。因此，除采用合適的疫苗及時進行免疫接種外，還應注意加強日常的衛生、飼養管理，減少環境誘因和應激反應；做好母豬產前補硒和仔豬產后補鐵與補硒工作；確保保育舍內一定的保溫和干燥效果；對已發病的豬應及時做好隔離消毒，及時治療，達到綜合防治的目的。

3.3 免疫接種的技術要求

（1）免疫接種前對使用的疫苗要逐瓶檢查，檢查瓶子有無破損，封口是否嚴密，瓶簽是否完整，有效期是否已過，有一項不合格均不能使用，做報廢處理。（2）接種疫苗必須由受過專業培訓的獸醫技術人員操作，按規程進行接種。（3）免疫接種用的器材(注射器、針頭、鑷子、稀釋液瓶等)要洗凈并煮沸消毒后方可使用。（4）稀釋后的疫苗溶液要固定一個注射針頭，避免反復吸取時污染疫苗，要求一豬更換一次針頭。（5）接種疫苗時應檢查和了解豬群的疫情，若有嚴重傳染性疾病流行時，則應停止接種，若是個別病豬，應剔除，隔離，然后接種健康豬。（6）免疫接種后，特別是在1h內，應由專人認真的檢查豬群中有無過敏或嚴重的應激反應，同時準備好腎上腺素等抗過敏藥品，便于及時搶救。（7）注射疫苗前后10d，不應飼喂含抗生素的飼料或注射抗菌藥物

4 結論

對從惠豐豬場發病仔豬分離到的致病性大腸桿菌血清型菌株O64、O9、O149進行培養，經甲醛滅活，以鋁膠為佐劑，制成惠豐豬場仔豬大腸桿菌滅活苗(含菌量為200億/m1)，該疫苗安全性檢驗合格，對同型菌株的攻毒保護率達80.00%，對仔豬黃白痢有較好的預防作用。

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