附子心臟毒效的多維評(píng)價(jià)和整合分析研究進(jìn)展

謝曉芳 彭 成

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,成都,611137)

附子心臟毒效的多維評(píng)價(jià)和整合分析研究進(jìn)展

謝曉芳 彭 成

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,成都,611137)

附子是著名的川產(chǎn)道地藥材,也是傳統(tǒng)確有療效有毒中藥,心臟是其重要毒效靶器官,但毒-效相關(guān)性不甚明確。本文在彭成教授提出的“中藥‘毒與效’的多維評(píng)價(jià)與整合分析”的研究思路指導(dǎo)下,緊密圍繞中藥“品質(zhì)制性效用”六大元素,以本團(tuán)隊(duì)多年的研究成果為基礎(chǔ),并廣泛整理國內(nèi)外相關(guān)研究成果,按附子的心臟“毒-效”物質(zhì)基礎(chǔ)-附子的心臟“毒-效”機(jī)制-附子對心臟的增效減毒原理3個(gè)層面綜述研究現(xiàn)狀,整合分析附子對心臟的毒效機(jī)制。結(jié)果顯示,附子中所含的雙酯型生物堿是附子致心臟毒性的主要物質(zhì)基礎(chǔ),而附子的強(qiáng)心和保護(hù)心肌作用是附子總堿、附子水溶性生物堿、附子多糖及其他一些成分等多成分綜合作用的結(jié)果;附子對心臟的毒機(jī)制和效機(jī)制在心肌細(xì)胞上存在相同靶點(diǎn),主要包括細(xì)胞形態(tài)和功能、細(xì)胞膜穩(wěn)定性、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)ATP酶和通道、細(xì)胞能量代謝;但又有各自的獨(dú)有機(jī)制;可通過依法炮制、合理配伍、辨證用藥、延長煎煮時(shí)間和控制劑量等多種手段控制附子的心臟毒性和發(fā)揮其強(qiáng)心、保護(hù)心肌作用。

附子;心臟;毒-效;整合分析

附子為毛茛科(Ranunculaceae)植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品,是著名的、療效確切的傳統(tǒng)有毒中藥,功效回陽救逆,溫陽通脈,散寒止痛,傳統(tǒng)廣泛用于治療心陽不足,胸痹心痛,如薏苡附子散;現(xiàn)代藥理研究表明附子具有明顯的強(qiáng)心和心肌保護(hù)作用,在現(xiàn)代臨床附子也是治療心力衰竭的常用藥物。可見,心臟是附子的重要藥效靶器官。而另一方面,傳統(tǒng)古籍多處記載附子毒性大,但其毒性表現(xiàn)不甚清楚;現(xiàn)代毒理研究發(fā)現(xiàn)附子可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心律失常,導(dǎo)致心肌纖維化和心肌細(xì)胞損傷,近現(xiàn)代臨床的附子致不良反應(yīng)事件中心律失常是其特征性的常見毒性表現(xiàn)。可見,心臟亦是附子的毒性靶器官。揭示附子心臟毒效機(jī)制對臨床安全、合理使用附子具有重要意義。本文將在彭成教授針對有毒中藥特點(diǎn)提出的“中藥‘毒與效’的多維評(píng)價(jià)與整合分析”的研究思路指導(dǎo)下,緊密圍繞中藥“品質(zhì)制性效用”六大元素,從附子的心臟“毒-效”物質(zhì)基礎(chǔ)-附子的心臟“毒-效”機(jī)制-附子對心臟的增效減毒原理3個(gè)層面綜述研究現(xiàn)狀,整合分析揭示附子對心臟的毒性和治療作用特點(diǎn)。

1 附子的心臟“毒-效”物質(zhì)基礎(chǔ)

現(xiàn)代化學(xué)研究表明,附子主要含有生物堿和多糖,此外還有黃酮、甾醇、微量元素等。近年來本研究團(tuán)隊(duì)首次從附子中分離得到吡嗪類和吡咯類成分[1-2]。現(xiàn)代藥理毒理研究顯示,附子不同提取物對心臟的毒或效作用不同,其中又以生物堿類研究最多。

1.1 附子所含雙酯型生物堿可導(dǎo)致心臟毒性,而水溶性生物堿具有強(qiáng)心作用 附子中的雙酯型生物堿為脂溶性生物堿,易溶于乙醇等有機(jī)溶劑,而難溶于水。為了解不同提取物的心臟毒性,本研究團(tuán)隊(duì)從附子不同炮制品(泥附子、黑順片、白附片)中均分別制備附子醇提物、附子水提物,進(jìn)行灌胃小鼠、大鼠的急性毒性試驗(yàn),結(jié)果顯示,3個(gè)醇提物對小鼠均有明顯的急性毒性,其LD50分別為5.054(4.798～5.361)g/kg、5.783(5.313～6.338)g/kg、6.872(6.173～7.724)g/kg,均可引起小鼠明顯心臟毒性;表現(xiàn)為先出現(xiàn)心率加快和心律不齊,體熱,皮膚、尾、足墊發(fā)紅,心前區(qū)搏動(dòng)明顯加快,逐漸轉(zhuǎn)為體涼,唇爪、尾部、耳、足墊蒼白,唇爪發(fā)紺,最后心前區(qū)搏動(dòng)減弱,心率減慢,死亡。3種醇提物分別以4.56、5.08、6.06 g/kg灌胃大鼠,也可引起類似的急性心臟毒性反應(yīng),解剖可見急性死亡的大鼠心肌充血,心臟系數(shù)增加,部分大鼠CK明顯升高。泥附子醇提物6.20 g生藥/kg灌胃大鼠3個(gè)月,早期給藥時(shí)可觀察到大鼠心前區(qū)搏動(dòng)有所加快,心律紊亂,3個(gè)月末病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)部分大鼠心臟損傷,主要表現(xiàn)心肌小片狀或灶性壞死、溶解,伴隨慢性炎細(xì)胞浸潤及纖維結(jié)締組織增生,不可逆。這是附子長期給藥的蓄積心臟毒性。而上述3個(gè)炮制品的水提物灌胃小鼠、大鼠無明顯心臟毒性[3]。

進(jìn)一步,團(tuán)隊(duì)制備附子總生物堿、附子脂溶性生物堿和附子水溶性生物堿開展相關(guān)研究。結(jié)果附子總生物堿按相當(dāng)于生藥量2.5 g/kg經(jīng)十二指腸給藥鹽酸普羅帕酮致急性心力衰竭大鼠,可明顯改善其心臟血流動(dòng)力學(xué),使心率增加,并可明顯增加大鼠左心室內(nèi)壓最大上升速率(LV+dp/dtmax)和降低最大下降速率(LV-dp/dtmax)具有強(qiáng)心作用[4];附子脂溶性生物堿0.425 mg/kg股靜脈注射大鼠,記錄心電圖發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)明明為的心律失常,并能持續(xù)19～42 min,而再次給予水溶性生物堿248.00、277.264、309.98 mg/kg,可明顯縮短大鼠心律失常持續(xù)時(shí)間,且具有一定量-效正相關(guān);1%附子脂溶性生物堿體外作用于原代培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細(xì)胞,可導(dǎo)致其細(xì)胞活力明顯下降、細(xì)胞死亡數(shù)增加、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-ATP酶活性降低,而當(dāng)將之與水溶性生物堿按1∶1配伍給藥時(shí),上述心肌細(xì)胞損傷均明顯降低。附子多糖與1%附子脂溶性生物堿按1∶1配伍則無明顯作用[5]。此外,附子水溶性生物堿按1.25、2.50、5.00 mg/kg靜脈注射,對鹽酸普羅帕酮致急性心力衰竭大鼠可明顯升高其心率和LV+dp/dtmax,降低LV-dp/dtmax,且能降低其血清Ang II、TNF-α、ANP、BNP、ALD水平;附子水溶性生物堿0.01、0.02、0.04 g/L體外作用于0.8%戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞心力衰竭模型,可明顯提高細(xì)胞活力,增加細(xì)胞內(nèi)Na+、Mg2+含量,提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,降低K+、Ca2+含量和Na+-K+-ATP酶活性[6-7]。上述結(jié)果表明,附子總生物堿具有強(qiáng)心作用,附子脂溶性生物堿具有顯著心臟毒性和心肌細(xì)胞毒性,而附子水溶性生物堿具有強(qiáng)心作用的對抗附子脂溶性生物堿心臟毒性的作用,因而附子生物堿類是其引起心臟毒-效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿屬雙酯型生物堿,為脂溶性生物堿,是目前研究最多的烏頭類生物堿,其中又以烏頭堿的關(guān)注度最高。烏頭堿對心臟和心肌細(xì)胞的毒性是得到公認(rèn)的。如在心血管藥理研究中,利用其毒性作為誘導(dǎo)動(dòng)物快速心律失常的常用工具藥[8]。Kentaro Wada等研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)以1 mg/kg長期灌胃小鼠(22 d)時(shí),可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)各種類型心律失常,但隨著給藥次數(shù)的增加或給藥后時(shí)間延長,心律失常的頻率顯著下降[9]。Jean Pierre Pennect等發(fā)現(xiàn)烏頭堿在1×10-6M時(shí)可導(dǎo)致歐洲鰻鱺離體灌流心臟心率減慢,而大于此濃度時(shí)則誘導(dǎo)快速性心律失常,直至心室肌細(xì)胞去極化[10]。在細(xì)胞層面,我們研究發(fā)現(xiàn),烏頭堿對原代培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細(xì)胞具有明顯的毒性,可導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡,且呈“量-時(shí)-毒”正相關(guān),作用1 min的最大毒性濃度為3%,隨著作用時(shí)間(0.5～30 min)延長毒性增強(qiáng);而在相同作用時(shí)間(30 min)下存在最大毒性濃度(2%)和最低毒性濃度(0.2%)[3,11]。

新烏頭堿和次烏頭堿也具有顯著心臟毒性。李志勇等研究表明,次烏頭堿30、60、120 μM對體外培養(yǎng)乳大鼠心肌細(xì)胞具有明顯毒性[12];王相沖等研究顯示,新烏頭堿以25 μg/kg股靜脈注射豚鼠可致其發(fā)生多種類型的心律失常,以1×10-7M、3×10-7M體外處理豚鼠心室肌細(xì)胞可影響其動(dòng)作電位[13]。

而另一方面烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿在低濃度時(shí)具有心肌細(xì)胞保護(hù)作用。如我們的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)烏頭堿濃度較低(1×10-9M)時(shí),對0.8%戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用;張碩峰等以50 μg/mL的烏頭堿預(yù)防性股靜脈推注給大鼠,可減輕尼莫地平所致大鼠心力衰竭,表現(xiàn)為心率、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax和RPP異常均得到改善[14],新烏頭堿和次烏頭堿也對該模型所致快速心率和心功能異常有改善作用[15]。方堃等研究顯示,用250 ng/mL的次烏頭堿預(yù)處理大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞,可減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞細(xì)胞增殖活力下降和細(xì)胞凋亡的發(fā)生,降低細(xì)胞內(nèi)Caspase 3和Caspase 9的表達(dá)[16]。

去甲烏藥堿是較早被認(rèn)識(shí)到具有強(qiáng)心作用的附子生物堿,靜脈滴注2 μg/kg可使豚鼠正常心臟收縮力加強(qiáng),也可加強(qiáng)離體豚鼠衰竭心臟的收縮功能,但普奈洛爾可使之對離體豚鼠心臟右心房加速自律性的量效曲線右移,提示可能是β受體部分激動(dòng)劑[17-18]。近年來還有一些成分被報(bào)道有強(qiáng)心作用。如王璐等采用離體蛙心臟觀察了從附子中分離得到的13個(gè)胺醇型二萜生物堿的強(qiáng)心活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)北烏頭堿、新烏頭堿、烏頭原堿、3-去氧烏頭原堿、異塔拉定具有強(qiáng)心活性[19]。另外,日本有報(bào)道日本附子中所含的去甲烏藥堿是附子強(qiáng)心作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ),但該成分至今尚未在我國江油附子中分離到。

1.2 附子多糖是保護(hù)心肌細(xì)胞的有效物質(zhì)之一 附子多糖是附子的主要成分之一,也是附子的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。過去附子多糖的藥理研究主要集中在調(diào)節(jié)免疫方面,而近年來發(fā)現(xiàn),附子多糖可能也是附子強(qiáng)心、保護(hù)心肌的藥效物質(zhì)之一。劉古鋒等將附子多糖預(yù)防性灌胃游泳力竭小鼠14 d,結(jié)果可顯著提高小鼠運(yùn)動(dòng)耐力,升高小鼠心肌SOD、CAT、GSH-Px活性,同時(shí)降低MDA含量,并降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù),升高Bcl-2表達(dá)而抑制Caspase 3的表達(dá)[20]。劉穎等采用大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞建立缺氧/復(fù)氧損傷模型,給予10 mg/mL的附子多糖干預(yù),結(jié)果可明顯增加細(xì)胞存活率,減少LDH、CK的釋放和降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,亦能抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[21]。上述結(jié)果表明,附子多糖是附子保護(hù)心肌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

1.3 其他具有強(qiáng)心或保護(hù)心肌作用的成分 除了生物堿類和多糖,還有一些成分被報(bào)道對心肌細(xì)胞具有活性。韓公羽等對從附子中分離得到的尿嘧啶、附子苷作用于蟾蜍離體心臟,結(jié)果均可明顯加強(qiáng)其收縮作用[22-23]。本研究團(tuán)隊(duì)從附子中分離得到的新成分吡嗪類和吡咯類成分均對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞損傷有一定保護(hù)作用[1-2]。

2 附子的心臟“毒-效”機(jī)制

附子對心臟的毒性主要有急性毒性、慢性毒性和細(xì)胞毒性,引起毒性的機(jī)制包括破壞心肌細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能,以及影響心肌傳導(dǎo)系統(tǒng),其中絕大部分毒性機(jī)制研究均是以心肌細(xì)胞為靶點(diǎn)。

2.1 附子致心臟毒性機(jī)制

2.1.1 引起急性心臟毒性 急性心臟毒性是指24 h內(nèi)1次或多次給予附子后,可引起心臟功能、形態(tài)、生化等的異常。本團(tuán)隊(duì)開展的附子不同炮制品醇提物灌胃小鼠、大鼠的急性心臟毒性試驗(yàn)顯示,附子醇提物可引起急性心律失常,劑量較小時(shí)癥狀可逐漸緩解,而當(dāng)劑量較大時(shí)癥狀逐漸加重,最終因呼吸-循環(huán)衰竭而急性死亡,解剖可見心臟充血明顯,心臟的臟器指數(shù)增加。對急性中毒大鼠進(jìn)行血液生化檢查發(fā)現(xiàn)部分大鼠血清CK水平明顯升高,病檢部分大鼠心肌充血[3]。馮群等以心電圖、血生化指標(biāo)(CK、LDH、BNP、cTn I)和臟器指數(shù)(心、肝、腎)為評(píng)價(jià)指標(biāo)觀察給予小鼠單次灌胃7.20 g/kg后0～120 min的“時(shí)-毒”相關(guān)性,及分別灌胃7.20、4.64、2.99、1.93、1.25 g/kg后的“量-毒”相關(guān)性,結(jié)果顯示,附子可引起小鼠心率和ECG(QRS間期、R波幅度、T波時(shí)間和幅度、QT間期)異常,血清CK、LDH、BNP、cTn I水平逐漸升高,且呈明顯“時(shí)-毒”正相關(guān)和“量-毒”正相關(guān);但對小鼠重要臟器指數(shù)均無明顯影響[24]。附子不同炮制品(生附子、黑順片、白附片)水煎液均以0.27、1.35、5.4 g/kg對麻醉大鼠經(jīng)十二指腸給藥,亦可導(dǎo)致ECG明顯異常和血清CK、LDH升高,并呈一定量-毒正相關(guān)[25]。

2.1.2 引起慢性心臟毒性 我們在前期開展的附子醇提物長期毒性試驗(yàn),結(jié)果6.20 g生藥/kg灌胃大鼠3個(gè)月,不引起明顯毒性反應(yīng),但早期給藥時(shí)在給藥后心前區(qū)搏動(dòng)有所加快,心律紊亂,雄性大鼠耗食量降低,隨后恢復(fù)正常;病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)部分大鼠心臟損傷,主要表現(xiàn)心肌小片狀或灶性壞死、溶解,伴隨慢性炎細(xì)胞浸潤及纖維結(jié)締組織增生[3]。

2.1.3 導(dǎo)致心臟功能異常 楊龍坡等采用大鼠離體心臟灌流技術(shù)發(fā)現(xiàn),附子總堿可導(dǎo)致離體心臟血流動(dòng)力學(xué)下降,使心率加快,使左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張壓(LVDP)、±dp/dtmax明顯降低,且與累積給藥量呈正相關(guān)趨勢,同時(shí)使左心室舒張末期壓(LVEDP)上升[26]。

2.1.4 細(xì)胞毒機(jī)制 大量的實(shí)驗(yàn)研究以烏頭堿作為附子的主要毒性成分,觀察其對心肌細(xì)胞的毒性;也有一些研究以新烏頭堿、次烏頭堿開展毒性機(jī)制研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)附子的心肌細(xì)胞毒性包括心肌細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)損害、損傷細(xì)胞膜穩(wěn)定性、細(xì)胞能量代謝異常、酶和受體損傷、細(xì)胞增殖抑制等。1)抑制心肌細(xì)胞搏動(dòng)和破壞細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)。大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞具有節(jié)律性搏動(dòng),甚至連成片,烏頭堿可導(dǎo)致該搏動(dòng)異常,毒性較大時(shí)完全抑制。我們的研究顯示,1 μM的烏頭堿作用5 min即可導(dǎo)致大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)的頻率加速,甚至抽搐樣,隨著時(shí)間延長又逐漸變慢至恢復(fù)正常,當(dāng)濃度到2 μM時(shí)亦先快后慢,并最終搏動(dòng)被部分或完全抑制,因此認(rèn)為可以將之作為心律失常細(xì)胞模型[27];暴露于3%烏頭堿中30 s即出現(xiàn)形態(tài)損傷,可見細(xì)胞間連續(xù)減少、空隙增加,細(xì)胞收縮和胞體變小,細(xì)胞內(nèi)見顆粒狀物,伊紅染色進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核周圍有空隙存在,細(xì)胞偽足縮短或變少,隨著給藥時(shí)間延長上述損傷加重,至30 min細(xì)胞極度萎縮,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量空泡和顆粒,細(xì)胞核碎裂;電鏡下可見作用30 s時(shí),細(xì)胞核呈不規(guī)則型,染色質(zhì)濃縮,核內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡,核仁、核膜清晰,胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹,嵴模糊、斷裂、減少或消失,基質(zhì)密度變淺,部分線粒體溶解,溶酶體腫脹,胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的空泡,伴局灶性肌絲溶解,部分細(xì)胞器失去結(jié)構(gòu),細(xì)胞膜不完整;隨著暴露時(shí)間延長核仁消失,胞質(zhì)內(nèi)線粒體膜結(jié)構(gòu)腫脹或破裂消失,大量的溶酶體出現(xiàn),細(xì)胞膜不完整;至30 min細(xì)胞核染色質(zhì)幾乎全部丟失,核膜呈鋸齒狀,肌絲全部溶解,胞質(zhì)細(xì)胞器消失,甚至細(xì)胞破裂。在上述損傷前,原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞搏動(dòng)明顯減弱,甚至消失[3,28]。次烏頭堿60、120 μM也可引起原代培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細(xì)胞搏動(dòng)減弱和形態(tài)異常[29]。2)損傷細(xì)胞膜穩(wěn)定性。我們的研究顯示,3%烏頭堿作用30 s、1 min、30 min或0.63%、1.13%、2%烏頭堿作用30 min,均可導(dǎo)致原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞漏出LDH、ACP增加[3,28]。3)干擾細(xì)胞能量代謝,破壞線粒體。我們的研究顯示,3%烏頭堿作用30 s、1 min、30 min或0.36%、0.63%、1.13%、2%烏頭堿作用30 min,均可導(dǎo)致原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)糖原含量降低,3%烏頭堿作用1、30 min使細(xì)胞內(nèi)SDH活力下降,cAMP/cGMP比值顯著升高[3,28];3%新烏頭堿和次烏頭堿分別對心肌細(xì)胞作用30 s、1 min、30 min,均能顯著升高心肌細(xì)胞內(nèi)IP3的生成,同時(shí)顯著升高cAMP/cGMP的比值[30];0.2%烏頭堿可使細(xì)胞色素C氧化酶活性亦降低[31]。趙佳偉等將來源于大鼠的H9C2心肌細(xì)胞系暴露于附子水提取物12.5、25、50、100 g/L中24 h,結(jié)果可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位下降,線粒體內(nèi)活性氧(ROS)和超氧化物熒光表達(dá)增強(qiáng),而Ca熒光強(qiáng)度降低,同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體生物合成關(guān)鍵因子Pgc-1降低,使凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2下調(diào)和Bax上調(diào),從而多途徑導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體損傷[32]。4)破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),影響離子交換相關(guān)酶和通道開放,造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載。我們的研究顯示,3%烏頭堿作用30 s、1 min、30 min或0.2%作用1 h,均可導(dǎo)致原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞離子水平異常,Na+、Ca2+含量顯著增加而K+、Mg2+含量顯著降低,使心肌細(xì)胞Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均下降,其中以Ca2+-ATP酶活性下降最顯著[28,33]。烏頭堿引起的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載和離子水平紊亂被認(rèn)為是其導(dǎo)致心律失常、心肌損傷的重要原因,而引起上述變化與烏頭堿抑制了心肌細(xì)胞膜上調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)ATP酶活性、電壓或門控式離子通道開放有關(guān)。早在20世紀(jì)國外采用膜片鉗技術(shù)研究就發(fā)現(xiàn),烏頭堿可使大鼠乳鼠心肌細(xì)胞上L型鈣通道開放數(shù)量和開放時(shí)間均降低[34];近年研究顯示,烏頭堿可增加大鼠心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)L型鈣通道電流,增加NCX表達(dá)而降低SERCA2a表達(dá),從而觸發(fā)心律失常發(fā)生[35]。烏頭堿可使成年小鼠心室肌細(xì)胞上的電壓鈉離子通道開放數(shù)量增加和再次開放,鈉通道阻滯劑河豚毒素可降低烏頭堿致小鼠心電圖異常,均表明烏頭堿可興奮鈉通道[36-37]。近年來又發(fā)現(xiàn),烏頭堿可抑制H9c2心肌細(xì)胞系上超速延遲鉀電流(IKur),且呈明顯依賴性,對它的影響也符合其作用于大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心室肌細(xì)胞時(shí)細(xì)胞心電圖的改變[38]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),烏頭堿對鉀、鈉、鈣離子通道調(diào)控的影響可能是通過調(diào)節(jié)通道相關(guān)蛋白Nav1.5、Kv4.2、RyR2、NCX的表達(dá)達(dá)到[33,39]。次烏頭堿致心肌細(xì)胞心律失常的鈣超載機(jī)制與烏頭堿相似,并降低心肌細(xì)胞縫隙連續(xù)Cx43蛋白表達(dá)而使細(xì)胞更易于發(fā)生心律失常[29]。5)抑制細(xì)胞增殖。我們的研究顯示,3%烏頭堿作用30 s、1 min、30 min,可明顯降低原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞增殖活力,且隨著作用時(shí)間延長,使細(xì)胞周期的S期縮短而G0期延長,因而G0/G1明顯升高,G2+M則先延長后縮短[28]。6)其他。我們的研究顯示,3%烏頭堿作用30 s、1 min、30 min或0.36%、0.63%、1.13%、2%烏頭堿作用30 min,均可導(dǎo)致原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯增加[3,28];次烏頭堿0.23、0.69、2.07 mg/kg灌胃大鼠,連續(xù)7 d,可明顯抑制其心肌組織中鈣調(diào)蛋白(CaM)的蛋白和mRNA表達(dá),同時(shí)顯著抑制細(xì)胞縫隙連接蛋白CX43(Ser368)磷酸化[29]。

2.2 附子強(qiáng)心作用機(jī)制 臨床上,附子常用于治療急性心力衰竭和慢性心力衰竭。現(xiàn)代藥理研究亦顯示,附子對急性心力衰竭和慢性心力衰竭均有治療作用,可改善其心臟血流動(dòng)力學(xué)和抑制心室重松,機(jī)制涉及改善心力衰竭發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)、炎性反應(yīng)因子等神經(jīng)內(nèi)分泌和體液因子分泌,升壓,保護(hù)心肌細(xì)胞等。1)調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和體液因子分泌。為探討附子回陽救逆、強(qiáng)心的作用,我們團(tuán)隊(duì)早在2008年采用鹽酸普羅帕酮建立了心陽虛急性心力衰竭大鼠模型[40]和阿霉素合氫化可的松誘導(dǎo)的心腎陽虛慢性心力衰竭模型[41],已被廣泛認(rèn)可和應(yīng)用。采用上述模型我們研究發(fā)現(xiàn),白附片水煎液1.5 g/kg十二指腸給藥,可增強(qiáng)鹽酸普羅帕酮致心陽虛急性心力衰竭大鼠的心率,增加LV±dp/dtmax絕對值,水煎液還有升高血漿腎素、心鈉肽(ANP)和內(nèi)皮素(ET)的趨勢[42-43];進(jìn)一步研究顯示,附子總堿2.0 g/kg,附子水溶性生物堿1.25、2.50、5.00 mg/kg,或?yàn)躅^堿5 μg/kg經(jīng)十二指腸給藥,對上述急性心力衰竭大鼠也能明顯增強(qiáng)血流動(dòng)力學(xué),水溶性生物堿明顯降低ALD、ANP和BNP水平,烏頭堿可降低血清ALD水平[6,33-44]。吳美平等以結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制備的心肌梗死心力衰竭大鼠模型,給予灌胃附子水煎液4.5、9.0 g/kg,連續(xù)4周,可明顯改善其心臟血流動(dòng)力學(xué)參數(shù),降低左心室質(zhì)量指數(shù),并顯著降低血清AngII水平[45]。張俊平等給予阿霉素誘導(dǎo)的慢性心力衰竭大鼠灌胃附子水煎液21 d,結(jié)果可明顯降低大鼠血清NO、TNF-α含量[46]。附子水煎液按4.5、9.0 g/kg灌胃冠脈結(jié)扎致慢性心力衰竭大鼠連續(xù)21 d,可明顯改善其血流動(dòng)力學(xué),但對升高的Ang II、ALD和左心室臟器指數(shù)無下降作用,高劑量組反而使之升高,提示附子對慢性心力衰竭的治療不能調(diào)節(jié)紊亂的RAAS系統(tǒng)和抑制心室重構(gòu)[47]。2)升壓。附子提取物30 g/kg經(jīng)十二指腸給藥戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的急性心力衰竭大鼠,可顯著升高其降低的心率、LVSP及LV±dp/dtmax,但當(dāng)同時(shí)給予靜脈注射酚妥拉明500 μg/kg時(shí)可減弱其對LVSP的升壓作用,給予靜脈注射普奈洛爾300 μg/kg可一定程度抑制其升高LVSP和加快心率的作用,表明附子對心力衰竭大鼠增強(qiáng)心室內(nèi)壓作用與激活腎上腺素能α、β受體均有關(guān)[48]。附子全組分、水組分和醇組分均對正常大鼠和放血致低血壓大鼠有升壓作用,主要以升高收縮壓為主,用呈現(xiàn)明顯的“量-時(shí)-效”關(guān)系[49]。3)保護(hù)心肌細(xì)胞。附子對心肌細(xì)胞有保護(hù)作用,可以增強(qiáng)其增殖活力、保護(hù)細(xì)胞膜穩(wěn)定性、改善細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)ATP酶和離子通道、抗細(xì)胞凋亡等。我們前期采用0.8%戊巴比妥鈉處理體外培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細(xì)胞制備心肌細(xì)胞心力衰竭模型,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞搏動(dòng)明顯抑制,細(xì)胞內(nèi)離子水平紊亂和細(xì)胞膜上離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)ATP酶異常。對這樣的細(xì)胞,我們用附子水溶性生物堿0.1、0.2、0.4 g/L作用1 h,結(jié)果可使細(xì)胞搏動(dòng)恢復(fù),使細(xì)胞內(nèi)異常升高的Ca2+、K+水平降低和異常降低的Na+、Mg2+水平升高,同時(shí)使Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力增加和Na+-K+-ATP酶活力降低[7];烏頭堿1×10-7M對該模型細(xì)胞也有相似保護(hù)作用,可明顯降低細(xì)胞內(nèi)K+水平和Na+-K+-ATP酶活力,增加Ca2+-ATP酶活力[33];此外,烏頭堿1×10-7M、1×10-9M還能使該心力衰竭細(xì)胞漏出LDH、ACP減少[33,50]。郭雄等采用膜片鉗技術(shù)觀察附子含藥血清對大鼠心室肌細(xì)胞L-鈣通道(Ica-L)的影響,結(jié)果顯示,附子含藥血清可以增加Ica-L的電流密度、激活曲線左移,失活曲線右移[51],這可能是附子治療緩慢型心律失常的機(jī)制之一。范穎等給予阿霉素致的心臟毒性損傷大鼠灌胃附子水煎液1.75 g/kg,連續(xù)30 d,結(jié)果可使心肌線粒體中Bcl-2表達(dá)升高而Bax表達(dá)下降,因而Bcl-2/Bax比值顯著升高,并使caspase-3、caspase-9表達(dá)均下降,從而抑制阿霉素所致心肌細(xì)胞凋亡。

3 以心臟為靶點(diǎn)的附子增效減毒原理

3.1 依法炮制 炮制是附子減毒的重要手段。炮制過程中,附子所含的雙酯型生物堿水解為毒性較小的單酯型生物堿苯甲酰烏頭胺、苯甲酰中烏頭胺和苯甲酰次烏頭胺,進(jìn)一步水解成毒性更小的胺醇類烏頭胺、中烏頭胺和次烏頭胺,從而使毒性降低70%～80%。而炮制所用膽巴中含有鎂鹽,有助于雙酯型生物堿的溶出、水解和拮抗烏頭堿心臟毒性的作用[52]。如我們的研究顯示,泥附子、黑順片和白附片的醇提物灌胃小鼠的LD50以泥附子最小,急性心臟毒性的表現(xiàn)最劇烈,而炮制品黑順片和白附片的LD50相對較大,毒性也相對緩和[3]。亦賈雪巖等比較了生附子和不同炮制方法的4個(gè)炮制品(黑順片、高溫片、高壓片、微波片)及煎煮液中雙酯型生物堿的含量,并采用langendorff大鼠離體心臟灌流法比較其對心功能影響。結(jié)果顯示,經(jīng)炮制后的4個(gè)炮制品的雙酯型生物堿含量均較生附子含量明顯降低,而單酯型生物堿逐漸增加,其相應(yīng)煎煮液中6種生物堿(烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次原烏頭堿)的溶出率與炮制品中生物堿水平呈正相關(guān),而4個(gè)炮制品均可增加離體心臟的HR、LVSP、±dp/dtmax和降低LVEDP,以高壓片中生物堿保存量最高、藥效最明顯[53]。可見,炮制過程中可通過使雙酯型生物堿水解為單酯型生物堿而達(dá)到降低心臟毒性和增強(qiáng)強(qiáng)心作用。

3.2 合理配伍 附子在心臟方面的配伍“增效減毒”存在兩方面,一是附子自身存在組分配伍調(diào)控其心臟的毒效作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),附子中存在導(dǎo)致心律失常的毒性組分脂溶性生物堿,同時(shí)存在對抗該毒性的控毒組分水溶性生物堿,可有效對抗脂溶性生物堿所致大鼠心律失常和原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞毒性[5];二是附子與其他中藥配伍治療心律失常、心力衰竭等心臟疾病,如常與甘草、干姜、人參等配伍。我們按照“飲片配伍-組分配伍、成分配伍”的3個(gè)層次,從化學(xué)和藥理毒理學(xué)兩方面,系統(tǒng)研究了附子配伍干姜治療急、慢性心力衰竭的增效減毒原理,附子配伍人參治療心力衰竭的增效減毒原理,及附子配伍甘草治療心律失常的增效減毒原理[54]。結(jié)果顯示,在上述配伍中,干姜、人參、甘草均可促進(jìn)附子中總生物堿和酯型生物堿的溶出而降低雙酯型生物堿的含量,從而在化學(xué)層面盡量保存了有效物質(zhì)而降低了毒性物質(zhì)含量;在藥效方面：1)附子干姜配伍,干姜提取物、干姜揮發(fā)油與附子總堿配伍均可降低附子總堿灌胃正常小鼠的急性毒性,同時(shí)附子總堿與干姜提取物、干姜揮發(fā)油配伍,對急、慢性心力衰竭大鼠血漿TNF-α、AngⅠ、AngⅡ、ANP、ET、TNF的水平有一定的調(diào)控作用;也能抑制慢性心力衰竭模型大鼠心肌重構(gòu)效應(yīng),體現(xiàn)增效減毒。2)附子人參配伍,即參附注射液的組成。我們團(tuán)隊(duì)圍繞參附注射液開展了其治療心力衰竭增效減毒原理研究,采用整體(鹽酸普羅帕酮致急性心力衰竭模型)和離體(原代培養(yǎng)正常心肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞心力衰竭模型)模型,從組分配伍(紅參提取物、附子提取物)和成分配伍(附子與人參皂苷Rg1、Rb1配伍)2個(gè)層面,開展了系列藥理研究,結(jié)果顯示,一方面紅參中的皂苷類成分可對抗附子中毒性成分烏頭堿所致的心肌細(xì)胞活力下降、細(xì)胞膜紊亂、細(xì)胞因子分泌異常等心肌細(xì)胞毒性;另一方面附子中成分在一定狀態(tài)下(如烏頭堿在低濃度1×10-7M、1×10-9M)又可與皂苷類成分協(xié)同增效,共同改善心力衰竭細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能,從而表現(xiàn)出減毒增效機(jī)制。3)附子甘草配伍,從化學(xué)角度分析,甘草皂苷和甘草黃酮等具有酸性基團(tuán),可與附子生物堿的堿性基團(tuán)結(jié)合形成鹽,從而改變了附子中生物堿的存在形式,降低了毒性;在藥理研究中發(fā)現(xiàn),甘草皂苷、甘草黃酮可有效降低附子脂溶性生物堿誘導(dǎo)的大鼠心律失常持續(xù)時(shí)間,并減輕其對原代培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細(xì)胞的損傷。甘草多糖對附子脂溶性生物堿的毒性無控毒作用。上述研究科學(xué)闡釋了合理配伍可調(diào)控附子對心臟的毒、效。

配伍不當(dāng),使附子心臟毒性增強(qiáng)。按照中藥“十八反”規(guī)定,附子不宜與貝母同用。如劉萍等觀察了灌胃白順片水煎液或白順片+貝母2.5 g/kg,連續(xù)14 d,結(jié)果均可導(dǎo)致大鼠心臟指數(shù)升高和心肌組織形態(tài)學(xué)損傷,但白順片+貝母組損傷較白順片組明顯;瓜蔞亦可增強(qiáng)附子的心臟毒性[55]。而按中藥相畏、相殺原則將附子與黃芪、防風(fēng)或遠(yuǎn)志配伍時(shí),其心臟毒性可得到部分減輕[56]。上述研究體現(xiàn)了中藥“十八反”“七情”配伍原則的科學(xué)性,附子臨床用藥時(shí)應(yīng)遵守配伍原則。

3.3 辨證用藥 Min Li等研究發(fā)現(xiàn),在大鼠清醒狀態(tài)下,里昂高血壓大鼠較里昂低血壓大鼠更易被烏頭堿誘導(dǎo)心律失常[57]。趙慶華等研究發(fā)現(xiàn),附子水提組分1.08、1.35 g/kg灌胃可導(dǎo)致正常大鼠血清LDH水平升高,而1.08 g/kg組無異常,但當(dāng)給予放血法致低血壓大鼠時(shí),1.08 g/kg組亦出現(xiàn)LDH顯著升高,表明其對心肌損傷毒性與機(jī)制狀態(tài)有關(guān)[49]。

3.4 延長煎煮時(shí)間 在附子的傳統(tǒng)應(yīng)用中,要求“先煎,口嘗無麻味”,其實(shí)質(zhì)即是通過延長煎煮時(shí)間,使雙酯型生物堿充分水解,從而降低附子毒性,也降低了其心臟毒性。我們采用鹽酸普羅帕酮建立大鼠心陽虛急性心力衰竭模型,按均勻設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案,觀察白附片不同煎煮時(shí)間水煎液(15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h)不同劑量的強(qiáng)心作用,結(jié)果顯示,上述提取物均能明顯提高心陽虛大鼠心率,顯著升高+LV dp/dtmax,降低-LV dp/dtmax,經(jīng)回歸分析提示,以煎煮6 h、劑量為12 g/kg時(shí)作用最好[58]。

3.5 控制劑量 劑量是中毒的重要因素。附子中雙酯型生物堿既是其致心臟毒性的毒性物質(zhì)基礎(chǔ),亦是強(qiáng)心藥效物質(zhì),關(guān)鍵在于劑量。我們的研究顯示,附子中的烏頭堿當(dāng)濃度為3%時(shí),作用5 s即可引起體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞活力明顯下降,30 min可致細(xì)胞破裂、死亡,而濃度降至0.2%(3×10-3M)時(shí)毒性明顯減輕,需作用30 min才使細(xì)胞活力明顯下降,進(jìn)一步降至1×10-7M時(shí),對正常心肌細(xì)胞無毒性,且對0.8%戊巴比妥鈉致心肌細(xì)胞心力衰竭模型有保護(hù)作用[3,28,33]。次烏頭堿、新烏頭堿在不同劑量下也分別表現(xiàn)為心臟毒性和心臟保護(hù)作用。趙慶華等研究發(fā)現(xiàn),附子全組分0.2、0.54、0.81、1.08、1.35 g/kg灌胃可升高正常大鼠和低血壓大鼠血壓,但1.35、0.81 g/kg組為先降壓后升壓,而其余3個(gè)組在給藥60 min內(nèi)一直呈升壓作用,且1.35、1.08 g/kg組導(dǎo)致血清中LDH升高,1.35、1.08、0.81、0.54 g/kg組CK明顯升高,提示對心肌有損傷[49]。可見,隨著劑量的增加,雖然升壓作用仍存在,但毒性也出現(xiàn)了。

4 總結(jié)

附子是傳統(tǒng)確有療效的有毒中藥,是臨床上用于治療心力衰竭的常用中藥。本文經(jīng)綜述可見,附子中引起心臟毒性的主要毒性物質(zhì)是雙酯型生物堿,強(qiáng)心和保護(hù)心肌細(xì)胞有效物質(zhì)主要有附子總生物堿、附子水溶性生物堿、附子酯型生物堿、附子多糖及腺苷、尿嘧啶等成分;附子致心臟毒性和強(qiáng)心作用存在共有靶點(diǎn),主要包括心肌細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)、心肌細(xì)胞膜穩(wěn)定性、心肌細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)ATP酶和離子通道,心肌細(xì)胞能量代謝;附子致心臟毒性的機(jī)制還有損傷心肌細(xì)胞線粒體、抑制細(xì)胞增殖;附子強(qiáng)心作用機(jī)制還有調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌體液因子分泌、升壓。臨床應(yīng)用中,一定要按照辨證論治的法則使用附子,使用過程中應(yīng)注意選用合適的炮制品、合理配伍、嚴(yán)格按照處方劑量和煎煮方法用藥,使附子藥效得到最大應(yīng)用而毒性得到有效控制。

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StudyProgressofMultidimensionalEvaluationandIntegratedAnalysisbetweenToxicityandEfficacyonHeartofRadixAconitiLateralisPraeparata

Xie Xiaofang, Peng Cheng

(CollegeofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine;KeyLaboratoryofChineseHerbsStandardizationofMinistryofEducation;Co-constructKeyLaboratoryofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicinalResources,Chengdu611137,China)

As a famous geo-authentic medicine distributed in Sichuan Province, Radix Aconiti Lateralis Praeparata is also a traditionally toxic medicine with curative effect in clinic. Heart is the key target for both toxicity and efficacy of Radix Aconiti Lateralis Praeparata. However, the correlation between toxicity and efficacy on heart remains unknown. Under the guidance of the research idea “multidimensional evaluation and integrated analysis between ‘toxicity and efficacy’ for Chinese materia medica” proposed by professor Peng Cheng, the article tightly focused on the six factors as “variety, quality, processing, property, efficacy, application” of Chinese materia medica. The research status of ‘toxicity-efficacy’ material basis, mechanism, and effect-enhancing and toxicity-reducing principle for Radix Aconiti Lateralis Praeparata on heart were summarized based on our years of researches and other relative researches at home and abroad. Cardiac toxicity-efficacy mechanism was integrated analyzed then. It was shown that diester-type alkaloids (DA) was material base for heart toxicity in Radix Aconiti Lateralis Praeparata, while total alkaloids (AD), water-soluble alkaloids (WA), polysaccharide and some other compounds in Radix Aconiti Lateralis Praeparata were responsible for effects of cardiotonic and protecting myocardial cells. There were the same targets in myocardial cells for toxicity and efficacy of Radix Aconiti Lateralis Praeparata, such as cell morphology and function, membrane stability, cellular environmental homeostasis, ion transport-related ATPase and channels, and energy metabolism. However, there was some respective mechanism for each other. Multi-means could be taken to control cardiac toxicity and enhance effects on heart for Radix Aconiti Lateralis Praeparata, including legal processing, reasonable compatibility, differentiation for use, extending time of decoction, dosage control.

Radix Aconiti Lateralis Praeparata; Heart; Toxicity-efficacy; Integrated analysis

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(81630101);國家發(fā)改委標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目(ZYBZH-C-SC-51);國家自然科學(xué)基金國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金(J1310034);四川省中醫(yī)藥管理局“川產(chǎn)道地藥材綜合開發(fā)與區(qū)域發(fā)展”項(xiàng)目(2016ZY008)

謝曉芳(1983.02—),女,博士,副研究員,研究方向：中藥藥理與毒理研究,E-mail:xxf14544@163.com

彭成(1964.03—),男,博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,研究方向：中藥毒效的系統(tǒng)評(píng)價(jià)與整合研究,E-mail:pengchengchengdu@126.com

R285.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.003

(2017-10-09收稿 責(zé)任編輯：王明)