右美托咪定預(yù)處理對(duì)異丙酚誘導(dǎo)發(fā)育期大鼠離體海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響

楊劍，劉婷婷，熊興龍，嚴(yán)莉，劉婉玲

(1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽(yáng)550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院)

·基礎(chǔ)研究·

右美托咪定預(yù)處理對(duì)異丙酚誘導(dǎo)發(fā)育期大鼠離體海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響

楊劍1，劉婷婷1，熊興龍1，嚴(yán)莉2，劉婉玲1

(1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽(yáng)550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院)

目的觀察右美托咪定預(yù)處理對(duì)異丙酚誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠離體海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響。方法體外培養(yǎng)新生SD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、異丙酚組、右美托咪定預(yù)處理組。對(duì)照組正常培養(yǎng)12 h；異丙酚組在培養(yǎng)液中加入12 μg/mL異丙酚孵育12 h；右美托咪定預(yù)處理組下設(shè)5個(gè)濃度組，分別加入0.002 5、0.025、0.25、2.5、25 μg/mL右美托咪定預(yù)處理30 min，再加入12 μg/mL異丙酚繼續(xù)孵育12 h。采用MTT法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率、HE染色光鏡下觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果與對(duì)照組比較，異丙酚組、右美托咪定預(yù)處理組神經(jīng)細(xì)胞存活率均降低(P<0.05或<0.01)；與異丙酚組比較，右美托咪定預(yù)處理組神經(jīng)細(xì)胞存活率均升高(P<0.05或<0.01)，右美托咪定濃度較高組的神經(jīng)細(xì)胞存活率高于右美托咪定濃度較低組(P均<0.05)。對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常；異丙酚組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞損傷，細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)呈空泡樣改變，胞核固縮深染；右美托咪定預(yù)處理組神經(jīng)細(xì)胞損傷程度較異丙酚組減輕，隨右美托咪定濃度的增高，神經(jīng)細(xì)胞損傷程度逐漸減輕，其中2.5、25 μg/mL右美托咪定預(yù)處理的海馬神經(jīng)細(xì)胞更接近于正常細(xì)胞，受損細(xì)胞數(shù)目明顯減少。結(jié)論0.002 5～25 μg/mL的右美托咪定預(yù)處理可減輕異丙酚誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠離體海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷。

右美托咪定；預(yù)處理；異丙酚；發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)；神經(jīng)細(xì)胞損傷；大鼠

嬰幼兒時(shí)期全身各系統(tǒng)尤其是大腦處于快速發(fā)育、成熟的階段。全身麻醉藥對(duì)嬰幼兒發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)的影響一直廣受關(guān)注。研究表明，異丙酚可導(dǎo)致未成年大鼠腦神經(jīng)系統(tǒng)受損，使發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞退行性改變，并且其影響可持續(xù)至成年[1]。右美托咪定為α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定具有器官保護(hù)及腦神經(jīng)保護(hù)作用[2]，可減輕七氟烷等吸入麻醉藥誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠神經(jīng)毒性[3，4]。關(guān)于右美托咪定對(duì)異丙酚誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠離體海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響少見(jiàn)報(bào)道。2014年3月～2015年3月，我們通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞，給予不同濃度的右美托咪定預(yù)處理，觀察其能否減輕異丙酚引起的發(fā)育期大鼠離體海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷，為臨床小兒麻醉合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康7日齡SD大鼠140只，體質(zhì)量12～16 g，雌雄不限，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DMED/F12培養(yǎng)基500 mL(GIB-CO公司)，胎牛血清(貴州鼎國(guó)生物科技有限責(zé)任公司)，胰蛋白酶(Worthington公司，美國(guó))；異丙酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液(Fresenius Kabi公司，德國(guó))，鹽酸右旋美托咪定(江蘇恒瑞藥業(yè)有限公司)，MTT(上海譜振生物科技有限公司)。

1.2 海馬神經(jīng)細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 大鼠斷頸處死，置冰盤(pán)上，在解剖顯微鏡下分離腦組織，于視交叉后1～2 mm沿冠狀面取海馬組織標(biāo)本，置于預(yù)冷的PBS液中并清洗。用剪刀剪碎腦組織，加入0.125%胰酶消化2 min，加入含10%胎牛血清的DMED/F12培養(yǎng)基終止胰酶反應(yīng)。200目濾網(wǎng)過(guò)濾、離心，加入新鮮培養(yǎng)基吹勻制成單細(xì)胞懸液。胎盤(pán)藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將海馬神經(jīng)細(xì)胞按照2×105～3×105/mL接種于6孔板、96孔板及50 mL培養(yǎng)瓶中。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后全量換液，以后每2天全量換液1次，相差顯微鏡定期觀察神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.3 海馬神經(jīng)細(xì)胞的鑒定 采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)免疫熒光染色法。細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS液沖洗細(xì)胞2次，4%多聚甲醛室溫條件下固定15 min。PBS沖洗，在4 ℃條件下用0.1% Triton-X-100透膜15 min。PBS沖洗，4% BSA室溫封閉30 min。用稀釋后的NSE一抗(1∶100)在4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜，PBS沖洗，37 ℃條件下加入二抗(1∶100)孵育1 h。最后用PBS沖洗3次，DAPI染細(xì)胞核并用熒光顯微鏡拍照。海馬神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)染色呈綠色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞形態(tài)呈樹(shù)突狀生長(zhǎng)。

1.4 細(xì)胞分組與處理 將體外原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、異丙酚組、右美托咪定預(yù)處理組。對(duì)照組正常培養(yǎng)；異丙酚組培養(yǎng)至第7天時(shí)，加入12 μg/mL異丙酚繼續(xù)孵育12 h；右美托咪定預(yù)處理組下設(shè)5個(gè)濃度組，分別加入0.002 5、0.025、0.25、2.5、25 μg/mL右美托咪定預(yù)處理30 min后，再加入12 μg/mL異丙酚繼續(xù)孵育12 h。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.5 海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用MTT法。取各組細(xì)胞加入MTT 20 μL/孔，置于CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL/孔，置于酶標(biāo)儀上，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度OD值。

1.6 海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 采用HE染色法。超凈臺(tái)中操作，取6孔培養(yǎng)板，用移液器在每孔內(nèi)滴加一滴PBS液，將蓋玻片放入，再用移液器將制備好的細(xì)胞懸液滴在蓋玻片上，于上述培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，讓生長(zhǎng)的細(xì)胞自然附著貼壁于玻片，制成細(xì)胞爬片。取蓋玻片(細(xì)胞面朝上)，蘇木精染色4 min，蒸餾水漂洗，1%鹽酸乙醇分色數(shù)秒立刻水洗，碳酸鋰返藍(lán)；0.5%伊紅染色，蒸餾水漂洗，95%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片固定。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 各組海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率比較 對(duì)照組、異丙酚組的神經(jīng)細(xì)胞存活率分別為92.93%±0.12%、24.37%±0.07%，右美托咪定預(yù)處理組加入0.002 5、0.025、0.25、2.5、25 μg/mL右美托咪定預(yù)處理后的神經(jīng)細(xì)胞存活率分別為39.95%±0.11%、52.04%±0.14%、57.18%±0.34%、61.70%±0.25%、74.93%±0.12%。與對(duì)照組比較，異丙酚組、右美托咪定預(yù)處理組神經(jīng)細(xì)胞存活率均降低(P<0.05或<0.01)。與異丙酚組比較，右美托咪定預(yù)處理組神經(jīng)細(xì)胞存活率均升高(P<0.05或<0.01)。右美托咪定濃度較高組的神經(jīng)細(xì)胞存活率高于濃度較低組(P均<0.05)。

2.2 各組海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化比較 對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)基本正常，胞體飽滿較大，軸突清晰，胞質(zhì)均勻，折光性強(qiáng)有明顯的立體感，大多數(shù)細(xì)胞呈錐形體、雙極、三角形或不規(guī)則形，多極突起交織成網(wǎng)狀并形成神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)支撐物。異丙酚組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞損傷，細(xì)胞體積變小、胞質(zhì)不均勻，空泡樣改變，胞核固縮深染，細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞。右美托咪定預(yù)處理組加入0.002 5、0.025、0.25 μg/mL右美托咪定預(yù)處理后，細(xì)胞損傷程度減輕，固縮深染的細(xì)胞核數(shù)量減少，2.5、25 μg/mL右美托咪定預(yù)處理后的神經(jīng)細(xì)胞更接近于正常細(xì)胞，軸突較清晰，體積變小的細(xì)胞及固縮深染的細(xì)胞核數(shù)目明顯減少。

3 討論

異丙酚是臨床小兒全身麻醉中常用的靜脈麻醉藥。異丙酚的主要效應(yīng)靶點(diǎn)為GABA受體，通過(guò)激動(dòng)GABA受體降低興奮性突觸傳遞而產(chǎn)生全麻作用。Jin等[5]報(bào)道，在腦發(fā)育高峰期，過(guò)度激動(dòng)的GABA受體可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并引起遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶缺陷。我們的前期研究[6]證實(shí)，12 μg/mL異丙酚作用24 h可引起發(fā)育期大鼠離體海馬神經(jīng)細(xì)胞顯著凋亡；另有研究[7，8]證實(shí)，異丙酚可對(duì)發(fā)育期大鼠神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生損害作用，作用于不同神經(jīng)通路導(dǎo)致突觸可塑性改變，損害其認(rèn)知及記憶功能。右美托咪定為高選擇性激動(dòng)α2腎上腺素能受體，具有良好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛效果，目前逐步應(yīng)用于小兒臨床麻醉及ICU鎮(zhèn)靜中[9]。邑俊華等[10]報(bào)道，0.01～100 μmol/L右美托咪定預(yù)處理可減輕甚至逆轉(zhuǎn)異丙酚對(duì)胎鼠的神經(jīng)毒性作用。另有研究[3，11]顯示，右美托咪定能改善不同全身麻醉藥誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠神經(jīng)損害。在大腦皮質(zhì)損傷過(guò)程中，右美托咪定可以抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[12]。

海馬是腦內(nèi)學(xué)習(xí)記憶形成、發(fā)生的重要結(jié)構(gòu)，其對(duì)不良刺激造成的損傷最為敏感。嚙齒類(lèi)動(dòng)物的大腦發(fā)育高峰期出現(xiàn)于出生后7 d[8]，此時(shí)期腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞及突觸等神經(jīng)結(jié)構(gòu)快速發(fā)育，同時(shí)也是大腦最易受損的時(shí)期。因此本研究選擇7日齡的發(fā)育期大鼠作為研究對(duì)象，將其海馬神經(jīng)細(xì)胞離體培養(yǎng)至第7天(生長(zhǎng)狀態(tài)最活躍)，然后進(jìn)行藥物處理。結(jié)果顯示，異丙酚組神經(jīng)細(xì)胞存活率明顯降低，光鏡下可見(jiàn)海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷明顯；而加入0.002 5、0.025、0.25、2.5、25 μg/mL右美托咪定預(yù)處理后再加入異丙酚，海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率升高，海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷程度減輕。提示右美托咪定預(yù)處理能夠減輕異丙酚誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠離體海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷，且濃度較高組的效果更佳。葛東健等[13]報(bào)道，右美托咪定可減輕利多卡因誘發(fā)大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡，本研究結(jié)果與其相符。

綜上所述，在0.002 5～25 μg/mL范圍內(nèi)，右美托咪定預(yù)處理能夠減輕異丙酚對(duì)發(fā)育期大鼠離體海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用。本研究目前僅限于離體海馬神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)，后續(xù)我們將通過(guò)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究右美托咪定對(duì)異丙酚誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶障礙的影響。

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2017-03-17)