HBV DNA整合與肝癌關系的研究進展

方向，鄧偉

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院 廣西壯族自治區腫瘤防治研究所，南寧530021)

·綜述·

HBV DNA整合與肝癌關系的研究進展

方向，鄧偉

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院 廣西壯族自治區腫瘤防治研究所，南寧530021)

乙型肝炎病毒(HBV)與人基因組整合在肝細胞癌發生和發展過程中發揮關鍵作用。目前研究表明，HBV包含編碼表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X蛋白的4個開放閱讀框(ORF)，均可以形成斷裂位點整合到人基因組，其整合率從高至低依次是X區、S區、C區和P區。HBV在人染色體上的整合位點并非隨機分布，而是存在與肝癌相關的潛在優勢整合位點，這些優勢整合位點附近的基因常常涉及到細胞生長、增殖、分化和永生化。HBV DNA整合入人基因組后，通過影響整合位點周圍基因功能、形成具有致癌作用的HBV截短蛋白以及增加人染色體的不穩定性促使肝細胞的癌變。

乙型肝炎病毒；DNA整合；肝細胞癌；宿主基因組；遺傳信息；染色體異位；堿基缺失

肝細胞癌(簡稱肝癌)是常見惡性腫瘤之一，發病率居惡性腫瘤的第3位。全球每年有大約60萬人死于肝癌，其中將近一半發生在中國[1]。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是我國肝癌最重要的危險因素，在HBV慢性感染期間，HBV可以通過DNA整合來影響整合位點周圍基因功能，破壞或促進對細胞生長和分化至關重要基因的表達，從而促進肝細胞惡性轉化[2]。目前研究[3～6]證實，HBV DNA可通過整合進入宿主基因組促使肝細胞癌變。現將HBV整合與肝癌關系的研究進展綜述如下。

1 HBV整合的機制與特點

1.1 HBV整合機制 1980年人們首次在HBV相關性肝癌患者體內中檢測到HBV DNA與人染色體整合[7]。HBV復制過程中存在反轉錄這一特殊階段，人體感染HBV后，HBV病毒成熟體通過黏附進入到肝細胞，HBV DNA疏松的環狀結構(rcDNA)首先轉變為閉合環狀DNA(cccDNA)，接著cccDNA轉錄為前基因組RNA(pgRNA)進入細胞質，然后反轉錄為rcDNA，rcDNA再次進入肝細胞核循環。在cccDNA的循環中，部分rcDNA可能復制失敗，形成雙鏈線型DNA(d1DNA)，d1DNA可以在斷裂DNA修復過程中再次整合入宿主基因。同時，HBV感染可造成其雙鏈DNA斷裂(DsBs)，DsBs修復途徑可以把不同來源的非鄰近的DNA片段拼接起來，這就為HBV整合入宿主基因提供了分子基礎。HBV整合至宿主基因組中有利于其持續感染，長期慢性炎癥可以導致肝細胞生命周期改變和增殖，增加宿主基因組DNA終端數量，反過來又有利于HBV DNA整合到宿主基因組中[8]。

1.2 HBV整合特點 HBV是具有松弛環形部分雙鏈的DNA病毒，全長3 200 bp，由長短2條鏈組成。其中長鏈為負鏈，攜帶編碼HBV蛋白的所有遺傳信息，其包含編碼表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X蛋白的4個重疊的開放閱讀框(ORF)。理論上4個ORF均可以形成斷裂位點插入到人基因組，但研究發現它們整合的頻率并不相同，其整合率從高至低依次是X、S、C、P，目前尚無完整HBV DNA整合到人基因組的病例報道。HBV這4個ORF在與人染色體整合后會重新排列，這種排列紊亂會導致基因表達異常，如果這種異常不斷疊加，最終會促使細胞癌變。

X基因是HBV DNA中最小的一個ORF，Jiang等[9]對癌組織與癌旁組織進行對照，發現癌組織和癌旁組織中均存在整合，HBV整合部位平均分布在DR1和DR2附近。但屠紅等[10]對40例肝癌病例整合位點的研究發現，HBV DNA整合可發生在X基因的任意長度，并非只出現在HBV DR1和DR2區，X基因有96%以截短形式插入宿主細胞DNA。研究表明，C-末端截短的HBX可以通過Stat3/Nanog級聯反應增強肝癌干細胞樣特性，在肝癌發生發展過程中發揮重要作用[11]。另外，C-末端截短的HBX可以促進CD133肝癌干細胞亞型的出現，并在肝癌中表現出惡性和干細胞樣特征，通過激活法尼酯衍生物X受體(FXR)介導癌癥干細胞作用[12]。HBX蛋白作為反式激活因子，可以影響調節性非編碼RNA(ncRNA)，包括microRNA和長ncRNA，HBX也參與表觀遺傳修飾和DNA修復，HBX與各種信號轉導途徑相互作用，如p53、Wnt和核因子-κB通路[13]。另外，X蛋白還可引起肝癌中p21、p16、p62myc、c-myc、p2lras等癌基因和抑癌基因高表達[14，15]。另一個經常出現斷裂整合的HBV基因是pre-S2/S基因，其編碼3種不同結構相關的包膜蛋白，pre-S2蛋白可以作為反式激活因子，并與人端粒酶逆轉錄酶基因(hTERT)啟動子相互作用，增加端粒酶活性[16]。pre-S2/S基因還可以產生截短的pre-S2/S蛋白，在大量肝癌組織中可以檢測到截短的pre-S2/S蛋白，這種截短的蛋白有與c-myc和c-fos相類似的反式激活作用，可以通過激活與轉錄相關的級聯反應，提高肝細胞的增生率[17]。

HBV整合可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型，Ⅰ型整合起始于DRl向負鏈3端延伸；Ⅱ型整合也起始于DRl，但延伸方向和Ⅰ型相反；Ⅲ型整合起自DR2向負鏈3端延伸；Ⅳ型整合也起自DR2，延伸方向和Ⅲ型相反。Chauhan等[18]報道，土撥鼠在感染HBV和土撥鼠肝炎病毒1 h后，其肝組織內可以檢測到HBV和土撥鼠肝炎病毒DNA及其復制中間體，同時可以檢測到HBV DNA整合到宿主基因中，在感染后1 h和3 h可以檢測到土撥鼠肝炎病毒X和pre-S序列插入宿主基因組。該研究證實自然條件下的肝炎病毒在入侵后不久就可以整合入肝細胞DNA。

2 HBV在人染色體上的整合位點

目前在人23對染色體中均發現HBV DNA的整合，因此有學者認為，HBV DNA在人染色體中的整合是隨機的[19]。但是，隨著對HBV DNA整合研究的深入以及第二代測序技術的發展，越來越多的整合位點被發現。有研究表明，在癌組織中，HBV在染色體5、8、10、19中整合常見，在癌旁組織中，HBV在1號和2號染色體上整合更常見；每個染色體上的整合位點數量與非腫瘤組織中脆性位點的數量相關，而與肝癌組織無關[20]。Zhao等[22]發現，HBV傾向于整合在染色體脆性位點和包括CpG島的功能基因區，并且優先整合17號染色體[21]。近年研究顯示，HBV整合存在相對熱點區段，HBV整合傾向于發生在染色體轉錄區域和重復序列，包括長散布核元素(LINE)、短散點核因子(SINE)和Alu序列。盡管目前所發現的熱點整合位點只能代表總體事件中的一小部分，但是反復發生的整合插入位點表明HBV存在與肝癌相關的潛在優勢整合位點。最常見的HBV整合事件位于TERT和骨髓/淋巴或混合白血病4(MLL4)，TERT在覆蓋細胞衰老中起重要作用，細胞衰老通常在大多數癌細胞中上調，MLL4編碼組蛋白甲基轉移酶，其在癌基因組的表觀遺傳修飾中具有關鍵作用。目前已經發現的HBV DNA在人基因組上整合的腫瘤相關靶基因有100多個，包括MLL4、TERT、纖連蛋白1、SMAD家族成員5SMAD5、細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白E1、Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子GEF12、磷酸酶和肌動蛋白調節物4、鈣信號相關基因、RNA結合蛋白fox-1同系物、醇脫氫酶1B、氨基甲酰磷酸合成酶1、雌激素相關受體γ、視黃酸誘導的1、CTD小磷酸酶、低密度脂蛋白相關性蛋白1B、sentrin特異性肽酶5、PDGF受體等，這些基因涉及到細胞生長、增殖、分化和永生化。

3 HBV DNA整合致肝癌的主要機制

Jiang等[23]報道，在60例HBV相關性肝癌患者癌組織及癌旁組織中都存在相同的X基因C-末端截短基因，此外，兩組的病毒序列具有相似的C1653T、A1762T/G1764A低頻率突變，HBV插入的頻率和模式在癌組織和癌旁組織之間相似，表明大部分HBV DNA整合事件與肝癌的發生無關。關于HBV整合的致癌機制，有研究認為HBV整合的相關基因突變和HBV整合引起的染色體穩定性改變與肝細胞癌變有關。但是，目前普遍認為HBV整合導致肝癌的機制包括以下3個方面。

3.1 影響整合位點周圍基因的功能 Cao等[24]使用名為“病毒掃描”的生物學信息系統，在3例肝癌患者癌組織中發現HBV整合到KMT2B基因，但對應的癌旁組織未發現，由此推測HBV整合誘導宿主驅動基因的改變可能會促使病毒癌基因表達和肝癌進展。HBV基因組攜帶著諸多轉錄調控相關元件，如增強子1、增強子2、負性調控元件、核心上游調節序列、基本核心啟動子等，HBV DNA通過整合嵌入人基因的轉錄調控區域，通過這些調控元件影響HBV整合位點周圍基因功能，從而導致肝癌發生。

3.2 形成具有致癌作用的HBV截短蛋白 在HBV相關性肝癌中存在有大量截短的X蛋白，Tu等研究顯示，全長的X蛋白可以抑制ras與myc引起的集落生長的功能，截短的X蛋白可以加強ras與myc的轉化功能。整合的HBV DNA能夠表達合成成熟的pre-S/S和X蛋白觸發級聯信號轉導，同時也可以促使肝細胞惡變。

3.3 增加人基因的不穩定性 HBV DNA整合到人基因組可引起人染色體DNA的缺失和易位以及細胞DNA的擴增和融合轉錄產物的產生，從而增加基因組DNA的脆性和不穩定性。在肝癌組織中可以檢測到17p13、4q32、llpl4、4q32、11q13等區域的小片段缺失，有研究[25]在肝癌組織中發現HBV DNA整合位點兩端出現17號與18號染色體易位，并且18號染色體整合位點附近出現堿基缺失。

4 展望

目前已經初步探明了HBV的整合機制，并檢測到了一些常見整合位點和受累基因，其中Pang等[26]通過量化HBV DNA與肝癌患者白細胞基因組的整合，確定OR4F3和OR4F17的組合是HBV相關疾病的新型潛在生物標志物。但是，對于HBV DNA整合導致肝細胞癌變的確切機制目前尚不完全清楚。HBV DNA整合與肝癌的關系非常復雜，不僅需要精心設計的流行病學研究，還需要對常見整合基因進行體外細胞功能試驗和動物模型試驗，為肝癌的預防和治療提供理論基礎和實驗依據。

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1002-266X(2017)42-0102-03

國家自然科學基金資助項目(81260319)。

鄧偉(E-mail: 9608946@qq.com)

2017-06-21)