超聲波輔助花粉介導轉基因方法的研究進展

王長彪，杜建中，趙興華，劉 江，郝曜山，張歡歡，韓 斌，孫 毅

（山西省農業科學院生物技術研究中心，山西太原030031）

超聲波輔助花粉介導轉基因方法的研究進展

王長彪，杜建中，趙興華，劉 江，郝曜山，張歡歡，韓 斌，孫 毅

（山西省農業科學院生物技術研究中心，山西太原030031）

超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法是擁有國內自主知識產權的植物轉化手段，該方法在玉米、油菜、花生等作物上的轉化研究均取得積極進展。為較詳盡了解國內外應用該方法進行植物轉化研究的現狀，針對該方法與其他植物轉化方法比較所體現出的優勢以及存在的問題進行了總結，以期為相關研究者提供一些參考資料，并為該方法的進一步改進完善提供依據。

植物；花粉介導；超聲波；轉化方法；進展

植物基因工程的誕生是全球農業生產史上的又一次革命，它的發展為農業、農村和農民帶來了巨大的經濟效益和環境效益。作為一個系統工程的植物基因工程，包括諸多內容，就其轉化方法而言，世界上通用的、應用范圍也較廣的植物轉化方法目前有農桿菌介導法[1]、基因槍法[2]、花粉管通道法[3]，還有一些相對應用較少的方法如PEG介導法[4]、電穿孔法[5]等，以及上述方法的改良衍生轉化體系，這些方法是植物基因工程領域的關鍵技術手段，為全球植物轉基因研發和產業化作出了巨大貢獻。筆者要討論的是最近10多年新發展起來的一種有花植物轉化方法，超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法的構思和摸索起步于20世紀90年代，并于1999年第一次申請并獲得國家發明專利[6]，后因專利時效問題，于2011年再次申請國家發明專利并被授權[7]。該發明方法以植物花粉作為受體，以質粒DNA或其他攜帶有調控目的基因轉錄啟動子和終止子的DNA作為供體，采集的花粉于最佳等滲溶液（5%～50%的蔗糖溶液）中進行第1次超聲波處理，使花粉處于感受態，并使花粉粒上可能存在的核酸酶失活，避免這種核酸酶對其后加入的外源DNA的降解或破壞；然后在等滲液中加入目的DNA片段，進行第2次超聲波處理，通過超聲波的輔助作用使目的基因進入到感受態花粉中（整個處理過程花粉溶液都處在低溫冰浴內）；接著把處理好的花粉授到植物柱頭上，并收獲其種子；來年將收獲的種子播種，在播前對萌發種子和幼苗進行2次篩選，得到抗性苗；然后對成苗株取樣進行PCR擴增及Southern雜交檢測，確定轉化事件。該方法無需耗時冗長的組織培養過程，突破了物種及基因型依賴性。眾多研究表明，該方法的使用不僅節省了人力物力，縮短了轉基因育種年限，還提高了植物轉化效率。關于超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法的推廣應用，山西省農業科學院生物技術研究中心自2009年起先后舉辦了6屆全國性的技術培訓會議，起到了很好的宣傳推廣效果，也引發研究者對該轉化方法的廣泛關注和應用。

1 超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法的原理及其可行性驗證

超聲波是物質介質中的一種彈性機械波，既是一種波動形式，又是一種能量形式。這種能量形式在其達到一定劑量并在溶液或細胞內傳播時，能引起溶液或細胞的功能和結構發生變化，即產生了超聲生物效應。超聲波處理花粉主要是利用了超聲波的空化效應和機械效應。空化效應是在超聲波處理時，溶液或花粉內液形成空泡，空泡的震動與其迅猛的閉合會產生出沖擊波，正是這種沖擊波，可使花粉萌發孔瞬間打開或花粉破裂；同時空化泡破裂時產生的數千度高溫和數百萬帕的高壓，可使溶液中水分子電離，產生OH－離子和H+，由此所誘發的氧化還原反應可使花粉粒上一些酶類失活。超聲波機械效應是指超聲波在傳播過程中引起介質質點發生的壓力變化，這種變化能破壞細胞的結構。

超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法的原理就是利用超聲波的空化效應和機械效應所產生的強大沖擊力對花粉結構引發的改變，使花粉萌發孔瞬間打開，并借助這種沖擊力使外源基因擁有能夠進入花粉細胞內的動力。

花粉是種子植物特有的結構，相當于一個小孢子和由它發育的前期雄配子體，攜帶有植物的全部遺傳信息。花粉授粉到同種植物柱頭上，完成授粉過程，孕育下一代植株的誕生，所以，花粉是有花植物遺傳和變異的重要器官。花粉是有生命的，花粉生活力是指花粉具有存活、生長、萌發或發育的能力[8]，與花粉自身的遺傳特性和外界因素有著極其密切的關系[9]。田間自然狀態下，水稻花粉壽命只有10 min；玉米花粉僅為1 d；菊花花粉為1～2 d。即便都是新鮮花粉，不同物種花粉的生活力也不盡相同，據報道，在均為新鮮花粉前提下，僵麥草花粉的生活力為100%，節瓜花粉為90%[10]，杏花粉僅為80%[11]。

溫度、儲藏介質、超聲波處理等因素對花粉生活力都有一定的影響，現敘述如下。

據報道，煙草花粉在-5℃可保存1 a，仍正常萌發[12]，蘋果-15℃可保存9個月，萌發率95%[13]，玉米5～10℃，可保存5 d，正常萌發[14]，水稻12℃可保存24 h[15]。溫度對不同物種花粉生活力的影響有明顯差異。對于超低溫的影響，1922年，KNOWLTON[16]研究表明，金魚草花粉在-180℃儲藏仍有活力；VISSER[17]的研究證明，番茄、西洋梨和杜鵑花的花粉在-196℃儲藏，花粉活力沒有明顯改變；WANG等[18]研究認為，番茄花粉在4，-196℃可保存1～3 d，延長保存時間，花粉生活力會急劇下降。對于高溫的影響，BARROW[19]發現，高溫對棉花花粉生活力影響較大，43℃時所有花粉失去生活力；劉自剛[20]采用在不同溫度下干燥處理桔梗花粉的方式，研究處理后不同儲藏時間內花粉的生活力，結果表明，30℃下花粉培養1.5 h是最佳條件。干燥箱、日曬、自然放置等不同干燥方式和處理時長，桔梗花粉萌發率和花粉管長度均有所下降，其中，45℃烘干1.5 h處理的花粉結實率下降速度最慢，保存5 d還能授粉結實。

花粉儲藏的介質，多以水、無機溶液和有機溶液作為研究對象。王霞等[21]在對玉米花粉做EMS誘變處理時發現，配制EMS溶液的介質不同，處理條件下玉米的結實率明顯不同，離體花粉在5%的蔗糖溶液處理效果最好，但處理時長超過30 min后，結實率下降，蒸餾水處理花粉的結實率幾乎為0，而使用石蠟油作為介質，處理10～30 min效果最佳，處理時間延長，結實率下降；呂仲賢等[22]發現，通過擴散和滲透，玉米花粉中的營養成分進入介質水中，且花粉泡水會對花粉壁造成傷害；曹敏建等[23]的研究證明，蔗糖濃度過高會造成原生質脫水，抑制花粉萌發；劉雪蓮等[24]報道，花粉培養介質中加入一定質量濃度的硼酸，可促進紫丁香花粉的萌發和花粉管生長，但不能過量，過量的硼酸會使花粉生活力下降[25]；張立磊等[26]研究蔗糖，硼酸，CaCl2，MgSO4，ZnSO4這5個因素不同濃度對豐花月季花粉生活力的影響，結果表明，按對花粉萌發的影響從大到小依次為蔗糖＞硼酸＞ZnSO4＞CaCl2＞MgSO4，前三者在一定濃度下對花粉的萌發有較大的促進作用，蔗糖最佳濃度為100 g/L，但超過最佳濃度時會起抑制作用，在一定濃度范圍內，ZnSO4濃度對花粉的萌發率影響是先降后升，MgSO4濃度變化對花粉活力無影響。鈣離子對花粉生活力的影響也很大，過少或過多的鈣都會限制花粉和花粉管的生長[27]。

岳新麗等[28]用超聲波處理葡萄花粉，發現超聲波處理各參數對葡萄花粉有極顯著影響，超聲波處理參數以功率100～120 W，處理時間4～5 s，間隙時間2～6 s，處理6次的組合為最佳處理方法，既能保證花粉完整率和萌發率穩定，又不破壞外源基因DNA片段，GUS活性組織定位檢測結果表明，轉化率為4‰。胡雪嬌等[29]采用溫差-超聲波結合的方法對核桃花粉進行破壁處理，發現在料液比1∶15 g/mL、溫差110℃、冷凍時間18 h、超聲時間35 min、超聲功率720 W時，核桃花粉破壁率為83.79%，可見超聲波處理強度和時長對花粉生活力的影響有多大；崔貴梅等[30]研究發現，超聲波處理對花粉的生活力和萌發率都有影響，超聲波處理后，花粉生活力下降50%，萌發率下降更嚴重，因此，超聲波輔助的花粉介導轉化方法結實率較低，空穗率達60%左右，結實穗也僅有幾粒種子，多者二三十粒，雖然結實率低，但本方法的實際轉化率卻最高達28%以上。

關于外源DNA導入花粉及導入外源DNA后花粉生活力的證據，這方面的嘗試最初是花粉粒與外源DNA混合培養，HESOLP-HARRISON[31]發現，外源DNA能透過水合花粉的內壁；O'DRISCOLL等[32]認為，外源DNA可通過花粉管尖端的胞吞作用進入花粉內，但HESOLP-HARRISON等[33]和KRANZ等[34]卻提出了相反的觀點；甚至LANGRIDGE等[35]還指出，通過花粉途徑進行谷物轉化是很難的，他們甚至還證明了早期的一些研究成果大概有人為創造之嫌；不過類似研究并未種植，隨后的研究者又試圖用顯微注射法、電激法、基因槍法、激光微束法等解決外源基因導入花粉粒問題，如KRANZ等[34]通過玉米花粉萌發孔注射質粒DNA獲得成功，隨后用電激法、基因槍法等也成功將外源DNA導入花粉粒，這些研究結果經分子雜交實驗、GUS組織化學分析、電鏡觀察和共聚焦激光掃描顯微鏡觀察等手段均得到證實；但是證明外源DNA能夠進入花粉且能夠保證花粉具有一定的生活力還不夠，對這些攜帶外源基因的花粉的育性大小還需要詳細探討[36]；LEONNE等[37-38]將轉化的花粉授粉于原品種柱頭后發現可正常結實；2013年，李娜等[39]把綠色熒光蛋白基因GFP轉入玉米離體花粉中，對轉化花粉進行體外培養和人工授粉，用熒光顯微鏡觀察GFP基因在花粉、花粉管以及胚中的表現，發現轉化胚與非轉化胚均有強烈熒光，認為以花粉粒熒光反應作為花粉轉化依據不可靠；同時還發現，轉化花粉人工授粉后，被授粉植株的花粉管和胚中均有GFP表達的熒光反應，認為后兩者可作為花粉介導轉化的證據，授粉植株的種子播種后得到轉化植株及后代。李娜等再次以充分證據證明花粉介導轉化方法可將外源DNA導入花粉中，并能獲得轉基因植株。

2 超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法的研究進展

超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法（簡稱花粉介導法）的最早研究報道見于1997年。1999年，王景雪等[40-41]研究表明，于1997年采用花粉介導法將幾丁質酶基因導入玉米自交系太9101、綜31等材料，獲得轉化植株，轉化率高達42.9%，并認為本法簡單、易操作、實用且省時；2002年，梁雪蓮等[42-43]采用注射法、花粉介導法和萌動胚法轉化bar基因導入玉米黃糯、白糯、金黃96C等中，均獲得了轉化植株，但3種轉化方法結實率分別為1%，3%～4%，3%～4%，從轉化目的性看，后兩者也強于注射法，進一步分析發現，同種試驗條件下，這3種方法的轉化率高于基因槍法和農桿菌介導法，且不需組培和再生過程，省時省力；同一年，陳定虎[44]研究表明，采用花粉介導法將攜帶PAP基因的植物轉化載體導入玉米材料中，獲得了32粒種子，播種得到9株植株，經PCR檢測得到5株有目的基因存在的植株，再經Southern，Western等雜交檢測得到1個轉化事件，對其后代的抗病鑒定發現，接種病毒后，非轉化株系7 d后發病，而轉化植株直到25 d時也未發病；解志紅[45]采用花粉介導法將幾丁質酶基因轉化棉花遠緣雜交高代材料海208、海209，轉化率達到32%；2004年，王節之等[46]采用花粉介導法將幾丁質酶基因導入谷子品種晉谷21號不育系，T1PCR檢測獲得7個陽性植株，T2株系先噴除草劑篩選，存活植株做抗病鑒定，結果顯示，轉基因谷子株系的黑穗病發病率明顯低于非轉化的對照株系，最終獲得了雙抗植株；杜春芳等[47-48]利用花粉介導法將GUS基因導入油菜晉油7號，GUS組織化學分析和活性檢測均證明，GUS基因導入花粉粒且收獲到授粉植株的種子，進一步檢測獲得6個轉化植株；2006年，梁雪蓮等[49]利用花粉介導法將抗蟲基因CpTI導入花生品種仲愷01號，就蔗糖濃度、超聲波處理等對花粉生活力的影響進行了研究，結果表明，對于花生的花粉，蔗糖濃度以10%最佳，超聲波強度為100 W時，花粉無損傷，200 W時，細胞結構完整，但細胞壁受損，300 W時，花粉解體，同時染色觀察結果還發現，超聲波強度為200 W時，花粉仍具有生活力；2007年，WANG等[50]以花粉介導方法把帶有GUS基因和NPTII基因的質粒DNA導入高粱雄性不育系A2V4A，經GUS活性分析等檢測，證明獲得了轉基因材料；2008年，WANG等[51]將抗草甘膦基因aroA-M1用花粉介導法轉入油菜品種雜71和雜74，經PCR，Southern等分子檢測，證實獲得了抗草甘膦除草劑的轉基因植株；雷海英等[52]采用花粉介導法將玉米矮花葉病毒復制酶基因NIbT導入玉米自交系金黃96C，金黃96B，478，C649等材料中，獲得了轉化植株，田間接種病毒結果顯示，非轉化對照植株全部為病毒敏感或高敏感材料，而轉基因植株多為抗病毒或高抗病毒感染的材料；杜建中等[53]以花粉介導法將水稻幾丁質酶基因導入玉米自交系海92-1中，獲得了5株轉基因植株，對其后代株系進行抗病鑒定，結果發現，轉基因株系植株的抗病性比非轉化對照株系提高1～2級；2009年，魏玉杰等[54-55]以花粉介導法將蘿卜抗菌肽基因和卡那霉素抗性標記基因轉入野罌粟花粉并給野罌粟授粉，PCR初步檢測得到4個PCR檢測陽性植株，并發現110 g/L蔗糖濃度為野罌粟花粉最佳處理介質，蔗糖濃度與處理時間對處理花粉授粉后的結實率影響達顯著水平，后代植株在田間進行卡那霉素涂抹試驗，結果與PCR檢測結果相同，最突出的是野罌粟處理花粉授粉后的結實率達到80%；2010年，任小燕等[56-57]采用花粉介導法把山菠菜膽堿單加氧酶（AhCMO）基因導入玉米自交系鄭58中，對獲得的轉化植株的第2代進行耐鹽性鑒定，發現在鹽脅迫濃度為250 mmol/L時，轉基因玉米植株的超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性及葉綠素含量分別比非轉基因玉米提高2%～208%，22%～65%和8%～61%，而丙二醛（MDA）含量比非轉基因玉米低3%～93%，生理指標測定結果證明，轉化耐鹽基因CMO賦予了轉化植株的耐鹽性，轉化植株的耐鹽性比對照提高1～3級；2011年，韓凱[58]采用花粉介導法將EPSPS基因和谷氨酰胺合成酶基因（GSI）導入玉米玉美頭品種中，獲得了轉化植株，轉化率為4.17%，高于基因槍法的轉化率；王秀紅等[59]利用花粉介導法以玉米自交系鄭58、昌7-2和PH6WC為受體，把小麥耐低磷調控基因TaPHR1和GFP的融合蛋白基因TaPHR1∶∶GFP轉入受體中，獲得了轉化植株，轉化效果以鄭58為最佳，收獲種子發芽做GFP熒光觀察，發現目的基因已經表達；張婷婷等[60]采用花粉介導法將抗逆性相關受體類蛋白基因（OsSIK1）轉入玉米自交系材料98-2-19、鄭58、昌7-2中，發現鄭58和昌7-2更適合用作本方法的轉化材料，收獲種子播種后取樣PCR檢測，昌7-2的PCR陽性結果率高達74%以上，證明花粉介導法的高效性；林春晶等[61]利用花粉介導法（有改良）將玉米植酸酶基因phy轉入玉米品種，經PCR和RT-PCR檢測，證明得到轉化植株，目的基因也得到轉錄表達；2012年，宋鑒達等[62]利用經過改良的超聲波處理花粉方法將植酸酶基因phy和bar基因轉化到玉米品種鄭單958中，經分子檢測，獲得了轉化陽性植株，轉化受體中目的基因的表達和效能正在進一步研究；同年，郝曜山等[63]以玉米自交系昌7-2及鄭58為受體，采用花粉介導法將雙價抗蟲基因BmkIT-Chitinase分別導入受體材料中。對獲得的T0代1 563粒種子，進行卡那霉素初篩，并連續4代對轉化植株后代株系進行分子檢測，最終獲得20個轉化株系，抗病鑒定獲得16個抗病株系，農藝性狀的調查結果證明，轉化方法對受體植株其他農藝性狀沒有太大影響；2013年，馬倩倩等[64]以黃花梨花粉為載體，將綠色熒光蛋白基因GFP導入黃花梨植株，獲得了轉化植株，轉化率為3%，通過對花粉等滲液、超聲波強度等參數的分析，建立了黃花梨遺傳轉化體系。

3 超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法的優缺點

花粉介導法能在植物轉基因研發實踐中被大量采用，就足顯本方法的適用性。花粉介導法的優勢為：（1）方法簡單易操作，無需貴重精密儀器設備，如基因搶、組培間等，而且研發場地只要符合轉基因安全條例規定即可，所以，操作起來相對簡單；（2）適用范圍廣，只要是有花植物，理論上都可采用本方法進行遺傳轉化研究，不存在單子葉植物還是雙子葉植物之分，解決了一些難以組培再生植物的轉化難題；（3）節省時間和人力，不需要冗長的組織培養和再生過程，與農桿菌介導法、基因槍法比較，能省時、省力；（4）轉化效率高，有資料顯示，相對于其他轉化方法（轉化率多為3%～5%或稍高），大部分植物采用此法的轉化效率都在15%以上；（5）便于常規育種專家的利用，因為方法簡單易操作，常規育種專家也能現學現用，有利于植物轉化方法的推廣應用等。但花粉介導法也有其劣勢的一面，如轉化時期受植物生長季節的約束；對于花粉較少的或不易采取花粉的植物而言，此法有其局限性；如何提高處理花粉授粉后的結實率也是本方法需要攻關的難題等。

總之，花粉介導法的發明與推廣應用業已產生了很好的效果。SUSAN[65]曾評論，發展非組培植物轉化方法是所有生物技術學家的夢想，因為這種方法既能打破植物轉化的基因型壁壘，又能廉價、快速地得到轉化植物，所以，這種基因導入方法倍受期待。油菜、高粱等作物的成功是谷物花粉轉化領域的一次革新。

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Research Progress of the Ultrasonic Assisted Pollen-mediated Transgene Method

WANGChangbiao，DUJianzhong，ZHAOXinghua，LIUJiang，HAOYaoshan，ZHANGHuanhuan，HANBin，SUNYi

（Research CenterofBiotechnology，ShanxiAcademy ofAgriculturalSciences，Taiyuan 030031，China）

Ultrasonic assisted pollen-mediated planttransgene method is a planttransformation means with domestic independent intellectualproperty rights.Ithas made some positive progress during using to transfer maize,rape,peanut plants and other crops.To understand status quo ofthis means used in planttransformation research athome and abroad in more detail,and its possible application prospect,to knowmore aboutthe application status and research progress ofthe method，this papermakes a briefsummary ofthe research on this method at home and abroad,hoping to provide some reference for the related researchers,and to provide the basis for future improving the method.

plant;pollen-mediated;ultrasonic wave;transformation method;progress

Q943.2

：A

：1002-2481（2017）09-1571-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.09.41

2017-07-31

山西省重點研發計劃項目（201603D221025-2）；山西省農業科學院種業發展專項（2016ZYZX50）；山西省農業科學院重點攻關項目（YGG1624）；國家轉基因生物新品種培育重大專項（2014ZX08003001-002-003，2016ZX08003001-002-003）

王長彪（1975-），男，山西祁縣人，助理研究員，碩士，主要從事分子育種研究工作。孫 毅為通信作者。