轉Cry5 Aa基因棉花品系的遺傳穩定性研究

王峰　周仲華

摘要：為檢測轉Cry5Aa基因棉花品系的遺傳穩定性，為品種安全性評價提供依據，本研究結合大田性狀比較、卡那霉素檢測和PCR分子檢測，研究轉Cry5Aa基因棉花品系雜交后代遺傳特性和群體遺傳特性的穩定性，結果表明：F1代均為抗性個體，F2代正反交組合抗性分離比例均接近3：1，表明外源基因為顯性并穩定插入到基因組中，說明JX0010品系抗蟲性狀純合度高，性狀一致性好。

關鍵詞：轉基因；Cry5Aa；棉花；遺傳穩定性

中圖分類號：S562.035 文獻標識碼：A 文章編號：2095—3143（2016）06—0003—04

DOI：10.3969/j.issn.2095-3143.2016.06.001

0引言

從20世紀80年代初開始，育種學家應用分子生物學手段，將外源抗蟲基因轉入農作物體內以期獲得轉基因抗蟲品種。1987年Agracetus公司第一次以柯字312為受體培育成功遺傳工程棉，中國農業科學院生物技術研究所郭三堆等，1992年通過人工合成（Bt）GFM-CryIA殺蟲基因和能在棉花體內高效表達的調控元件序列，培育成功擁有自有知識產權的轉基因抗蟲棉品種并在全國大力推廣，目前我國轉基因抗蟲棉占棉花種植面積的一半以上。但是，含Cryl4單價抗蟲基因的棉花品種在我國棉花生產中已推廣應用10多年，棉鈴蟲對Bt基因耐受性逐年增加，抗性風險已越來越大。Cry5Aa基因是兼抗鱗翅目害蟲及線蟲的抗蟲基因，本課題組2001年將Cry5Aa基因采用花粉管通道法導人“湘棉12號”，2002年夏獲得轉基因抗蟲棉株系，2003年育成轉基因抗蟲棉品系（代號為JX0010）。作為一個新的轉基因抗蟲棉品系，其遺傳穩定性對于該品系的應用具有重要的意義，因此，作者結合大田性狀比較、卡那霉素檢測和PCR分子檢測，研究其雜交后代遺傳特性和群體遺傳特性的穩定性，為該品系的應用提供依據。

1材料與方法

1.1材料

棉花遺傳標準系TM-1、中棉所12號均由中國農業科學院棉花研究所棉花種質資源室提供，湘棉10號、轉Cry5Aa棉花品系JX0010均由湖南農業大學棉花研究所提供。

1.2試驗時間及地點

2007年和2008年分別在湖南省南縣民山頭大木橋二組、華容縣菜市鎮橋頭村五組、常德市鼎城區牛鼻灘鄉三星村、大通湖區河壩鎮慶成村、澧縣張公廟五組和湖南農業大學棉花研究所校內科研基地共6個地點進行。

1.3雜交測試

以JX0010、TM-1、湘棉10號和中棉所12號為父母本，配制6個以JX0010正反交雜交組合，組合以A、C、D、E、F、G編號（見表1）。人工去雄雜交，所得種子種植在指定的試驗基地，通過自交獲得F₂代種子。對F2代進行卡那霉素檢測，對卡那霉素檢測出的陽性株再進行PCR分子檢測，確定Cry5Aa基因的遺傳規律和遺傳穩定性。

1.4抗蟲基因的PCR檢測

1.4.1棉花基因組提取及檢測 參照Paterson，等和張金發，等的CTAB法從子葉中快速提取棉花基因組DNA，在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢查提取的基因組DNA，經溴化乙錠（EB）染色后紫外觀察照相。1.2.2

Cry5Aa基因的PCR擴增PCR反應總體積為25 uL，其中含有Mg²⁺（25 mM）1.5 uL，dNTPs（10 mM）0.5 uL，上下游引物（10 M）各1 uL，TaqDNA聚合酶（1U/uL）1 uL，10 Reaction buffer 2.5 uL，模板DNA（50ng/uL）1 uL，ddH20 16.5 uL；DNA擴增反應是在ABl2720 PCR儀上進行，反應程序：95T：預變性4 min，94%變性1 min，55℃退火50 s，72%延伸50 s，經30個循環，72%延伸10 min，4℃保存，0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2結果分析

2.1雜種F₁代的測試結果

以JX0010為母本的雜種F₁代3個組合，分別編號為A、C、D，稱之為正交組合；以JX0010為父本的雜種F₁代3個組合，分別編號為E、F、G，稱之為反交組合。各組合在湖南農業大學科研基地種植1500株，成活1300株左右，定苗1200株。8葉期用1200 ug/ml卡那霉素點涂主莖倒數第3葉，點涂后5～7 d調查卡那霉素陽性反應株。結果表明：A、E兩個組合陽性株率達100%，是所有組合中最高的；D、G兩個組合陽性株率略低，分別為99.2%、99.5%；而C、F兩個組合則達99.9%。且大田抗蟲性正反交各組合之間無顯著差異（P>0.05），表明F₁代均為抗性個體，JX0010品系抗蟲性狀純合度高，抗蟲性狀一致性好。

2.2 F₂代的抗性遺傳分析

雜交F1代自交獲得的F2代種子，6個組合每個組合種植480m²，1500株左右，棉株8葉期用卡那霉素（1200 ug/ml）點涂主莖倒數第3葉，5 d后調查陽性株率。隨后對陽性反應株采用Cry5Aa特異引物進行PCR檢測，去除假陽性株。通過卡平方檢驗分析遺傳率和遺傳穩定性。

分析結果表明：不同親本正反交組合問存在差異，但均未達到顯著水平，其抗蟲性基本符合顯性單基因3（抗蟲）：1（非抗蟲）的遺傳規律，且組合間穩定性較好，以JX0010為母本的正交組合經過PCR檢測的陽性株數（檢測結果見圖1）與陰性株數之比為3.13：1，而以JX0010為父本的反交組合其比值為2.97：1，兩者間無顯著差異（表2）。表明轉Cry5Aa基因棉花品系JX0010抗蟲性的遺傳穩定性好。

2.3 F₁回交一代的抗性分析

A、C、D、E、F、G雜交組合F₁與各自的非抗蟲親本回交，共獲得6個回交一代，種植后于棉株8葉期左右用卡那霉素點涂主莖倒數第3葉，卡那霉素點涂濃度為1200 ug/ml，5 d后調查點涂葉片有無黃顏色斑點，凡無黃色斑點的植株，記為卡那霉素陽性反應植株，以卡那霉素陽性株除以點涂總株數計算出陽性株率（結果列于表3）。表明該基因符合單基因顯性遺傳規律（1：1）。

3結論與討論

本研究結合大田性狀比較、卡那霉素檢測和PCR分子檢測，研究了轉Cry5Aa基因品系雜交后代遺傳特性的分離規律和群體的遺傳穩定性，結果表明F₁代均為抗性個體，F₂代正反交組合抗性分離比例（抗蟲：非抗）均接近3：1，表明外源基因為顯性并穩定插入到基因組中，JX0010品系抗蟲性狀純合度高，性狀一致性好。

對于轉基因作物來說，外源基因能否在后代中穩定地遺傳和表達是基因工程技術實用化研究中的關鍵問題。在理論上，外源基因一旦整合進入受體的核基因，插入的外源基因能在減數分裂中留存下來，就能夠穩定地通過有性繁殖傳遞給后代，并保持減數分裂的穩定性。但是，在實際操作中，常遇到多拷貝與重復轉基因序列造成的基因沉默，使外源基因不能在轉基因作物中穩定表達，甚至不表達。特別是花粉管通道法由于外源基因插入的隨機性而更易于這種現象的發生。本研究通過花粉管通道法獲得了一個轉基因品系，通過實驗證明外源基因為顯性并穩定插入到基因組中，為該基因的應用提供了較好的支撐。