代謝組學評估胚胎體外發育潛能的應用研究綜述

肖慎華 張國敏

摘要：胚胎體外發育能力的評估在人類輔助生殖技術中起關鍵作用。多胎妊娠帶來的圍產期死亡和醫療負擔日益凸顯。因此，如何獲得高發育潛能的胚胎以減少多胎率和提高臨床妊娠率是目前輔助生殖技術研究的重點。代謝組學作為一種非侵入性檢測方法，主要通過對卵泡液或胚胎的培養液進行檢測分析，能客觀地評價胚胎質量和預測胚胎的發育潛能。因此，通過代謝組學判斷和選擇具有良好發育潛能的胚胎，對孕育健康后代和減少經濟負擔具有重要意義。本文首先對代謝組學的概況及研究方法進行了簡單介紹，然后對代謝組學在生殖領域的最新應用進行了綜述。

關鍵詞：代謝組學；胚胎體外發育；卵泡液；胚胎培養液

中圖分類號： S857.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0042-03

收稿日期：2016-08-16

基金項目：第58批博士后科學基金（編號：80252115）。

作者簡介：肖慎華（1963—），男，江蘇徐州人，碩士，研究方向為羊生產學。

通信作者：張國敏，博士，主要從事羊生產學與動物胚胎生物學研究。E-mail：zhangguomin@njau.edu.cn。

隨著輔助生殖技術的廣泛應用，如何選擇高質量胚胎進行移植已成為研究者面臨的主要問題。目前，移植胚胎的發育潛能評估主要是依據胚胎的形態學評分。但這種方法重復性低、不能準確反映胚胎的質量，并且可能在無異常表現的胚胎中存在遺傳缺陷[1]。因此，尋找一種新的評價配子和胚胎發育潛能的方法迫在眉睫。近年的研究表明，利用代謝組學的方法，通過測定卵泡液或胚胎培養液中代謝物質的變化，探索這種變化與卵母細胞或胚胎質量及其發育潛能的關系，以此來評價配子和胚胎的質量，能達到提高妊娠率并降低多胎妊娠風險的目的[2]。由于卵泡液和培養液是卵母細胞和胚胎發育與成熟的重要微環境，代謝產物的變化可以直接反映卵母細胞和胚胎對基因、營養物質和環境等所產生的生理變化[3- 4]，因此，卵泡液和胚胎培養基的代謝成分就成為人們對胚胎活力評價的潛在指標。

1代謝組學概述

代謝組學（metabonomics）是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后新發展起來的一門學科，主要對細胞、組織或器官中所有低相對分子質量代謝產物進行定性和定量分析，從而判斷或預測細胞、組織或器官的健康狀態[5-6]。代謝組學是以組群指標分析為基礎、以高通量檢測和數據處理為手段，以信息建模與系統整合為目標的系統生物學的一個分支。在特定的環境中，經基因組表達和新陳代謝產生的中間物和終產物，是代謝組學研究的重點，物質的變化能反映生物體系受外部刺激所做出的應答。

與基因組學和蛋白質組學以及其他組學相比，代謝組學具有很大的優勢：（1）代謝物的種類較少，遠少于基因組和蛋白組所檢測到的數目；（2）基因和蛋白質的微小變化會在代謝產物上得到放大，從而更易檢測；（3）無需建立全基因測序以及大量表達序列標簽數據庫；（4）目前對大多數小分子內源性代謝物的作用及其所在代謝途徑及相關代謝通路的認識更加全面[7]。基于以上優點，代謝組學已成為所有組學研究中的熱點之一，有很大的發展和應用前景。

2代謝組學的分析技術

利用代謝組學分析數據的過程一般分為：代謝組數據的采集、數據預處理、多變量數據分析、標記物識別和途徑分析等步驟[8]。通常代謝組學的分析技術包括質譜分析技術（mass spectrometry，MS）、核磁共振波譜分析技術（nuclear magnetic resonance，NMR）、光譜分析技術（spectroscopy）和色譜分析技術（chromatograph）。NMR具有對樣品實現無創性、無偏向的檢測，有良好的客觀性和重現性，且無需對樣品預處理，被認為是唯一能用于活體和原位研究的代謝組學檢測技術[9]。質譜適用于生物小分子的分析，尤其是氣相色譜-質譜聯用（GC/MS）、液相色譜-質譜聯用（LC/MS）和電泳-質譜聯用（CE/MS）等聯用技術在各個研究領域應用較為廣泛。由于代謝物種類繁多，各物質之間差異比較大，且濃度分布范圍廣，僅靠一種分析技術無法完成。因此，必須聯合使用幾種分析技術才能對代謝產物進行全面分析[3]。目前NMR和色譜-質譜聯用是代謝組學檢測中最為常用的檢測方法。此外，隨著代謝組學分析技術的快速發展，對檢測儀器的改造也越來越高級。Liu等利用快速高分辨液相色譜系統（rapid resolution liquid chromatography，RRLC）與MS聯用技術，也獲取了樣品的全部內源性小分子代謝物信息[10]，并且此方法有可能成為后續代謝物檢測的主要方法。

3代謝物對胚胎體外發育潛能預測的研究

3.1卵泡液

卵母細胞存在于卵泡發育整個過程的99%以上，因此，卵泡液中的各種代謝物均可反映卵泡液所處的內環境[11]。卵泡液由多種物質組成，主要包括血漿、顆粒細胞、卵泡膜細胞和卵母細胞的代謝物等。這些代謝物質可能與卵母細胞的質量及其發育潛能密切相關[12]。Thomas等首次將代謝組學分析技術應用于卵泡液的測定，發現卵泡液中代謝物組成（脂肪酸和磷酸鹽等）成分的不同會影響卵母細胞的發育潛能[13]。同時，Bender等通過測定牛卵泡液中飽和脂肪酸的水平，得出高飽和脂肪酸不利于卵母細胞的成熟和早期胚胎發育的結論[14]。Zeron等也得出卵泡液中脂肪酸含量的高低會影響卵母細胞的成熟和早期胚胎發育的結果[15]。McRae等利用代謝組學技術對10名婦女不同生理周期中卵泡的卵泡液進行分析，結果表明月經周期中卵泡液中乳酸鹽和丙酮酸鹽的含量較高，但是卵泡液中的葡萄糖含量卻很低[16]。另外也有研究證實，卵泡液中膽固醇水平的高低也可作為預測卵母細胞發育潛能的一個代謝標記指標[17]。但是，利用代謝組學來預測卵母細胞發育潛能也存在一定的劣勢，比如卵泡液中所檢測出的標志物質非常有限，且不能確定是何種標志物起作用，因此在利用代謝組學技術通過卵泡液中的標志物來預測卵母細胞及胚胎的發育還需要深入研究[12]。

3.2胚胎培養液

3.2.1碳水化合物胚胎體外培養液中使用的碳水化合物主要有丙酮酸和葡萄糖。胚胎早期培養主要以丙酮酸和乳酸為功能底物，而在晚期主要以葡萄糖為功能物質。因此，培養基中丙酮酸和葡萄糖的吸收量被作為胚胎發育潛能的評價指標[18]。研究表明，丙酮酸攝取量高的胚胎易發育至囊胚[19]。Turner等研究也指出丙酮酸吸收量與胚胎植入能力有關[20]。然而，這一結論卻與之前的研究的結果[21-22]相反。究其原因，可能是因為由于試驗中使用的培養液不同以及物種不同所致。綜上所述，丙酮酸的攝取量與胚胎發育能力的關系還沒有統一的定論，因此，丙酮酸攝取量能否作為胚胎發育和生殖潛能的標志有待進一步研究。

在胚胎的發育過程中，葡萄糖的攝入量逐漸升高。Gardner等研究表明，在胚胎發育過程中，優質囊胚對葡萄糖的攝取量顯著高于劣質囊胚[23]。Sakkas等[1]也得出了類似的結論。然而，Lane等發現糖酵解活性低的囊胚有較高的發育能力，且移植后妊娠率高于糖酵解活性高的囊胚[24]。此外，Jones等發現，葡萄糖的攝取量與胚胎的發育潛能沒有直接的相關性[25]。因此，在胚胎的發育過程中，通過葡萄糖含量的變化來預測胚胎的發育潛能也存在一定的分歧。依靠培養基中葡萄糖和丙酮酸的含量來預測胚胎發育潛能的理論還不完善，還需要深入研究。

3.2.2氨基酸氨基酸是蛋白質合成的基礎，在胚胎的代謝過程中也起著重要的作用。主要作用如下：（1）提供能量；（2）維持細胞滲透壓；（3）調節pH值；（4）合成蛋白質合成的前體物質；（5）抗氧化作用；（6）信號傳遞。Houghton等首次利用HPLC-MS技術測定胚胎在發育的不同階段氨基酸的含量，結果表明，氨基酸代謝低的胚胎具有較好的發育潛能[26]。Brison等采用同樣的技術，發現氨基酸的含量與妊娠率有一定的相關性[27]。Stokes等研究表明，牛、豬和人胚胎發育不同階段的氨基酸代謝活性與DNA損傷呈正相關[28]。此外，研究證實不同性別的胚胎對氨基酸的利用率也有所差異[29]。雖然培養基中氨基酸的代謝在一定程度上能預測胚胎的發育潛能，但目前尚不能確定標志性的氨基酸，因此還需要進一步的試驗去發現和驗證。

3.2.3可溶性人白細胞抗原因子（soluble human leukocyte antigen-G，sHLA-G）sHLA-G由胚胎分泌，對維持正常的妊娠起著關鍵性的作用[30]。近年來研究表明，sHLA-G 在胚胎附植前的各發育階段中均有表達，且其含量與胚胎著床密切相關，可作為胚胎著床的標志性分子。Fisch等研究表明，sHLA-G 同胚胎等級評分結合起來，可用于 D3胚胎移植后妊娠的預測[31]。Rebmann等也證實了這一結論[32]。同時，Rebmann等通過ICSI方法構建的胚胎培養液中sHLA-G的表達與臨床妊娠率顯著相關，而通過IVF方法構建的胚胎培養液中sHLA-G的表達與妊娠率不相關[32]。然而Noriko等在各發育階段胚胎的培養液中均未檢測出sHLA-G的存在[33]。研究結果之所以存在差異，可能與構建胚胎的方法和培養液的成分等有一定的關系。

3.2.4胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGFs）IGFs是一種具有多種生物學活性的蛋白多肽物質，主要包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ這2種，在卵泡的自分泌和旁分泌中起著重要的作用。IGF在植入前的胚胎中均有表達，提示IGF可能對胚胎的發育有一定的作用[34]。Lighten等研究證實，IGF對植入前胚胎的發育有促進作用[35]。胚胎體外培養過程中，培養液中胚胎分泌IGF-Ⅱ的含量可反映胚胎生長發育及著床能力，可能主要是通過促進囊胚對葡萄糖的攝取而促進胚胎的發育[36]。

3.2.5血小板活性因子（platelet activating factor，PAF）PAF是一種內源性具有廣泛生物活性的磷脂類介質，在動物生殖生理調控尤其是排卵、受精和分娩等方面起著重要的作用[37]。ONeill等最先發現妊娠胚胎分泌PAF的含量顯著高于未妊娠胚胎[38]。后來Roudebush等也得出了相同的結論。這提示我們：胚胎分泌PAF的能力與胚胎發育的狀況有一定的相關性，且胚胎發育越好，分泌量就越大，因此，胚胎代謝液中PAF可作為胚胎發育潛能的指示物[39]。Emerson等也研究發現，PAF主要通過刺激胚胎對葡萄糖和乳糖的代謝，進而提高胚胎的發育率[40]。

4展望

代謝組學作為一種新興的技術與方法，可更便捷、更快速、更客觀地選擇優質胚胎進行移植，在一定程度上彌補了基因組學、蛋白質組學以及其他組學研究中的缺點。隨著研究的不斷深入，代謝組學的應用范圍也得到不斷拓寬。在輔助生殖領域，研究者運用代謝組學的方法進行了有意義的探究，且取得了一定的成果。但是，應用代謝組學對胚胎的發育潛能進行評估處于剛起步階段，還存在一定的問題，比如目前研究的對象數量比較少，不適用于單一胚胎植入的妊娠檢測等，因此，利用代謝組學技術降低多胎妊娠率并達到精準預測妊娠這一目的，還需要進一步深入研究。

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