水稻HGO基因啟動子的克隆及轉化鑒定

蔡 薇，陳彥成，黃麗華，支添添，任春梅,3*

(1.湖南農業大學 生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南省水稻研究所，湖南 長沙 410125；3.作物基因工程湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

水稻HGO基因啟動子的克隆及轉化鑒定

蔡 薇1，陳彥成2，黃麗華1，支添添1，任春梅1,3*

(1.湖南農業大學 生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南省水稻研究所，湖南 長沙 410125；3.作物基因工程湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

HGO是編碼酪氨酸降解途徑中尿黑酸1，2雙加氧酶的基因。探討了水稻HGO基因的表達特征，構建了水稻HGO基因啟動子與GUS表達載體，采用農桿菌介導的浸花法將該表達載體轉入擬南芥中，獲得轉基因植株。通過GUS組織化學染色法檢測，發現水稻HGO基因啟動子在擬南芥根、下胚軸、葉柄和子葉中高度表達，在真葉中只有葉脈和葉尖上有微弱的表達。

水稻；HGO基因；啟動子；載體構建

酪氨酸降解途徑是動物體內必不可少的一條代謝途徑[1]，在酪氨酸降解途徑中，首先是酪氨酸氨基轉移酶將酪氨酸催化生成對羥基苯丙酮酸，接著被對羥基苯丙酮酸雙氧化酶分解生成尿黑酸，然后在尿黑酸1,2雙加氧酶(homogentisate dioxygenase，HGO)的作用下氧化形成馬來酰乙酰乙酸，再經馬來酰乙酰乙酸異構酶作用形成延胡索酰乙酰乙酸，最后在延胡索酰乙酰乙酸酶(fumarylacetoacetate hydrolase，FAH)的作用下形成乙酰乙酸和延胡索酸進入三羧酸循環徹底分解[2]。在動物體中，FAH的缺乏會導致Ⅰ型遺傳性酪氨酸血癥，先天缺乏HGO會導致尿黑酸血癥。但酪氨酸降解途徑在植物中的作用機制尚不完全清楚[3-4]。

前期研究分離得到一個擬南芥短日照依賴型突變體sscd1，它在短日照條件下(8 h光照/16 h黑暗)發生細胞死亡，通過圖位克隆的方法得出其編碼延胡索酰乙酰乙酸酶FAH是酪氨酸降解途徑中最后一個酶[5-6]。尿黑酸1,2雙加氧酶(HGO)位于FAH的上游，前期研究發現，擬南芥雙突變體sscd1hgo能夠抑制sscd1的細胞死亡。進一步研究hgo單突變體，發現其不僅不會出現細胞死亡，且在幼苗期植株長勢強于Col-0野生型[7-8]。

水稻作為我國最主要的糧食作物,對其基因啟動子的克隆及分析有助于深入了解其基因的功能[9]。此前將水稻HGO基因與擬南芥HGO進行同源性比對，發現兩者具有較高的同源性；因此對水稻HGO基因進行克隆并轉入擬南芥sscd1hgo雙突變體中，細胞死亡表型再次出現，證明水稻HGO基因可互補擬南芥HGO基因[7]。為了深入研究水稻HGO基因的表達特征，克隆水稻HGO基因啟動子并轉入擬南芥中以觀察其表達情況。

本研究構建了水稻HGO基因啟動子與GUS表達載體的重組表達載體，將其轉入擬南芥中，通過抗性篩選獲得了穩定遺傳的轉基因植株，利用GUS染色檢測水稻HGO基因啟動子的表達活性，旨在分析水稻HGO基因在擬南芥上的組織表達特征。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)野生型Col-0、水稻粳稻品種日本晴(OryzasativaL. cv. Nipponbare)、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefactions)GV3101，載體pCAMBIA1301由作物基因工程湖南省重點實驗室植物信號傳導課題組保存。

1.2 植物的生長

1.2.1 水稻的生長 剝去成熟水稻種子的外殼，置于70%乙醇中浸泡90 s，棄去乙醇；用0.1% HgCl溶液浸泡種子15 min，倒掉HgCl；在超凈工作臺上用無菌水清洗4～5次，將種子放置在鋪有濕潤濾紙的培養皿中，在培養箱中28 ℃，14 h光照/10 h黑暗培養。

1.2.2 擬南芥的生長 用消毒液(20% bleach+0.1% Triton 100)浸泡擬南芥種子10 min后，在超凈工作臺上用無菌水清洗4～5次，播種在MS固體培養基上，放置4 ℃黑暗處理3 d后，放置培養室生長，培養溫度為(22±2) ℃；光周期為16 h光照/8 h黑暗。待生長7 d后，將其移栽到營養土(東北黑土與蛭石的體積比為1∶1)中，蓋上透明塑料薄蓋生長1～2 d，置于培養室內生長。

1.3pOsHGO∷GUS表達載體的構建

1.3.1 設計引物及目的片段的擴增 在NCBI網站上找到水稻HGO基因的啟動子序列，在線分析其包含的順式作用原件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)。利用軟件Primer Premier 5.0，根據網站上公布的啟動子序列設計1對擴增引物HGO-F/HGO-R，分別在上下游引物的5′端分別加上XbaⅠ和NcoⅠ酶切位點及其保護堿基，PCR擴增目的片段大小預期為1514 bp。引物序列如下：

HGO-F，5′-GCTCTAGATGTTTGTTGTGTTGGTGAGAT-3′

HGO-R，5′-CATGCCATGGAGAGGGAGAAGGACAA-3′

引物的預測退火溫度為66 ℃，根據預測溫度設計PCR的溫度梯度分別為64、66和68 ℃，得到最適溫度為68 ℃。用CTAB[10]法提取三葉期水稻總DNA，以此為模板進行PCR擴增。擴增后的PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收并純化。

1.3.2 載體重組及農桿菌的轉化 用XbaⅠ和NcoⅠ限制性內切酶對目的片段及pCAMBIA1301載體進行雙酶切，用T4連接酶將帶有相同粘性末端的目的片段和載體于37 ℃下過夜連接，使HGO基因啟動子替換pCAMBIA1301載體上原有的35 S啟動子。通過熱激法將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α，隨機挑選陽性克隆進行菌落PCR及酶切檢測，酶切正確的送上海鉑尚公司進行測序。將測序驗證正確的陽性克隆進行搖菌和質粒的提取，通過電擊法轉化到根癌農桿菌GV3101中，進行菌落PCR鑒定和質粒PCR驗證。

1.4 擬南芥的轉化與GUS染色

挑選經驗證成功轉入重組載體的農桿菌陽性菌落置于含有卡那霉素(50 mg/L)、慶大霉素(50 mg/L)、利福平(25 mg/L)的YEB液體培養液中活化處理，在28 ℃下220 r/min振蕩培養18～24 h。6000 g離心大量活化菌液2 min，棄上清液，用農桿菌懸浮液(5%蔗糖+1/2MS+0.02% Silwet-L77+0.01% 6-BA)將菌體重懸至OD600在0.6～1.0之間。采用浸花法[11]轉化擬南芥。

收取T0代種子，在含有潮霉素(25 mg/L)的MS培養基上篩選成功轉入pOsHGO∷GUS表達載體的轉基因植株，選取生長7～9 d抗性苗移栽至營養土中生長。收取T1代種子鋪種在含潮霉素(25 mg/L)的MS培養基上，得到分離比為3∶1的抗性苗和不抗苗。挑選抗性苗移栽至營養土中生長，得到T2代純合種子。將T2代的純合種子鋪種在含潮霉素(25 mg/L)的MS培養基上，選取生長7～9 d的抗性苗，同時取相同生長狀況的轉入pCAMBIA1301質粒的擬南芥幼苗作為陽性對照以及Col-0野生型作為陰性對照，置于GUS染液中完全浸泡，37 ℃染色過夜后用卡諾固定液脫色5～10 h，75%無水乙醇洗滌1～2次，在光學顯微鏡下觀察染色結果并進行拍照。

2 結果與分析

2.1OsHGO啟動子序列分析

通過plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對OsHGO基因啟動子序列進行分析，結果發現其包含了啟動子必需的核心原件CAAT-box和TATA-box，還有大量光反應元件，如ACE、AE-box、Box-4、G-Box、I-box等；部分與生物脅迫相關的順式調控原件，如脫落酸、赤霉素、水楊酸、生長素等激素應答元件(ABRE、GARE-motif、TCA-element、TGA-element)，響應真菌刺激的Box-W1；非生物脅迫相關的調控原件有熱激反應調控位點HSE，參與干旱脅迫誘導的MYB結合位點(圖1)。這表明HGO基因啟動子在調控植物生長發育的過程中起到了重要作用。

圖1 OsHGO啟動子序列分析結果

2.2OsHGO啟動子重組表達載體的構建

以3葉期水稻的總DNA為模板，通過引物HGO-F/HGO-R擴增出一段大小約為1500 bp的目的片段

(圖2-A)，與預期片段大小相符。經過XbaⅠ和NcoⅠ雙酶切連接至pCAMBIA1301載體上驅動GUS基因表達。為了驗證目的片段是否成功連接至載體上，對重組載體進行雙酶切檢測，結果出現了2條帶：一條帶大小約為15 kb，與載體片段大小一致；另一條帶大小約為1.5 kb，與目的片段大小一致(圖2-B)，這表明OsHGO基因啟動子成功連接至pCAMBIA1301載體上。

2.3 轉基因擬南芥的鑒定及GUS染色分析

采用浸花法轉化擬南芥后，將收取到的T0代種子鋪種在含潮霉素(25 mg/L)的MS培養基上。因潮霉素對擬南芥真葉的生長具有抑制作用[12]，所以只有成功轉入帶有潮霉素抗性基因的pOsHGO∷GUS重組表達載體，才能在含潮霉素的培養基上正常生長(圖3-A)，而未轉入抗性基因的野生型，在加入潮霉素的培養基上生長將會被抑制(圖3-B)。

為了檢測OsHGO基因啟動子的表達活性，將轉基因擬南芥的T2代種子播種于含潮霉素(25 mg/L)抗性的MS固體培養基上，對生長7 d的幼苗進行GUS組織化學染色檢測，染色結果顯示：GUS基因未在陰性對照幼苗中表達(圖4-A)，轉入pCAMBIA1301質粒的陽性對照(圖4-B)幼苗中，GUS基因在根、下胚軸、葉中都高度表達，而轉入重組載體的擬南芥幼苗(圖4-C)中，真葉內GUS基因的表達非常微弱，只有葉脈和葉尖上有微弱的表達，其他部位與陽性對照相似。

A為HGO基因啟動子PCR擴增結果：Line 1為Marker(4K),Line 2～5為HGO啟動子片段。B為pOsHGO∷GUS表達載體雙酶切檢測結果：Line 1為Marker(15K),Line 2為未酶切質粒，Line 3、Line 4 為重組載體酶切

圖2pOsHGO∷GUS重組表達載體的構建

A.紅色箭頭所指為轉基因陽性植株；B.未轉基因野生型植株

3 結論與討論

本研究成功構建了水稻HGO基因啟動子與GUS載體的重組表達載體，經過電泳及測序檢測，證實目的片段與pCAMBIA1301在預測位點重組且插入片段無錯配現象、大小正確。對擬南芥遺傳轉化后代進行篩選，在含有潮霉素(25 mg/L)的MS培養基上獲得抗性苗，GUS染色結果表明：OsHGO基因啟動子成功轉入植株中且具有活性，因此重組載體可用于OsHGO基因在植物中表達情況的觀察。

本試驗GUS染色的結果顯示水稻HGO基因啟動子轉入擬南芥，在根、下胚軸、葉柄和子葉中的表達量都較高，在真葉中只有葉脈和葉尖上有微弱的表達。根、下胚軸、葉柄和子葉中的表達量較高，說明在這些部位中酪氨酸的含量較高，酪氨酸降解途徑較為活躍；而真葉中只有葉脈和葉尖上有微弱的表達，說明酪氨酸在真葉上的積累較少，只在葉脈和葉尖上有少量積累，且酪氨酸降解途徑較為緩慢。在植株的不同組織部位，因生命活動及功能的不同會導致同種物質在不同組織中的特異性表達。水稻HGO基因就表現出這一特性，但HGO在酪氨酸降解途徑中的具體機理還有待進一步研究。

A.陰性對照植株；B.陽性對照植株；C.轉基因植株

[1] Colditz P B, Yu J S, Billson F A. Tyrosinaemia Ⅱ[J]. Med J Aust, 1984, 141(4): 244-245.

[2] Dixon D P, Edwards R. Enzymes of tyrosine catabolism inArabidopsisthaliana[J]. Plant Science, 2006, 171(3): 360-366.

[3] Gagné R, Lescault A, Grenier A, et al. Prenatal diagnosis of hereditary tyrosinemia: Measurement of succinylacetone inamniotic fluid[J]. Prenat Diagn, 1982, 2(3): 185-188.

[4] Scriver C R, Clow C L. Phenylketonuria and other phenylalanine hydroxylation mutants in man[J]. Genetics, 1980, 14(14): 179-202.

[5] Han C Y, Ren C M, Zhi T T, et al. Disruption of fumarylacetoacetate hydrolase causes spontaneous cell death under short-day conditions in Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2013, 162(4): 1956-1964.

[6] 支添添，周舟，韓成云，等.臺盼藍染色鑒定擬南芥sdl1突變體的細胞死亡[J].作物研究，2013，27(3)：217-218.

[7] 陳彥成.植物HGO基因功能的初步研究[D].長沙：湖南農業大學，2015.

[8] 陳彥成，錢偉超，彭志紅，等.酪氨酸及酪氨酸降解途徑中HGO基因突變對擬南芥幼苗生長的影響[J].作物研究，2014，28(3)：251-253.

[9] 顏彥.水稻組織特異表達啟動子的克隆及功能分析[D].武漢：華中農業大學,2013.

[10] Saghai M aroof M A, Solin an K M,Gorgensen R A, et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics[J]. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the USA, 1984, 81(21)： 8014-8018.

[11] Clough S, Bent A. Floral dip: a simpli fied method for Agrobacteriummediated transformation ofArabidopsisthaliana[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 1998, 16(6): 735-743.

[12] 丁笑生，段紅英，段志坤，等.潮霉素對擬南芥幼苗真葉形成的影響[J].湖南師范大學學報：自然科學版，2010，38(5)：163-166.

(責任編輯：曾小軍)

Cloning, Transformation and Identification of GeneHGOPromoter in Rice

CAI Wei1, CHEN Yan-cheng2, HUANG Li-hua1, ZHI Tian-tian1, REN Chun-mei1,3*

(1. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Hunan Rice Research Institute, Changsha 410125, China; 3. Hunan Provincial Key Laboratory of Crop Gene Engineering, Changsha 410128, China)

GeneHGOencodes 1,2-homogentisate dioxygenase, which functions in Tyr degradation pathway. In order to further investigate the expression characteristics of theHGOgene in rice, we constructed rice geneHGOpromoter and GUS recombinant expression vector, and transformed this expression vector intoArabidopsisthalianato obtain transgenic plants by usingAgrobacterium-mediated floral dip method. By histochemical GUS staining, we found that the riceHGOgene promoter was highly expressed in the root, hypocotyl, petiole and cotyledon ofA.thaliana, but it was lowly expressed in the euphylla vein and euphylla apex ofA.thaliana.

Rice;HGOgene; Promoter; Vector construction

2016-09-19

國家科技部973前期研究專項(2014CB160308)。

蔡薇(1992─)，女，湖南湘潭人，碩士研究生，主要從事植物分子遺傳學研究。*通訊作者:任春梅。

Q786

A

1001-8581(2017)03-0018-04