影響豬瘟疫苗質(zhì)量的幾個關(guān)鍵因素分析

師新川/華威特（江蘇）生物制藥有限公司

影響豬瘟疫苗質(zhì)量的幾個關(guān)鍵因素分析

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豬瘟是由豬瘟病毒引起豬的以高熱和出血為特征的，高度接觸性、致死性傳染病，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)。我國自1956年開始使用豬瘟兔化弱毒疫苗以來，豬瘟疫情逐步得到了控制。雖然我國馴化的豬瘟兔化弱毒疫苗毒株（C株）是目前世界上最優(yōu)秀的豬瘟疫苗毒株且在我國廣泛使用多年，但豬瘟在我國仍時有發(fā)生。其可能原因之一是豬瘟疫苗質(zhì)量跟不上當前防疫的完全需求。筆者根據(jù)自己從事動物疫苗研發(fā)、生產(chǎn)和技術(shù)服務(wù)的工作體會，結(jié)合相關(guān)研究文獻，談?wù)動绊懾i瘟疫苗質(zhì)量的幾個關(guān)鍵因素。

一、病毒培養(yǎng)的方式

根據(jù)豬瘟制苗用病毒培養(yǎng)的方式，大體把豬瘟疫苗分為豬瘟脾淋組織苗、豬瘟原代細胞苗和豬瘟傳代細胞苗，其各自特點分別為。

（一）豬瘟脾淋組織苗

豬瘟脾淋組織苗系用豬瘟兔化弱毒株接種健康乳兔或成年家兔，收獲感染定型熱兔子的脾臟及淋巴結(jié)，在其組織勻漿中加入適宜穩(wěn)定劑，冷凍真空干燥而成。組織苗每頭份病毒抗原含量不低于150個兔體感染量（RID），其中所含的多種淋巴因子能迅速增強機體非特異性免疫，但其異源性又可能造成豬的過敏反應(yīng)。此外，在生產(chǎn)制備脾淋組織苗時難以杜絕由動物臟器帶入的外源微生物污染，增大了使用時應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生的頻率。國內(nèi)曾有報道，30日齡以內(nèi)仔豬首免時接種脾淋苗，發(fā)生過大量過敏現(xiàn)象。接種日齡越小，反應(yīng)愈強烈，嚴重的引起仔豬死亡。過敏反應(yīng)還可能引起妊娠母豬發(fā)熱，流產(chǎn)等反應(yīng)。故乳豬的超前免疫及妊娠母豬的免疫應(yīng)慎用此類制品。

（二）豬瘟原代細胞苗

豬瘟原代細胞苗是把豬瘟兔化弱毒接種于犢牛睪丸原代細胞培養(yǎng)，在其培養(yǎng)物加入適宜穩(wěn)定劑后冷凍真空干燥制成。豬瘟原代細胞苗相對于脾淋組織苗抗原含量較高，免疫原性良好，每頭份病毒含量不低于750RID。豬瘟原代細胞苗在抗原培養(yǎng)過程中，其培養(yǎng)液、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間及其他環(huán)境條件可控，是有利生產(chǎn)穩(wěn)定疫苗毒的一面。不利于質(zhì)量控制的是，它使用的原代牛睪丸細胞容易把牛源病原體帶入豬瘟抗原中，例如導致牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）污染。BVDV可感染豬而引起疑似豬瘟病癥，并嚴重干擾豬瘟疫苗的免疫效果。此外，制苗所用的牛睪丸原代細胞一般采自3月齡左右犢公牛，動物個體差異大進而導致疫苗的批間差異大，對疫苗生產(chǎn)和效力發(fā)揮帶來潛在的困難。此類疫苗中一般存在一定量的血清和少量的細胞碎片，不能完全避免使用時的應(yīng)激反應(yīng)。

（三）豬瘟傳代細胞苗

與原代細胞苗不同，豬瘟傳代細胞苗，用傳代豬睪丸細胞或牛睪丸細胞制備疫苗抗原。可進一步避免外源微生物的污染，生產(chǎn)工藝非常穩(wěn)定，質(zhì)量易控，批間差異極小，病毒產(chǎn)量高，可達原代細胞苗的20倍以上。傳代細胞苗的抗原在培養(yǎng)后期，可大幅度降低血清使用量，進一步減少因異源蛋白引起的過敏反應(yīng)。所以豬瘟傳代細胞疫苗安全性好，免疫效力高，在緊急免疫時更能展現(xiàn)其優(yōu)勢。

二、制備疫苗的原輔料對豬瘟疫苗質(zhì)量的影響

這里的原輔料主要是指對疫苗抗原產(chǎn)量、純度及穩(wěn)定性有影響的材料。能明顯影響豬瘟疫苗質(zhì)量的原輔材料基本上都與BVDV有關(guān)。BVDV與豬瘟病毒的生物學特性相近，可感染包括豬在內(nèi)的多種動物。材料中若含有BVDV的抗體，則會抑制疫苗抗原的生長，產(chǎn)品中的抗原含量就達不到要求，進而達不到防疫效果。如果材料被BVDV污染，疫苗接種后有使豬感染BVDV的風險。豬瘟細胞苗在生產(chǎn)過程中要用牛血清、胰酶、牛睪丸等材料，需要對這些材料做BVDV抗原和抗體的嚴格檢驗。

（一）原輔料對豬瘟疫苗質(zhì)量的影響

BVDV與豬瘟病毒有一定的共同抗原，所以BVDV抗體對豬瘟病毒有一定的中和作用，嚴重干擾豬瘟病毒侵入宿主細胞增殖和擴繁的能力。筆者曾對市場上3個廠家9個批次的牛血清進行檢驗，結(jié)果只有1個批次的血清BVDV抗體為陰性，其余血清的中和抗體效價在1∶16～1∶128之間。分別用于細胞培養(yǎng)豬瘟兔化弱毒72 h免疫熒光檢測病毒含量最高為102．5FAID50/ ml，而使用BVDV抗體陰性牛血清所產(chǎn)病毒含量為107．6FAID50/ml，兩者相差10萬倍。顯而易見，在臨床感染BVDV豬所產(chǎn)生的中和抗體可以干擾豬瘟疫苗的效力。

在豬瘟細胞苗的生產(chǎn)過程中，由牛源原代睪丸細胞或牛血清引入的BVDV可導致臨床疾病。在荷蘭報道使用受BVDV污染的疫苗而引起仔豬牛病毒性腹瀉病毒的感染，感染仔豬出現(xiàn)與豬瘟類似的癥狀與病變。此外，法國一豬場由于注射了用次代羔羊腎細胞生產(chǎn)的偽狂犬病弱毒疫苗而引起母豬產(chǎn)仔數(shù)下降和產(chǎn)畸形仔豬，后來證實此疫苗有BVDV污染。目前我國豬瘟細胞苗的生產(chǎn)廠家眾多，原輔材料的純凈度難以控制，接種豬瘟疫苗時的生物安全風險不容忽視。

（二）血清質(zhì)量管理

血清作為疫苗生產(chǎn)的重要原輔料，從服從終產(chǎn)品質(zhì)量的角度，獸用生物制品企業(yè)把無外源微生物污染和促細胞生長活性作為衡量血清質(zhì)量的兩個重要指標。

除了BVDV外，支原體也是血清常見的污染原，受其污染的疫苗制品極易誘發(fā)豬的應(yīng)激反應(yīng)。支原體污染具有很強的隱蔽性，用肉眼難以觀察，所以需要有嚴格的支原體檢測手段。按照現(xiàn)有獸藥檢驗標準，必須在無血清的支原體培養(yǎng)基檢驗支原體，單次檢驗周期長達4周。考慮到人員和環(huán)境等因素，為保證無支原體污染，優(yōu)秀的生物制品企業(yè)一般會增加額外的快速檢驗手段，如PCR法。

血清作為細胞生長的主要營養(yǎng)物質(zhì)，對細胞的生長狀態(tài)和生長速度起到?jīng)Q定性的作用，而細胞狀態(tài)又直接決定了病毒生長的數(shù)量和質(zhì)量。如何確定血清的促生長活性，目前尚無嚴格的標準，不同企業(yè)的內(nèi)控方法有所差異。一般根據(jù)加入特定量血清后，細胞的生長狀態(tài)、生產(chǎn)病毒的滴度、收獲期的長短綜合評價，需要有較多的經(jīng)驗。

三、耐熱凍干保護技術(shù)

豬瘟兔化弱毒活疫苗對高溫敏感，所以運輸、保存條件對豬瘟疫苗的質(zhì)量影響很大。活疫苗從出廠到使用，中間的運輸和保存都需要在冷藏條件下進行。“冷鏈”中的任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，疫苗效價就會降低甚至失效。

我國現(xiàn)在商品化的豬瘟疫苗多采用比較簡單的保護劑，其主要成份為蔗糖、脫脂牛奶和明膠。這類制品對溫度仍比較敏感，需在-15℃保存。在保存和使用期間，如果遇到溫度較大變化或者多次變化，疫苗的質(zhì)量就會下降。因而在生產(chǎn)實踐中，許多技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)，疫苗的批間免疫效力差異比較大，防疫效果難以控制。這一問題運輸不便的地區(qū)以及小型養(yǎng)豬場，更為常見。隨著我國對動物疫苗品質(zhì)的要求越來越高，各疫苗研發(fā)和生產(chǎn)企業(yè)不斷進行工藝探索，這一問題正在得到改善。我們的研究表明，理想的耐熱凍干保護劑能滿足豬瘟疫苗在2℃～8℃條件下，保存超過24個月。隨著這一技術(shù)的使用，疫苗變得很穩(wěn)定、批間差異很小，并使仔豬一次接種獲得免疫成為可能，大大提高了疫苗的免疫成功率和免疫保護率。耐熱凍干保護水平目前是評判豬瘟疫苗品質(zhì)高低的關(guān)鍵指標之一。

四、豬瘟疫苗的效力評判標準

“疫苗出了錯，都是標準惹的禍”一句簡單的話語，道出了標準對于疫苗的重要性。豬瘟病毒由于自身在生產(chǎn)和檢驗細胞上不出現(xiàn)細胞病變，所以在病毒含量測定時，不能通過觀察細胞病變來讀取結(jié)果。目前豬瘟病毒的效力檢驗有三種方法，分別是豬免疫攻毒、兔體感染定型熱、免疫熒光定量（FAID50），這三種方法分別都有各自的評判標準及優(yōu)缺點。

（一）免疫攻毒法

免疫攻毒法是豬瘟效力檢驗的金標準，既對豬瘟抗體陰性健康仔豬，免疫豬瘟疫苗10～14日后連同對照一塊使用高致病性豬瘟（石門系血毒）進行攻擊保護實驗。攻毒后免疫組保護，對照組發(fā)病，則判定該批次疫苗合格。其優(yōu)點是有效、直接，但生物安全風險大、強毒獲取困難、需要負壓動物房、成本高，因而并未被廣泛采用。

（二）兔體定型熱檢測法

兔體定型熱檢測法，顧名思義既是將豬瘟疫苗注射到兔子體內(nèi)，通過兔體的體溫反應(yīng)來判定疫苗是否合格。其優(yōu)點是不動用強毒無生物安全風險，兔子屬小動物便于實驗操作，成本低。

但兔子的品種、產(chǎn)地、體重、健康狀況等對結(jié)果的影響較大，因不可控因素太多，常出現(xiàn)結(jié)果無法判定的情況。它不能直接反映疫苗的病毒含量，當然也不能對豬瘟疫苗病毒含量進行準確、穩(wěn)定的評判。

（三）免疫熒光定量法

免疫熒光定量法通過單特異的豬瘟病毒單克隆抗體，將無細胞病變的豬瘟病毒進行熒光染色，然后在熒光顯微鏡下直接判定。疫苗病毒感染細胞漿內(nèi)將顯示特異的熒光信號，這是在細胞水平對病毒進行定量，是國際標準豬瘟病毒含量測定方法。因該方法完全在實驗室條件下操作，不受地域、環(huán)境等條件的制約，所以穩(wěn)定性好，同時該方法還具有直接、準確的檢測豬瘟疫苗病毒含量的優(yōu)點，被認為最精準的豬瘟病毒定量方法。過去由于缺少可用于標準化檢驗的豬瘟單克隆抗體，這一質(zhì)量分析法在我國沒有應(yīng)用。經(jīng)過數(shù)年的研究，華威特生物制藥有限公司的研究人員解決了這一技術(shù)中的難題，豬瘟免疫熒光定量方法在農(nóng)業(yè)部2270號公告中確認為豬瘟疫苗效力檢驗標準。這一技術(shù)的使用，將讓豬瘟疫苗的制備更精確化、標準化、可控化，減少產(chǎn)品批間差，降低因疫苗批次的不穩(wěn)定而帶來的免疫風險。

五、小結(jié)

豬瘟疫苗病毒抗原的培養(yǎng)方式、原輔料品質(zhì)、耐熱凍干保護技術(shù)是影響豬瘟疫苗質(zhì)量的重要因素。傳代細胞培養(yǎng)疫苗，抗原純凈，抗原含量充分，可最大限度減少外源病毒污染，不論是安全性還是免疫效力，均能滿足當前豬瘟防疫的需要。免疫熒光定量及高效耐熱保護技術(shù)的應(yīng)用，將使豬瘟疫苗的品質(zhì)得到全面提升，有重大的社會和經(jīng)濟價值。

高質(zhì)量的豬瘟疫苗只是豬瘟有效防控的前提條件，合理的免疫程序及對豬場豬瘟狀況的準確判斷，同樣是豬瘟有效防控的重要條件。豬瘟防控是系統(tǒng)防疫的一部分，藍耳病、圓環(huán)、偽狂犬等疾病，同樣是導致豬瘟免疫失敗的重要因素，我們必須遵循各自的根本原則，根據(jù)不同豬場的實際情況，制定周密合理的免疫方案及相應(yīng)的周期性檢測計劃，讓豬瘟防疫給豬場帶來更好的效益。