腎癌循環腫瘤細胞檢測及其臨床意義的研究現狀

白孟麟，李勝，夏梅

(1南昌大學江西醫學院瑪麗女王學院，南昌330006；2山東大學附屬山東省腫瘤醫院；3山東省醫學科學院；4山東省藥物研究院)

腎癌循環腫瘤細胞檢測及其臨床意義的研究現狀

白孟麟1，李勝2,3，夏梅4

(1南昌大學江西醫學院瑪麗女王學院，南昌330006；2山東大學附屬山東省腫瘤醫院；3山東省醫學科學院；4山東省藥物研究院)

腎癌是臨床上較為常見的惡性腫瘤。由于早期癥狀不明顯，約30%的腎癌患者在確診時已發生遠處轉移。腫瘤細胞進入血液循環是腫瘤轉移過程中的重要步驟，循環腫瘤細胞(CTCs)是指脫離原發病灶并進入外周血循環系統的一類細胞。目前已經報道的CTCs檢測技術有50余種，其中應用較為廣泛的方法為RT-PCR法及CellSearch法，近年新開展的微流體芯片法和eTumorType法表現出了較高的檢出率，具有較好的應用前景。研究提示，外周血CTCs水平可以用于判斷腎癌患者的臨床分期和評估預后，在腫瘤的早期微轉移中具有重要作用。

腎細胞癌；循環腫瘤細胞；腫瘤轉移；檢測方法；預后

腎細胞癌(RCC)是一種較常見的惡性腫瘤，2015年，中國共有6.68萬例新增腎癌患者，約2.34萬人因腎癌死亡[1]。轉移是腎癌患者死亡的主要原因，Ⅳ期RCC患者的5年生存率僅為11.7%，顯著低于Ⅰ期患者的92.6%[2]。但由于腎癌的早期癥狀不明顯，30%左右的患者在被確診腎癌時都已出現遠處轉移。因此，找到一種能反映腫瘤細胞早期轉移的生物標記物一直是近年來RCC研究的熱點。經血液循環進行轉移是腎癌轉移灶形成的重要途徑。循環腫瘤細胞(CTCs)是指人體中脫離原發病灶并進入外周血循環系統的一類細胞，這些細胞在人體血液系統中伴隨血液進行循環，可以在脫離血液循環后形成新的轉移灶。由于CTCs在腫瘤的早期微轉移中具有重要作用，CTCs的檢測和分析對腫瘤微轉移的發現、療效評價及預后評估等方面有重要意義[3]。本文對CTCs檢測技術在腎癌領域中應用及其臨床意義的研究進展進行綜述。

1 CTCs概述

1867年，澳大利亞醫學家Ashworth首次在1例死亡腫瘤患者的外周血中發現了與腫瘤細胞類似的血細胞，由此提出了CTCs的概念。CTCs是人體中脫離最初病灶進入外周血的腫瘤細胞，一般認為腫瘤細胞在經歷過上皮間質細胞轉換(EMT)的過程后，獲得了脫離原發病灶并進行轉移入侵的能力。在進入血液循環后，只有極少部分CTCs能夠逃過機體免疫監視，并最終穿越內皮細胞層脫離外周血管，來到其他臟器的微環境中。小部分脫離血液循環的CTCs可以安全度過靜止期，并最終在多種細胞因子的作用下形成新的轉移病灶。CTCs可以來自于腫瘤的原發病灶或轉移病灶，作為一種腫瘤生物標記物具有較為豐富的應用價值，包括腫瘤微轉移的早期發現、判斷疾病分期、預后評估以及指導治療等。在臨床實踐中，在外周血中發現CTCs并不一定反映患者一定發生了遠處轉移，但卻可提示發生轉移的可能性大大增加，從而可以對患者采取更為積極的治療策略。外周血CTCs具有較強的特異性且含量極少，一般每106～107個血細胞中才含有一個CTCs。這對外周血CTCs檢測技術的敏感度提出了較高的要求，一直到20世紀末期，外周血CTCs檢測才逐漸被應用在臨床中[4]。

2 腎癌患者外周血CTCs檢測方法

在一些惡性腫瘤(如乳腺癌、膀胱癌等)中，外周血CTCs的檢測技術已經相對成熟，但關于腎癌患者外周血CTCs檢測的研究則相對較少。目前報道的對腎癌患者外周血CTCs的檢測方法包括RT-PCR法、CellSearch法、免疫磁珠分選法(MACS)、尺寸排除法、流式細胞法、丫啶橙熒光染色法(AO-F)、微流體芯片法以及結合計算機算法的eTumorType等，其中應用較為廣泛的方法為RT-PCR法及CellSearch法。

2.1 RT-PCR法 RT-PCR技術是一種通過檢測腫瘤特異性標記物mRNA的表達情況來推斷CTCs水平的方法。RT-PCR法是第一批用于檢測腎癌患者外周血CTCs的方法之一，在1999年，McKiernan等[5]以一種在透明細胞癌中廣泛表達的基因碳酸酐酶9(CAIX)的 mRNA作為檢測標志物，發現該方法對腎透明細胞癌診斷的敏感度和特異度分別為50%、98.2%。除CAIX mRNA外，鈣黏蛋白6(CDH6)的mRNA也可以作為外周血CTCs的檢測標志物。Shimazui等[6]報道，在87例各分期的腎癌患者中，外周血CDH6 mRNA的檢出率為52.9%。RT-PCR法在檢測外周血CTCs方面表現出一定的敏感度和特異度，但是該方法目前尚無統一的標志物，且除早期文獻外并無新的文獻報道。除此之外，該方法在應用時需要破壞細胞結構來提取mRNA，限制了對檢出的CTCs進行進一步計數和形態學分析的可能性，因此盡管RT-PCR法起步較早，但其一直未被批準應用于臨床。

2.2 CellSearch法 CellSearch檢測系統(CSS)是惟一經FDA批準，可以用于對乳腺癌、結直腸癌等惡性腫瘤進行療效監測和預后評價的檢測方法。在檢測過程中，患者血樣中的CTCs和白細胞首先被含有抗上皮細胞黏質因子(EpCAM)抗體的磁鐵流體富集，富集的CTCs和白細胞進而分別被CK8/18/19抗體及CD45抗體標記，并使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進行核染，最后篩選出的EpCAM+/CK+/DAPI+/CD45-細胞被標記為CTCs。Allard等[7]在對CellSearch法進行評估時發現，盡管在乳腺癌、結直腸癌等惡性腫瘤中，CSS表現出較高的檢出率，但RCC患者的外周血CTCs檢出率僅為25%。而在漢族人群中，腎癌患者的外周血CTCs檢出率同樣偏低，僅為12.5%[8]。

CellSearch法的低CTCs檢出率與腎癌細胞較低的EpCAM表達水平有關。作為一種上皮細胞癌，腎癌細胞在經歷EMT過程后，表面的EpCAM抗原含量急劇減少，在透明細胞癌患者中，EpCAM的檢出率僅為20%～40%[9]。而Gradilone等[10]使用RT-PCR法對腎癌患者外周血的CK8/18/19及CD44水平進行分析，發現腎癌患者的腫瘤細胞具有較低的CK8/18/19表達水平及較高的CD44表達水平，但具體原因尚不明確，需要進一步研究。

2.3 其他方法 腎癌細胞較低的EpCAM表達推動了一系列替代方法的研究，如免疫磁珠負性分選法[11,12]、尺寸排除法[13]、微流體芯片法[14]、丫啶橙染色法[15,16]、eTumorType法[17]和流式細胞法[18]等。在這些方法中，微流體芯片法和eTumorType法表現出了較高的檢出率，具有較好的應用前景。

微流芯片法是Liu等[14]于2016年提出的一套基于腎癌細胞的特異性標志物CAIX和CD147的正性分選法。該法的裝置包含了一個混沌混合裝置以及覆蓋了抗CAIX及CD147抗體的納米線基板。在對CTC進行分選之前，Liu等對透明細胞癌中CAIX和CD147的表達水平進行了檢測，結果發現97.1%的透明腎細胞腫瘤都呈CAIX/CD147陽性，而僅有18.6%呈EpCAM陽性；之后對76例腎癌患者和15例健康志愿者的外周血樣的分析提示，該系統的檢出率和特異性分別為94.7%和86.7%。

在2017年由Zou等[17]提出的eTumorType算法是另一個具有廣泛前景的CTCs檢測方法。該算法根據400余例腎癌患者的SNP數據，通過對細胞基因復制數變異(CNV)的分析來對外周血CTCs的含量進行檢測。在腎癌CTCs的分析中，該方法表現出90%左右的檢出率，具有較高的檢出率，但仍缺乏后續研究。

但CTCs檢測技術仍需面對很多問題。如各項檢測技術并無統一的檢測標準，致使不同方法之間CTCs的檢出結果相差巨大；目前尚缺乏對CTCs檢測與其臨床應用價值的大樣本實驗，CTCs檢測技術的臨床應用價值不能得到有效的證實；除此之外還需注意的是，CTCs與腎癌患者發生進展或轉移的機制原理尚不清晰，還亟待進一步的細胞學研究進行分析。

3 腎癌CTCs檢測的臨床意義

3.1 CTCs在臨床分期與輔助診斷中的應用價值 研究發現，腎癌患者的5年生存率與臨床分期存在較強的相關性，Ⅰ期患者的生存率高達90%以上，而發生轉移的Ⅳ期患者的5年生存率僅為11.7%。可見臨床分期是影響腎癌患者預后的重要因素，準確判斷腎癌患者的臨床分期對提高患者的生存率具有關鍵作用。在臨床上，相較于傳統的檢測方法如影像學檢查等，CTCs檢測具有對早期腫瘤微轉移檢出率高、無創等優點[19,20]。大量研究已經證實了CTCs檢測可用于協助判斷腫瘤患者臨床分期。Shimazui等于2003年使用RT-PCR法對87名腎癌患者的外周血CTCs檢測標記物CDH6 mRNA表達情況進行了分析，發現M1期患者的檢出率顯著高于M0期。Bluemke等在使用免疫磁珠分選法對154例腎癌患者的外周血CTCs水平進行分析后發現，患者的CTCs檢出率與淋巴結狀態(N分期)和轉移(M分期)情況具有顯著相關性。劉敏等[15]和張濤等[18]分別應用丫啶橙熒光染色法和流式細胞法對27例健康對照和50例腎癌患者的外周血CTCs水平進行了檢測，發現患者的T分期與CTCs檢出率顯著正相關。

以上研究雖然表明腎癌患者的CTCs檢出情況與患者的臨床分期存在相關性，但由于其檢測方法的檢出率普遍較低，在臨床上應用價值有限。Liu等[14]于2016年提出的微流芯片法是一種具有廣泛適用性的方法，除了具有較高的CTCs檢出率(94.7%)外，還發現當結合腫瘤標記物CK8/18/19與Vimentin進行陽性篩選時，Ⅲ、Ⅳ期腎癌患者的CTCs檢出量較Ⅰ、Ⅱ期患者高1.2倍，且Ⅳ期患者的CTCs檢出量顯著高于Ⅲ期患者，表明患者的外周血CTCs計數與其臨床分期明顯相關。可見在腎癌診療中，患者的CTCs檢出情況可以反映患者疾病的發展趨勢，作為臨床診斷的有益補充，對腫瘤早期轉移的發現具有重要意義。

3.2 CTCs與腎癌患者的預后評估 預后評估是目前CTCs應用最為廣泛的領域之一。研究指出，CTCs可以被作為腫瘤治療領域的獨立預后指標。目前關于CTCs檢測技術對腫瘤患者進行預后評估的報道[21,22]較為多見，但在腎癌領域仍缺乏相關報道。Gilbert等[23]應用RT-PCR技術對41例進行腎臟切除術前的患者外周血CTCs標記物CAIX mRNA表達情況進行檢測，檢出率為31.7%，隨訪調查發現，CAIX mRNA陽性的腎癌患者相較于陰性患者表現出了更低的5年無病生存率。Shimazui等[24]使用RT-PCR法檢測了55例腎癌患者的外周血CTCs標記物CDH6 mRNA表達情況，發現在CDH6 mRNA陽性的腎癌患者中，33.33%出現了疾病復發，而陰性患者的復發率僅為7.14%，陰性患者表現出了更長的無復發存活時間。Bluemke等[12]對154例腎癌患者通過免疫磁珠分選法分別篩選出CD45陰性和CK陽性的細胞，隨訪發現CK陽性的CTC檢出率與患者的預后情況存在正相關性，CK陽性的CTCs是腎癌患者預后的獨立影響因素。結合之前所論述的關于CTCs檢測在判斷患者病理分期中的應用價值，CTCs的檢出情況可以作為判斷腎癌患者預后的輔助信息，比傳統的影像學檢查更加快速、及時的評估患者預后。

3.3 CTCs與個性化治療的指導 在乳腺癌和非小細胞肺癌等腫瘤中，CTCs被廣泛應用于指導個體化治療[25,26]。由于CTCs來自腫瘤組織，因此可以較為完整地反映機體腫瘤的形態學和遺傳學特征，包括其分化程度及組織學亞型等。相較于傳統的穿刺取樣，對外周血CTCs的分離和檢測可以在無創的情況下實現對患者腫瘤細胞的分析。除此之外，由于CTCs可以來自原發灶和繼發灶，因此CTCs檢測可以更全面反映患者體內腫瘤的生物學特性，可以用于協助對患者制定更為全面的治療方案[27]。

CTCs檢測水平的改變亦可以反映腫瘤對不同治療措施的敏感程度。陳業剛等[28]研究發現，一部分被判斷為早期分期的腎癌患者在進行腎切除術后仍然出現了遠處轉移，而這部分患者的術前CTCs水平一般明顯高于未出現轉移的患者，且其CTCs水平在經過抗血管生成的靶向治療后會出現明顯下降，由此認為早期腎癌患者中較高的CTCs水平可以作為是否需要在術前進行抗血管生成靶向治療的選擇標準。

綜上所述，近年來CTCs檢測在腎癌的檢測和治療領域取得了一系列進步。CTCs檢測技術在腎癌患者的分期評估、預后判斷以及個性化治療指導等領域表現出了較強的指導作用，提供了一種特異性強、檢出率高的CTCs檢測方法。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.46.033

R737.11

A

1002-266X(2017)46-0103-04

山東省醫學科學院醫藥衛生科技創新工程。

夏梅(E-mail： 1005790425@qq.com)

2017-08-07)