禽流感與雞新城疫的血凝和血凝抑制試驗(yàn)操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)

董長(zhǎng)遠(yuǎn) 欒偉麗 （山東省淄博市張店區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 255000）

禽流感與雞新城疫的血凝和血凝抑制試驗(yàn)操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)

董長(zhǎng)遠(yuǎn) 欒偉麗 （山東省淄博市張店區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 255000）

血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)是科學(xué)評(píng)估和分析禽流感與雞新城疫疫病流行狀況及免疫效果的一個(gè)重要手段和方法。雖然方法簡(jiǎn)單，但如果操作不規(guī)范極易導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果偏差，本文著重對(duì)禽流感與雞新城疫的HA和HI試驗(yàn)的操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)進(jìn)行闡述和分析，對(duì)正確掌握試驗(yàn)方法，提高試驗(yàn)準(zhǔn)確性，避免或減少試驗(yàn)誤差具有重要的指導(dǎo)意義。

血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)是禽流感與雞新城疫疫病監(jiān)測(cè)和免疫抗體檢測(cè)中最常用的一種血清學(xué)監(jiān)測(cè)方法，因所需儀器設(shè)備少，操作簡(jiǎn)單，一般獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室都具備開展該項(xiàng)工作的條件。雖然HA、HI試驗(yàn)要求條件不高，但如果實(shí)驗(yàn)室人員操作不規(guī)范、使用標(biāo)準(zhǔn)不準(zhǔn)確，試驗(yàn)耗材和試驗(yàn)環(huán)境條件達(dá)不到要求，檢測(cè)結(jié)果也會(huì)出現(xiàn)偏離現(xiàn)象。

1 操作要點(diǎn)

1.1 1%紅細(xì)胞制備 HA與HI試驗(yàn)前需要先制備1%紅細(xì)胞懸液。由于不同個(gè)體雞只紅細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性不同從而影響HI效價(jià)，所以一般需要采取3只以上無(wú)禽流感和新城疫等抗體的健康成年公雞血液，在洗滌紅細(xì)胞的過(guò)程中，每次離心后，須用吸管吸去上清液和白細(xì)胞層。若是采用免疫過(guò)的公雞需要充分洗去血清,可洗滌5～6次。紅細(xì)胞的洗滌程度應(yīng)保證上清液呈清澈透明狀為準(zhǔn)。紅細(xì)胞經(jīng)過(guò)反復(fù)離心洗滌后用PBS液配成體積分?jǐn)?shù)為1%紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 HA效價(jià)判定 病毒抗原效價(jià)在血凝抑制試驗(yàn)中至關(guān)重要，所以每次試驗(yàn)前必須對(duì)抗原效價(jià)進(jìn)行測(cè)定?？乖r(jià)測(cè)定不準(zhǔn)確對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定影響。在PBS對(duì)照孔出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下(紅細(xì)胞完全沉淀)，將反應(yīng)板傾斜(不大于60°)觀察紅細(xì)胞是否完全凝集，以能使紅細(xì)胞完全凝集(不流淌)的抗原最高稀釋倍數(shù)，作為抗原的凝集效價(jià)，即按這個(gè)比例稀釋的抗原就是1單位的血凝抗原(HAU)。為了測(cè)出準(zhǔn)確的抗原效價(jià)，建議試驗(yàn)中同時(shí)進(jìn)行3～4排測(cè)定，取抗原效價(jià)值中一致性大的作為本次試驗(yàn)的HA效價(jià)。舉例說(shuō)明，如果3排病毒抗原的HA效價(jià)分別為1：512、1：512和1：256，則此次HA試驗(yàn)的HA效價(jià)可判為1：512。HA試驗(yàn)判定時(shí)間以紅細(xì)胞對(duì)照孔完全沉淀為標(biāo)準(zhǔn)，一般在室溫條件下30～40min出結(jié)果。

1.3 4單位抗原(4HAU)配制與回歸試驗(yàn) 血凝滴度除以4即為含4HAU抗原的稀釋倍數(shù)。4HAU抗原要現(xiàn)用現(xiàn)配，配好的4HAU抗原應(yīng)在2h內(nèi)用完。為了保證4單位抗原的準(zhǔn)確，建議4單位抗原配好后進(jìn)行回歸試驗(yàn)。具體做法是如下：在微量反應(yīng)板的1～4排的1～4孔內(nèi)各加入0.025ml PBS液。取已配好的4HAu抗原混勻液0.025ml加入反應(yīng)板的第1孔內(nèi)，混勻后吸取0.025ml加入第2孔，依次倍比稀釋至第4孔，從第4孔內(nèi)吸取0.025ml棄掉。每孔內(nèi)加入0.025ml l%紅細(xì)胞懸混液，振蕩混勻，20～25℃靜置20min后觀察結(jié)果。若l孔、2孔紅細(xì)胞完全凝集，而3孔、4孔不凝集，則說(shuō)明4個(gè)HAU配制準(zhǔn)確。如果前3孔完全凝集，說(shuō)明所配4HAU抗原實(shí)際是8個(gè)血凝單位，需等量稀釋病毒抗原，如果只有前1孔完全凝集，說(shuō)明所配4HAU抗原實(shí)際是2個(gè)血凝單位，病毒抗原量需加倍。如果所配抗原濃度過(guò)低，則所測(cè)定的血清抗體效價(jià)偏高；如果抗原濃度過(guò)高，則所測(cè)定的血清抗體效價(jià)偏低。

1.4 HI結(jié)果判定 每次HI試驗(yàn)必須設(shè)定陽(yáng)性血清對(duì)照和陰性血清對(duì)照，以保證試驗(yàn)條件成立。同時(shí)，抗原對(duì)照孔必須完全凝集，稀釋液對(duì)照孔必須完全沉淀。否則試驗(yàn)不成立。在對(duì)照完全正確情況下，將反應(yīng)板傾斜(不大于60°)，從背面觀察紅細(xì)胞是否呈現(xiàn)淚滴狀流淌，可參考稀釋液對(duì)照孔進(jìn)行比對(duì)，與稀釋液對(duì)照孔淚滴長(zhǎng)度相同的孔判為HI效價(jià)。淚滴長(zhǎng)度會(huì)隨時(shí)間變化，所以判斷時(shí)應(yīng)迅速。HI判定時(shí)間，以抗原對(duì)照孔出現(xiàn)完全凝集，稀釋液對(duì)照孔出現(xiàn)完全沉淀為標(biāo)準(zhǔn)。一般在室溫條件下30～40min出結(jié)果。

2 注意的問(wèn)題

2.1 禽流感與雞新城疫執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)不同 在HA、HI試驗(yàn)中，雖然禽流感與雞新城疫的血凝和血凝抑制試驗(yàn)原理相同、操作方法相同，但執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)不相同。禽流感執(zhí)行《高致病性禽流感診斷技術(shù)》(GB/T18936-2003)，雞新城疫執(zhí)行《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T16550-2008)。這兩個(gè)診斷技術(shù)中，1%雞紅細(xì)胞懸液制備和PBS液配制方法均不同，試驗(yàn)中不能混用。

2.2 反應(yīng)板的選擇 應(yīng)使用90°有機(jī)血凝板，勿使用110°有機(jī)血凝板。使用有機(jī)血凝板，在試驗(yàn)結(jié)束后要按程序清洗干凈。目前，實(shí)驗(yàn)室多使用一次性優(yōu)質(zhì)V型塑料反應(yīng)板，使用后不用清洗。試驗(yàn)中，要避免因反應(yīng)板質(zhì)量問(wèn)題而造成試驗(yàn)結(jié)果偏離。

2.3 稀釋液的選擇 生理鹽水和磷酸鹽緩沖液是實(shí)驗(yàn)室最為常用的兩種稀釋溶液。在HA和HI試驗(yàn)中，為減少稀釋液對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，選擇對(duì)酸堿具有一定緩沖能力的PBS液要比生理鹽水的試驗(yàn)效果好。建議檢測(cè)時(shí)使用符合標(biāo)準(zhǔn)要求的pH7.2、0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS液)，不要因怕配制PBS液麻煩而使用生理鹽水代替。

2.4 血清的處理 （1）冷凍血清處理：凍結(jié)血清融化后，會(huì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)局部濃縮、分布不均的現(xiàn)象。在檢測(cè)前應(yīng)充分混勻，混勻時(shí)切記劇烈振蕩，可采用上下顛倒幾次的方式混勻。（2）水禽血清處理：除雞外，有些禽的血清可能對(duì)雞紅細(xì)胞產(chǎn)生非特異性的凝集。用雞紅細(xì)胞檢測(cè)水禽血清時(shí)，需要除去存在于血清中的非特異凝集素。方法是在每0.5ml的血清中加入0.025ml的雞紅細(xì)胞輕搖后靜置至少30min，800r/min離心2～5min，收集上清液即為處理后的血清。亦可用被檢禽種的紅細(xì)胞。

2.5 抗原和1%紅細(xì)胞懸液的保存 抗原開封溶解后，置-15～-18℃冷凍保存，反復(fù)凍融應(yīng)不超過(guò)20次，若2～8℃保存應(yīng)不超過(guò)3個(gè)月。若當(dāng)天試驗(yàn)任務(wù)未完成，可將病毒抗原冷凍或冷藏保存。第2天繼續(xù)開展試驗(yàn)時(shí)，需要重新測(cè)定禽流感病毒抗原HA效價(jià)。1%紅細(xì)胞懸液在4℃條件下可保存5d左右。試驗(yàn)開始前，將配好的紅細(xì)胞懸液混勻，根據(jù)當(dāng)日或本次檢測(cè)任務(wù)量，將本次檢測(cè)所需紅細(xì)胞懸液倒入燒杯或錐形瓶留用，剩余紅細(xì)胞懸液繼續(xù)4℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 移液器使用和加樣操作中注意事項(xiàng) （1）取樣時(shí)，移液器只需按到第1檔停點(diǎn)，排樣時(shí)需按到第2檔停點(diǎn)，才能徹底排出，以達(dá)到準(zhǔn)確的取樣量。（2）吸取液體時(shí)要緩慢平穩(wěn)地松開拇指，切記不能過(guò)快。同時(shí)，將吸頭沿器壁滑出容器，以除去吸頭外多余的液體。（3）加樣時(shí)注意吸頭勿碰觸到V板孔，以免發(fā)生交叉污染。（4）倍比稀釋時(shí)，拇指要慢按、慢松移液器按鈕，以避免產(chǎn)生過(guò)多的泡沫，引起移液量不準(zhǔn)，混合不均，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。（5）紅細(xì)胞懸液和病毒懸液在使用前要搖勻，紅細(xì)胞懸液更應(yīng)隨用隨搖，保證每一孔中加入的紅細(xì)胞懸液和病毒懸液濃度一致。否則，加入時(shí)濃度高低不一，會(huì)造成人為誤差。（6）實(shí)際檢測(cè)工作中，有時(shí)需要在一定時(shí)間內(nèi)對(duì)一批血清進(jìn)行禽流感幾種毒株或亞型的檢測(cè)，如同時(shí)測(cè)定H5亞型Re-6、Re-8株、H7亞型抗體水平，為避免幾種抗原液混淆，必須在盛放抗原液的加樣槽上作標(biāo)記。由于一次試驗(yàn)需用多塊反應(yīng)板，反應(yīng)板也應(yīng)編號(hào)區(qū)別。

2.7 環(huán)境溫度和孵育時(shí)間的控制 《高致病性禽流感診斷技術(shù)》和《新城疫診斷技術(shù)》中要求HA和HI試驗(yàn)的環(huán)境溫度控制在20～25℃。在環(huán)境溫度20～25℃時(shí)，經(jīng)過(guò)30～40min即可讀出抗原滴度和血清抗體效價(jià)。HI試驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間與試驗(yàn)環(huán)境溫度成正比，即環(huán)境溫度升高所需反應(yīng)時(shí)間縮短。當(dāng)溫度過(guò)低如低于15℃時(shí)，出現(xiàn)結(jié)果就會(huì)變慢，往往需要超過(guò)40min才能判定結(jié)果。HI判定時(shí)間，以抗原對(duì)照孔出現(xiàn)完全凝集，稀釋液對(duì)照孔完全沉淀為標(biāo)準(zhǔn)。一般在室溫條件下30～40min出結(jié)果。一塊反應(yīng)板從開始加樣到判定結(jié)果大致需要70min，當(dāng)環(huán)境溫度不在20～25℃范圍內(nèi)，用空調(diào)進(jìn)行室溫調(diào)節(jié)時(shí)，為防止反應(yīng)板內(nèi)液體蒸發(fā)，應(yīng)避免在空調(diào)排風(fēng)口下操作，也可在加完樣后用A4復(fù)印紙蓋住反應(yīng)板。

3 小結(jié)

禽流感與雞新城疫HA和HI試驗(yàn)影響因素甚多，結(jié)果準(zhǔn)確與否，與試驗(yàn)中各個(gè)影響要素的綜合作用密切相關(guān)。試驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件，準(zhǔn)確控制紅細(xì)胞懸液和抗原工作濃度，同時(shí)嚴(yán)格控制試驗(yàn)溫度和作用時(shí)間，盡可能把各種影響降至最低。特別是要規(guī)范操作，努力減少人為因素的影響。另外，要確保HA與HI試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，還需要在試驗(yàn)實(shí)踐的基礎(chǔ)反復(fù)練習(xí)才能達(dá)到預(yù)期的目的。

S852.4+5

C

1007-1733(2017)12-0053-02

2017-08-04）