6種常見的循環腫瘤細胞的分離與富集技術

蔣能 崔詠梅 李淑華 鄭曉克 楊崢 王連唐 柯尊富

·述評·

6種常見的循環腫瘤細胞的分離與富集技術

蔣能 崔詠梅 李淑華 鄭曉克 楊崢 王連唐 柯尊富★

在過去的幾十年，循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）因其在腫瘤的早期診斷、預后判斷、療效評價、靶向藥物的開發、個體化治療中的潛在作用已經受到了廣泛的關注和研究。在轉移的腫瘤患者中，循環腫瘤細胞被視為一種微創的極具前景的診斷標志和判斷預后的重要標志。許多敏感的篩選方法和設備已經應用于血液中循環腫瘤細胞的分離和富集。本文總結了6種CTCs的分離和富集技術以及他們的優缺點，以期為后續更加優化的新技術、新設備的開發提供更多的參考依據，同時也為后續腫瘤的精準醫療帶來一些參考。

循環腫瘤細胞（CTCs）；精準醫療；分離與富集

循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是指脫離了腫瘤原發部位和轉移部位而進入血液循環中的各類腫瘤細胞的統稱。根據中國最近的一份腫瘤統計學數據，腫瘤已成為國民死亡的主要原因，同時也是威脅公眾健康的主要原因［1］。隨著“精準醫療”概念的提出，惡性腫瘤的診斷與治療也逐步向個體化、精細化方向深入發展，CTCs的研究是精準醫療的重要方向之一，而如何從惡性腫瘤患者血液中分離的CTCs中得到更多的診斷信息和治療信息將是精準醫療的重要方面，若能應用于醫學領域，將有效地幫助發現腫瘤的早期轉移、評估腫瘤患者預后以及幫助判斷腫瘤個體化治療的療效，實時動態地分析腫瘤患者CTCs的特性將為腫瘤患者真正的個體化治療提供新的依據［2?4］。目前的研究表明，CTCs的分離和富集是一種極具前景的惡性腫瘤監測手段［5?6］，與傳統腫瘤組織活檢相比，檢測循環血液中的CTCs被視為一種簡單無創的“液體活檢”手段［2，7，8］。而如何敏感、準確、快速、高效地分離和富集循環血液中少量的腫瘤細胞是擺在我們面前的難題［9?11］，CTCs檢測技術的不斷改進和發展，將有助于我們更深入地了解腫瘤的發生發展過程和其相關生物學特性。本文歸納總結了常見的6種CTCs分離富集技術，包括NanoVelcro cell?affinity substrates CTC芯片技術、核酸適配體（Aptamer）技術、微流控芯片技術（microfluidics chip technology）、基于形態學的膜微孔過濾技術（Micro filter technology）、基于形態學的密度梯度離心法等［2，12］。

1 CTCs常見的分離與富集技術

1.1 NanoVelcro cell?affinity substrates CTC芯片技術

NanoVelcro CTC芯片能夠牢固高效地捕獲CTCs，硅納米結構基質（Silicon nanowire substrate，SiNS）可以模擬細胞外基質的生物學特性和功能，利用納米基板的生物學特性可以有效地黏附CTCs［2］。此外，可在SiNS上結合上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗體，通過CTCs細胞表面表達的EpCAM抗原與基板上黏附的EpCAM抗體親和性來有效地捕獲血液中的CTCs。通過一系列的改進和創新，NanoVelcro CTC芯片已經經歷了3代。第1代是由SiNS和聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）微流體混合器組成，工作部分主要由含有螺旋形（魚骨型）微通道的NanoVelcro基板和高分子PDMS微通道構成［13］，分離的CTCs通過熒光染色觀察，4′，6?二脒基?2?苯基吲哚（4′，6?diamidino?2?phenylin?dole，DAPI）染核陽性與CD45染色陽性的細胞為有核白細胞，而DAPI染色陽性與細胞角蛋白（cy?tokeratin，CK）染色同時陽性者為需要分離富集的CTCs［2］。臨床血液樣本對比分析發現NanoVelcro CTC芯片比美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的CellSearch更加敏感、效率越高、花費更少［14?16］。同時，分離的CTCs可用于基因測序等后續研究，是精準醫療不可或缺的重要一環［2］。第2代NanoVelcro?LMD技術是在納米基板聚合物基礎上通過聚乳酸?羥基乙酸共聚物［Poly（lactic?co?glycolic acid），PLGA］納米纖維與二甲基二硫代氨基甲酸鉛薄膜（Lead di?methyldithiocarbamate，LMD）偶聯來篩選CTCs［17?18］。分離的腫瘤細胞可用來監測腫瘤的進展情況和腫瘤的治療效果，而分離的單個腫瘤細胞可以用來做下游的基因分型和測序，相比于其他類型的腫瘤活檢方式，這種腫瘤的液體活檢方式更方便簡潔。第3代是溫度敏感性的SiNS芯片，可以在37℃條件下捕獲CTCs，而在4℃條件下可以釋放出捕獲的CTCs，這種利用不同溫度下SiNS構象的改變來捕獲和分離CTCs的特性能更加有效地保持腫瘤細胞的完整性和生物學特性［6，16，19］。除了硅納米結構基質NanoVelcro芯片，后續的其他很多研究也發現了許多其他的材料，諸如聚（3，4?乙烯二氧噻吩）［Poly（3，4?ethylene?dioxythiophene），PEDOT］來源的NanoVelcro芯片、四氧化三鐵納米芯片等，可能具有更好地分離CTCs的性能［2，20］。納米的磁性材料或是非磁性的納米免疫富集方法均可增加分離CTCs時的接觸面積，從而增加捕獲CTCs的效率。

1.2 核酸適配體（Aptamer）技術

Aptamer技術本質上是一種改進的NanoVel?cro cell?affinity substrates CTC芯片，傳統SiNS基板上結合的EpCAM抗體能夠幫助更好地捕獲CTCs，新的核酸適配體（Aptamer）技術則是在SiNS基板上連接鏈霉親和素及其生物素化的配體，這種基板上的適配體可以有效地識別CTCs細胞膜外表面上的配體，從而達到固定和富集血液中CTCs的目的，而固定的CTCs可在酶的作用下與適配體解離釋放，從而達到可控性分離和富集CTCs的作用。這種方法可以減少昂貴的EpCAM抗體的使用，同時也是一種高效的富集CTCs的手段［2，16］。

1.3 CellSearch系統

該系統是目前唯一被FDA批準用于轉移性乳腺癌、結直腸癌和前列腺CTCs檢測的技術，該系統可集免疫磁珠富集技術和免疫熒光技術于一體，主要依靠外面包被了特異EpCAM抗體的免疫納米磁珠與血液中表達EpCAM的CTCs結合來分選CTCs，并進一步通過熒光反應識別CTCs，分選效率高，研究表明利用免疫磁珠分離方法可明顯增加外周血腫瘤細胞的檢出率［21?25］。CellSearch系統能夠實現CTCs的半自動化檢測并且具有較高的敏感性、特異性、準確性和可重復性。但Cell?Search每次檢測需要7.5 mL血液，所消耗的Ep?CAM抗體昂貴，且無法捕獲不表達EpCAM的細胞或因發生上皮間質轉換導致細胞EpCAM表位丟失的細胞，分離后的細胞可能會因為磁珠無法與細胞完全分離干凈而導致細胞完整性和活性受到破壞，導致捕獲細胞的再利用受到一定影響。同時，新的研究發現MagSweeper，IsoFlux，VerIFAST系統可能具有更高的富集CTCs的效果［26?28］，麻省總醫院（Massachusetts General Hospi?tal，MGH）的研究團隊也發現負向的間接分選機制也有不錯的分離效果［29］。

1.4 微流控芯片技術

微流控芯片技術是指根據實際需求，在一些高分子聚合材料上（如PDMS）制作出各種結構尺寸的微米量級管道，血液流體在微流控的微通道中的行為與其在宏觀尺度通道中不同，微流控通道可以實現一系列常規方法所難以完成的微加工和微操作。微流控芯片管道可依據細胞大小來設計，微流控芯片分選和富集CTCs也會利用循環腫瘤細胞表達的EpCAM與EpCAM抗體特異性結合來分選CTCs，通過抗原抗體結合抓捕到的CTCs可使用胰蛋白酶使其釋放，也可利用細胞的大小、免疫磁珠連同抗體的特異性結合來分離CTCs，微流控芯片是一種高效的分離循環細胞的裝置，分離血液中的CTCs效率常常大于90％。微流控被認為在生物醫學研究中具有巨大的發展潛力和廣泛的應用前景，與常規分選方法相比，微流控芯片具有對細胞破壞小及微型化、低成本、靈敏度高的特點［8，30?32］。

1.5 基于形態學的膜微孔過濾技術

Micro filter技術是一種基于腫瘤細胞大小的分離法（Isolation by size of epithelial tumor cells，IS?ET）［33］，依據細胞大小設計高分子過濾膜孔徑來達到分離富集CTCs的目的［34?35］。CTCs與大部分血液細胞在細胞尺寸和變形能力方面存在明顯的差別，依據這個原理設計的微過濾膜可以選擇性濾過體積較小的血細胞而截留體積相對較大的腫瘤細胞，捕獲后的CTCs可通過免疫細胞化學技術、逆轉錄聚合酶鏈反應和經典的病理學診斷方法加以識別，Clearbridge和RareCell等平臺已應用于實踐［2，36］，目前，已發展成3D版膜微孔過濾技術［37］。該方法可以更大程度地保留細胞結構的完整性，而不破壞細胞的生物學特性，為后續的進一步檢測提供可能，此方法對技術的要求較低，易于操作，價格低廉，分離后細胞活性較好。該系統一般只依據細胞大小來分離CTCs，與細胞表達的EpCAM、細胞角蛋白等無關，故可以識別所有的CTC類型，避免錯誤的陽性和陰性結果，但也存在靈敏性不夠、細胞易于損失等不足。

1.6 基于形態學的密度梯度離心法

密度梯度離心法也是目前常見的一種基于細胞形態學特點來富集CTCs的方法，可以從外周血中分離富集CTCs，常用的有OncoQuick分離法、傳統的聚蔗糖（Ficoll）分離法。傳統的Ficoll分離法設備簡單，主要設計的是一種特殊的50 mL離心管，離心管下面15 mL用一種特殊的多孔屏障分開，下面15 mL裝的是Ficoll，上面裝10 mL血液樣品，室溫下1 000 rpm離心10 min，離心后將上隔間液體倒入一個新的50 mL離心管，下面沉淀的細胞用磷酸鹽緩沖液清洗，4℃離心15 min，分離的有核細胞即可用于其它的后續檢測。研究同時表明OncoQuick分離法與傳統的Ficoll分離法比較，OncoQuick分離法對腫瘤細胞的富集效果更好［12，38，39］。

2 小結與展望

本文總結了幾種常見分離CTCs技術的特點，各有優劣。物理的分離方法諸如膜微孔過濾技術和基于形態學的梯度密度離心法操作簡單，可分選出發生了上皮間質轉化的腫瘤細胞、可更大程度地保持腫瘤細胞的完整性和分子表位，且無需消耗昂貴的EpCAM抗體，但也存在特異性較低和假陽性率較高的缺點。而微流控技術又分了物理的和生物化學的富集方法，物理的方法擁有操作簡單、最大程度地保持細胞完整性、無需消耗抗體等優點，生物化學的方法也會利用常見的EpCAM抗體來篩選，在提高富集特異性的同時，其操作成本相應地增加，且因其無法分選出發生上皮間質轉化的腫瘤細胞而造成其假陰性率較高。對比其他系統，CellSearch系統同樣存在許多優缺點，因其使用了EpCAM抗體，故其具有類似其他的使用EpCAM抗體方法的優缺點，雖其存在耗血量大等缺點，但目前為止，CellSearch系統仍然是FDA唯一批準的用于CTCs檢測的系統，故其他物理和化學的分離方法仍然不能完全取代已經標準化了的CellSearch系統。目前CTCs分離技術的研究重點主要集中在納米材料領域，如本文介紹的納米Nanovelcro CTC芯片因其具有更大的表面積而增加CTCs的接觸面積來達到提高分選效率的目的，且可很大程度地保持分離后CTCs形態和功能的完整性，因許多納米材料目前仍然使用EpCAM抗體分選，故也存在抗體消耗過多等問題，而改進的核酸適配體（Aptamer）技術無需消耗抗體，這種改進的無需消耗抗體的技術與非磁性納米材料的結合具有很大的研究潛力。事實上各類技術均有一定的交叉，新的思路可根據實驗設計或臨床目的先物理篩選后利用抗原表位二次篩選，如何提高分離設備的敏感性、特異性、高效性及如何保持分離后細胞的完整性和活性將是未來CTCs分離富集技術的研究重點。在CTCs分離技術中大量的研究者做了大量的工作，如何標準化CTCs的分離技術也急待解決，要使CTCs檢測技術更加廣泛應用于臨床，還需完善諸多相關研究。

類似于其他醫學技術的發展，CTCs分離技術的發展也是為了更好地應用于臨床。我們知道遠處轉移往往是影響腫瘤患者預后最重要的因素，而血液中的CTCs就是腫瘤遠處轉移的途徑，如何從分子學和精準醫療的角度找到腫瘤治療的鑰匙將是未來腫瘤治療的重點方向，作為一種非侵襲性的血液檢測手段，分離純化后的CTCs可用來培養細胞系做相關研究，可用于基因測序分析突變位點，可用于制作動物模型，CTCs的相關研究將為腫瘤的早期診斷、療效評價、預后判斷、靶向藥物的開發和藥效評估以及個體化治療提供可靠的依據。正是因為CTCs廣闊的應用前景，優化的CTCs分離和富集技術的開發顯得尤為重要。

［1］Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015［J］.CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115?132.

［2］Lin M，Chen JF，Lu YT，et al.Nanostructure embed?ded microchips for detection，isolation，and character?ization of circulating tumor cells［J］.Acc Chem Res，2014，47（10）：2941?2950.

［3］Pantel K，Alix?Panabieres C.Circulating tumour cells in cancer patients：challenges and perspectives［J］. Trends Mol Med，2010，16（9）：398?406.

［4］Kim DJ，Lee WY，Park NW，et al.Drug response of captured BT20 cells and evaluation of circulating tu?mor cells on a silicon nanowire platform［J］.Biosens Bioelectron，2015，67：370?378.

［5］Alix?Panabieres C，Pantel K.Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy［J］.Cancer Discov，2016，6（5）：479?491.

［6］Ke Z，Lin M，Chen JF，et al.Programming thermore?sponsiveness of NanoVelcro substrates enables effec?tive purification of circulating tumor cells in lung can?cer patients［J］.ACS Nano，2015，9（1）：62?70.

［7］Marchetti A，Del GM，Felicioni L，et al.Assessment of EGFR mutations in circulating tumor cell prepara?tions from NSCLC patients by next generation sequenc?ing：toward a real?time liquid biopsy for treatment［J］. Plos One，2014，9（8）：e103883.

［8］Tang M，Wen CY，Wu LL，et al.A chip assisted im?munomagnetic separation system for the efficient cap?ture and in situ identification of circulating tumor cells［J］.Lab Chip，2016，16（7）：1214?1223.

［9］Fischer AH.Circulating tumor cells：seeing is believ?ing［J］.Arch Pathol Lab Med，2009，133（9）：1367?1369.

［10］Dharmasiri U，Witek MA，Adams AA，et al.Micro?systems for the capture of low?abundance cells［J］.An?nu Rev Anal Chem（Palo Alto Calif），2010，3：409?431.

［11］Paterlini?Brechot P，Benali NL.Circulating tumor cells（CTC）detection：clinical impact and future di?rections［J］.Cancer Lett，2007，253（2）：180?204.

［12］Rosenberg R，Gertler R，Friederichs J，et al.Compari?son of two density gradient centrifugation systems for the enrichment of disseminated tumor cells in blood［J］.Cytometry，2002，49（4）：150?158.

［13］Stroock AD，Dertinger SK，Ajdari A，et al.Chaotic mixer for microchannels［J］.Science，2002，295（5555）：647?651.

［14］Wang S，Liu K，Liu J，et al.Highly efficient capture of circulating tumor cells by using nanostructured sili?con substrates with integrated chaotic micromixers［J］. Angew Chem Int Ed Engl，2011，50（13）：3084?3088.

［15］Lu YT，Zhao L，Shen Q，et al.NanoVelcro Chip for CTC enumeration in prostate cancer patients［J］.Meth?ods，2013，64（2）：144?152.

［16］Shen Q，Xu L，Zhao L，et al.Specific capture and re?lease of circulating tumor cells using aptamer?modified nanosubstrates［J］.Adv Mater，2013，25（16）：2368?2373.

［17］Hou S，Zhao L，Shen Q，et al.Polymer nanofiber?em?bedded microchips for detection，isolation，and molec?ular analysis of single circulating melanoma cells［J］. Angew Chem Int Ed Engl，2013，52（12）：3379?3383.

［18］Zhao L，Lu YT，Li F，et al.High?purity prostate cir?culating tumor cell isolation by a polymer nanofiber?embedded microchip for whole exome sequencing［J］. Adv Mater，2013，25（21）：2897?2902.

［19］Hou S，Zhao H，Zhao L，et al.Capture and stimulat?ed release of circulating tumor cells on polymer?grafted silicon nanostructures［J］.Adv Mater，2013，25（11）：1547?1551.

［20］Hsiao YS，Luo SC，Hou S，et al.3D bioelectronic in?terface：capturing circulating tumor cells onto conduct?ing polymer?based micro/nanorod arrays with chemical and topographical control［J］.Small，2014，10（15）：3012?3017.

［21］Hillig T，Horn P，Nygaard AB，et al.In vitro detec?tion of circulating tumor cells compared by the Cyto?Track and CellSearch methods［J］.Tumour Biol，2015，36（6）：4597?4601.

［22］Andree KC，van Dalum G，Terstappen LW.Challeng?es in circulating tumor cell detection by the CellSearch system［J］.Mol Oncol，2016，10（3）：395?407.

［23］Adams DL，Stefansson S，Haudenschild C，et al.Cy?tometric characterization of circulating tumor cells cap?tured by microfiltration and their correlation to the Cell?Search（?）CTC test［J］.Cytometry A，2015，87（2）：137?144.

［24］Zigeuner RE，Riesenberg R，Pohla H，et al.Immuno?magnetic cell enrichment detects more disseminated cancer cells than immunocytochemistry in vitro［J］.J Urol，2000，164（5）：1834?1837.

［25］Andree KC，van Dalum G，Terstappen LW.Challeng?es in circulating tumor cell detection by the CellSearch system［J］.Mol Oncol，2016，10（3）：395?407.

［26］Talasaz AH，Powell AA，Huber DE，et al.Isolating highly enriched populations of circulating epithelial cells and other rare cells from blood using a magnetic sweeper device［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（10）：3970?3975.

［27］Harb W，Fan A，Tran T，et al.Mutational analysis of circulating tumor cells using a novel microfluidic col? lection device and qPCR assay［J］.Transl Oncol，2013，6（5）：528?538.

［28］Casavant BP，Guckenberger DJ，Berry SM，et al.The VerIFAST：an integrated method for cell isolation and extracellular/intracellular staining［J］.Lab Chip，2013，13（3）：391?396.

［29］Ozkumur E，Shah AM，Ciciliano JC，et al.Inertial fo?cusing for tumor antigen?dependent and?independent sorting of rare circulating tumor cells［J］.Sci Transl Med，2013，5（179）：179ra47.

［30］Lee SW，Hyun KA，Kim SI，et al.Continuous enrich?ment of circulating tumor cells using a microfluidic lat?eral flow filtration chip［J］.J Chromatogr A，2015，1377：100?105.

［31］Autebert J，Coudert B，Champ J，et al.High purity microfluidic sorting and analysis of circulating tumor cells：towards routine mutation detection［J］.Lab Chip，2015，15（9）：2090?2101.

［32］杜晶輝，劉旭，徐小平.微流控芯片分選富集循環腫瘤細胞的研究進展［J］.色譜，2014，32（1）：7?12.

［33］Ma YC，Wang L，Yu FL.Recent advances and pros?pects in the isolation by size of epithelial tumor cells（ISET）methodology［J］.Technol Cancer Res Treat，2013，12（4）：295?309.

［34］Salvianti F，Orlando C，Massi D，et al.Tumor?related methylated cell?free DNA and circulating tumor cells in melanoma［J］.Front Mol Biosci，2015，2：76.

［35］Adams DL，Zhu P，Makarova OV，et al.The system?atic study of circulating tumor cell isolation using litho?graphic microfilters［J］.RSC Adv，2014，9：4334?4342.

［36］Tan SJ，Yobas L，Lee GY，et al.Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood［J］.Biomed Microdevices，2009，11（4）：883?892.

［37］Zheng S，Lin HK，Lu B，et al.3D microfilter device for viable circulating tumor cell（CTC）enrichment from blood［J］.Biomed Microdevices，2011，13（1）：203?213.

［38］Kaifi JT，Kunkel M，Das A，et al.Circulating tumor cell isolation during resection of colorectal cancer lung and liver metastases：a prospective trial with different detection techniques［J］.Cancer Biol Ther，2015，16（5）：699?708.

［39］Nastaly P，Ruf C，Becker P，et al.Circulating tumor cells in patients with testicular germ cell tumors［J］. Clin Cancer Res，2014，20（14）：3830?3841.

6 kinds of common technologies of separating and enriching circulating tumor cells

JIANG Neng,CUI Yongmei,LI Shuhua,ZHENG Xiaoke,YANG Zheng,WANG Liantang,KE Zunfu★
(Department of Pathology,the First Affiliated Hospital,Sun Yat?sen University,Guangzhou,Guangdong,China, 510080)

During the past ten years,circulating tumor cells(CTCs)have received enormous attention as potential research direction,because of the potential value in the early diagnosis of cancer,prediction of clinical prognosis,evaluation of therapeutic efficiency,development of targeted drugs,and personalized medicine of malignant cancer.Circulating tumor cells(CTCs)have been regarded as minimally invasive and promising diagnostic and prognostic biomarkers for patients with metastatic tumors.Multiple highly sensitive approaches and devices have been developed to separate and enrich CTCs in the blood.We have summarized 6 kinds of separation and enrichment technologies of CTCs with the opportunities and challenges faced during the development of these systems,this article also provides reference frame for an optimized separation and enrichment technology and highlight some directions for the precision medicine of cancer treatment.

Circulating tumor cells(CTCs);Precision medicine;Separation and enrichment

國家自然科學基金（30900650/H1615，81372501/H1615，81572260/H1615，81172232/H1615，81172564/H162）；廣東省自然科學基金（2011B031800025，S2012010008378，S2012010008270，S2013010015327，2013B021800126，20090171120070，9451008901002146，2013B021800126 2015A020214010 and 2013B021800259）；高校基本業務青年重點培育（2015ykzd07）

中山大學附屬第一醫院病理科，廣東，廣州510080

★通訊作者：柯尊富，E?mail：kezunfu@126.com