豬藍耳病診斷技術研究進展

陳 紅 方 英 徐春志 袁翠霞 景書灝

（貴陽市動物疫病預防控制中心，貴州貴陽 550000）

豬藍耳病診斷技術研究進展

陳 紅 方 英 徐春志 袁翠霞 景書灝

（貴陽市動物疫病預防控制中心，貴州貴陽 550000）

豬藍耳病又被成為豬繁殖與呼吸障礙綜合癥，這種疾病在臨床上能夠引發發燒、耳朵發紫以及伴有咳嗽的呼吸困難等癥，具有極高致死率的傳染性疾病，一旦發生，危害性極大，可能導致母豬的流產、繁殖障礙，大大增加了豬仔的死亡率。目前在豬藍耳病上，并沒有有效手段與藥物進行治療，所以能夠提前診斷，找到快速診斷的技術顯得非常的關鍵。本文對豬藍耳病病毒的分離鑒定，分子生物學等診斷方法的研究進展進行了綜述，為豬藍耳病的診斷和防控提供了一定理論依據。

豬藍耳??；病原學診斷；血清學診斷；分子生物學診斷

由病毒引起的豬藍耳病，會導致妊娠期母豬的早產、死胎、弱胎，導致豬的呼吸困難，不進食等問題，這種病毒被稱作豬繁殖與呼吸綜合征病毒。楊漢春認為我國目前流行的這種病毒屬于美洲型的毒株，湯德元將美洲型的毒株分為四種亞群，我國流行其中的三種，這三種病毒的傳播速度很快，在養豬密集、頻繁流轉的經濟發達國家，這種病毒更加危險。豬繁殖與呼吸綜合征病毒導致的病證較為復雜，包括病毒的繼發感染等臨床癥狀。在診斷時，應當借助實驗室的診斷技術幫助，從而為豬藍耳病提供診斷與防控的技術支持。

1 病毒的分離鑒定

病毒的分離鑒定，是一種比較切合實際的鑒定方法，能夠診斷PRRSV分離細胞，例如豬肺泡巨噬細胞、HS.2H克隆細胞等。對于用歐洲株來進行分離PRRSV，只可以利用PAM細胞進行。這種細胞來源于血清、脾臟、扁桃體、肺臟。在進行PRRSV分離中，我們可以快速的從急性感染的豬身上得到。PRRSV的分布也有所不同，死胎脾臟、淋巴巨噬細胞分布多存在于流產的情況，新生的豬多分布在肺臟之中。冷藏冷凍能夠在遠距離運輸中保證采集的樣品的活性，在進行特殊處理后，使其接種在單層PAMs細胞后，等待4d左右，就可以看到細胞病變。一開始病變細胞出現膨大、圓形，而后開始脫落、皺縮。接種在CL-2621細胞后，細胞病變變得遲緩很多，需要等待6d左右出現細胞的感染。接種在Marc-145細胞2d左右，則呈現激烈的細胞病變。在進行毒株的細胞病變實驗中，一些毒株不能夠為實驗帶來理想的實驗結果，不能出現明顯的細胞病變。而且，還應當加強對間接免疫熒光試驗、免疫過氧化物酶單層試驗方法的驗證。

2 血清學診斷方法

血清學試驗應用廣泛，是比較傳統的PRRSV診斷方法。血清學試驗方法可以有較為明顯的特異性，但是缺乏足夠的敏感度。

2.1 中和試驗

通過中和試驗，可以發現PRRSV抗體的特異性比較突出，但是敏感度不足，常常需要在等待將細胞感染后5周左右才能夠出現VN抗體，10周之后才可以達到最多。這主要是因為中和抗體出現的時間比較晚。與IPMA、IFA、ELISA等比較，可以發現中和試驗的敏感度較低，不能夠很好的運用到PRRSV感染的早期診斷之中。后人對這種情況進行了研究與改進，增加20%的豬的新鮮血清，從而提高了檢測的敏感程度，在10d左右的時間里得到了滴度較高的VN抗體。

2.2 間接熒光抗體試驗

間接熒光抗體試驗的特性與敏感度相似于免疫過氧物酶單層試驗，并廣泛應用在許多歐美發達國家之中。我國也在進行相應的IFA與微量IFA的試劑供應。這種試劑能夠檢測到受到PRRSV感染6d之后的豬的抗體?？贵w在30到50d左右達到峰值，然后逐漸下降，最后再4到6個月逐漸消失。這種方法在細胞培養上比較困難，對環境和人員的水平提出了很大的要求，而且只能得到PRRSV分離株。

2.3 免疫過氧化物酶單層試驗

免疫過氧化物酶單層試驗在眾多PPRSV抗體檢測中出現的最早，廣泛應用在歐洲國家，其敏感度和特異性得到了普遍認可。該方法能夠在感染病毒6d后的豬身上檢測到PRRSV抗體，這種方法是根據PAMs、CI-2621、Marc-145等完成的，然而這種方法的結果不能夠自動顯示，需要人工觀察評判，其結果也容易受到背景著色的影響，出現偏差，而且還應具備較高的細胞培養環境與倒置顯微鏡的觀測，成本較高，難以進行大范圍的推廣。

3 PRRSV的分子生物學診斷

3.1 RT-PCR檢測

RT-PCR檢測在進行PRRSV的檢測中，以其較高的敏感度得到了廣泛的應用。其敏感度為pg水平。Suarez研究出了敏感度較高的RT-PCR方法，達到對隱性感染進行檢測的水平。趙耘等運用RT-PCR的診斷方法，能夠進行更加簡便的操作來增強檢測的敏感性。顧海洋等通過實驗發現并驗證了高致病性豬藍耳病在基因上的87bp的連續缺失，這對豬的高致病性藍耳病的預測檢驗方法提供了方向，建立了區別高致病性與低致病性豬藍耳病的一套方法。

3.2 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR技術源于美國20世紀90年代，能夠合理的添加熒光基團，通過熒光信號來監測PCR過程，再根據標準曲線得到定量分析結果。這種方法能夠提高靈敏度、特異性、實時性，還可以實現DNA模版的定量化。當前世界先進領域例如分子生物學、醫學研究等各個領域都在使用這種技術。

[1]胡玲玲，湯德元，曾智勇，等.豬繁殖與呼吸綜合征診斷技術的研究進展[J].豬業科學，2017，34（6）：113-116.

[2]陳叢琳.豬藍耳病診斷方法研究進展[A].中國畜牧獸醫學會家畜傳染病學分會全國會員代表大會暨第十五次學術研討會[C].2013：3.