腸道病毒EV71手足口病病原學及免疫功能改變研究現狀

王宇婧 程邦寧

腸道病毒EV71手足口病病原學及免疫功能改變研究現狀

王宇婧 程邦寧★

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是以手、足、口多發皰疹為主要特征的一類自限性疾病，5歲以下兒童多發，是由多種腸道病毒引起的兒童常見的急性傳染性疾病。腸道病毒EV71是手足口病主要病原體，具有噬神經性，可引起患兒神經癥狀甚至死亡。本文將對EV71病原學特征、發病機制、感染后機體免疫功能改變進行討論，以便更加深入了解EV71特征，為手足口病的防治提供依據。

手足口病；腸道病毒EV71；體液免疫；細胞免疫

手 足 口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是兒童常見傳染性疾病，以手、足、口多發皰疹為主要特征，是一類自限性疾病，由多種腸道病毒引起的全球兒童常見的急性傳染性疾病［1］，5歲以下兒童多發。多由腸道病毒屬的柯薩奇病毒A組（coxsackievirus，CoxA）16型，人腸道病毒（enterovi?rus，EV）71型引起。HFMD已經成為世界性疾病，目前已經在全球范圍內造成多次大規模爆發流行，引起全世界的廣泛關注。EV71是導致HFMD的主要病原體［2］，其發病率呈逐年增加的趨勢。重癥病例主要由EV71引起，重癥患兒可以出現神經癥狀，包括腦炎、腦膜腦炎、腦脊髓炎、急性遲緩性麻痹甚至死亡。本文以EV71為代表對HFMD在病原學特征、發病機制、感染后機體免疫功能改變等方面進行綜述，通過對HFMD的進一步研究以達到及早治療、防止病情進展、減少后遺癥的目的。

1 EV71病原學特征

EV71病毒無包膜，是屬于小RNA病毒科腸道病毒屬的單正鏈RNA病毒［3］，其5′端與含有VPg蛋白共價連接，3′端為多聚腺苷酸尾，5′?非編碼區長度為745個核苷酸呈高度結構化包含內部核糖體結合位點（internal ribosomal entry site，IRES），IRES保證RNA合成完整的三葉草樣結構并且對病毒mRNA的轉運方向起決定作用。三葉草樣結構功能具有多樣性，作為順式作用元件與病毒和細胞蛋白相互作用形成核糖核蛋白復合物。40S亞基的核糖體識別特定序列時，翻譯開始進行［4］。有研究表明多種蛋白質與小RNA病毒5′端非翻譯區作用，參與病毒RNA復制或者IRES反應。上游元件結合蛋白（far upstream ele?ment binding protein，FBP1）是一種反式作用因子，通過結合實驗，能繪制出EV71 IRES內負責FBP1結合的RNA決定物并且繪制出此反應中包括的蛋白質結構域。在EV71感染時，病毒復制的細胞胞質中核蛋白FBP1含量增高，表明FBP1在EV71復制過程中作為正調節蛋白與EV71中IRES結合［5］。

EV71基因組的5′?非編碼區（5′?untranslated region，5′?UTR）和3′?非編碼區（3′?untranslated re?gion，3′?UTR）構成了僅有的一個開放閱讀框（open reading frame，ORF），約占整個基因組的90%，該ORF編碼一個多聚蛋白，在病毒自身合成的蛋白酶作用下多聚蛋白被水解成前體蛋白P1、P2和P3，而P1可繼續被水解成VP1?VP4 4種衣殼蛋白，P2和P3可分別水解成2A?C和3A?D 7種非結構蛋白［6］。VP4位于病毒顆粒外殼的內側與病毒核心緊密連接，其余3種衣殼蛋白均暴露于病毒顆粒表面，因而決定病毒抗原性質的抗原表位主要位于VP1?VP3上，EV71重要的中和抗體識別位點由VP1和VP3組成的BC環以及由VP2組成的EF環構成［7］。Ku Z等用3種不同的單克隆抗體與EV71結合，結果顯示3種單克隆抗體均識別并結合EV71 VP1區GH環［8］。EV71病毒與其他腸道病毒的差異主要表現在VP1區，因此VP1區結構差異可能是導致EV71具有較強致病性的原因之一。VP1區含有重要的中和抗體識別位點，該區基因變異狀況可作為HFMD疫苗研制的靶點［9］。病毒核衣殼蛋白的變異改變病毒致病性，可以此為研究目標分析不同患兒基因型差異與病情的相關性，為疾病的防治提供依據。

2 EV71感染發病機制

HFMD的發病機制目前尚未明確。病毒與易感細胞表面受體結合后可啟動病毒感染。細胞受體在決定細胞、組織、種屬嗜性和病毒的致病性方面起到重要作用。病毒感染細胞和病毒在細胞之間傳播依靠的是不同的細胞表面分子。在感染的組織中，細胞之間的傳播在病毒發病機制中占重要作用。當病毒入侵機體后，以許多組織為目標引起胃腸道、心血管、呼吸道和中樞系統疾病。病毒結合到細胞表面受體后感染細胞，細胞受體被認為在發病機理以及組織噬性中具有決定性［4］。B類清道夫受體2（scavenger receptor class B，member2，SCARB2）和P?選擇素糖蛋白配體?1（P?selectin glycoproteinlig and 1，PSGL?1）被認為是EV71受體［10?11］。

SCARB2廣泛表達于包括中樞神經系統在內的各種器官和組織中［12］，主要分布于內涵體與溶酶體上，Yamayoshi等［11］對EV71不易感的鼠L929細胞轉染EV71高度易感的RD細胞基因組DNA后，篩選出單克隆細胞系Ltr051和Ltr246，Ltr051對EV71的感染效率類似于RD細胞，屬于高度易感，Ltr246相比于Ltr051感染效率低；進一步研究發現Ltr051細胞系攜帶人SCARB2基因。表達SCARB2的L929細胞，對檢測的EV71病毒均高度易感。Yamayoshi等［13］通過比較發現人SCARB2（hSCARB2）與鼠SCARB2（mSCARB2）有85.8%的氨基酸相同，相似性達99.9%，但表達hSCARB2的L929細胞，對于EV71的易感性卻遠高于表達mSCARB2的L929細胞，進一步研究發現hSCARB2第142～204位氨基酸在促進病毒顆粒與細胞的結合及EV71的易感性中都發揮重要作用。EV71通過位于第172位谷氨酰胺殘基周圍的VP1區與SCARB2結合［14］，SCARB2的第4個外顯子在與EV71的VP1蛋白反應中起重要作用。研究還發現位于衣殼蛋白組成的EF環壁上的氨基酸，對病毒結合SCARB2及EV71病毒感染力具有重要意義［13］。

SCARB2廣泛表達于各種細胞表面，而PSGL?1主要表達在髓系、淋巴系和樹突狀細胞表達，調節白細胞與選擇素之間的反應，因此在促炎反應中起重要作用。Nishimura等［15］研究發現EV71依賴于硫酸化的酪氨酸基團結合到PSGL?1的N端。他們同時還發現病毒衣殼蛋白第145位氨基酸殘基（VP1?145）決定了EV71是否與PSGL?1結合，通過影響病毒表面臨近的賴氨酸殘基（VP1?244）的定位發揮作用。據此推測VP1?145通過將VP1?244帶正電荷的賴氨酸鏈轉變為帶負電荷而控制病毒的結合。這些發現為病毒受體反應和EV71結合PSGL?1表達的白細胞的研究提供了前景［16］。

小腸道RNA病毒對在固有免疫抗病毒反應中起重要作用的干擾素IFNs很敏感，EV71可以通過血腦屏障進入中樞神經系統或者通過軸突從外周轉運至中樞，中樞神經系統固有免疫表達的模式識別受體（toll?like receptors，TLRs），胞質視黃酸誘導基因1（retinoic acid inducible gene?1，RIG?1）和黑色素瘤分化相關基因5（melanoma differentiation associated gene5，MDA?5）可監視病毒核酸并且啟動宿主抗病毒反應。MDA?5是RNA活化I型IFN表達的關鍵分子［17］。EV71通過RIG?1和TLR3調節抑制I型IFN反應，從而抑制機體免疫反應。腸道病毒可逃避宿主免疫系統防御到達中樞神經系統，穿過血腦屏障通過血流傳播至中樞，感染白細胞和神經細胞，神經系統的入侵被認為是發生在血腦屏障被破壞或者軸突退化的情況之下［18］。某些小RNA也參與到病毒生命周期的復制和翻譯，研究發現小分子RNA（miRNA）在病毒和宿主復雜的網絡式反應中起到重要作用，能夠調節轉錄后表達功能。miRNA的表達具有組織依賴性并且大量的同種miRNA可以成為該種miRNA是否在組織中起作用的依據［19］。對EV71發病機制進行深入研究，通過有效阻斷病毒與相應EV71受體結合而抑制病毒感染。同時通過對免疫抑制與免疫促進相關分子及其作用機制的研究，可從分子層面對病毒誘導機體發揮的免疫應答進行干預，以此為靶點，對病毒感染進行干預，減少患兒發病。

3 EV71感染的免疫調節

人類是唯一已知的HFMD相關腸道病毒感染的宿主。病毒入侵機體后機體體液免疫系統和細胞免疫系統啟動免疫應答發揮免疫防御和抗病毒作用。B細胞被抗原刺激后活化為漿細胞，漿細胞分泌免疫球蛋白發揮抗病毒效應。抗原刺激T細胞后，增殖分化為效應T細胞，在細胞因子的協同作用下發揮細胞免疫功能。

3.1 體液免疫在EV71感染中的作用

孫裕平等［20］對EV71感染為主的HFMD患兒體液免疫功能研究顯示重癥組和輕癥組患兒血清IgA、IgG含量與健康兒童無顯著差異，而IgM明顯高于健康兒童并隨著病情加重而升高，治療后IgM含量明顯下降。重癥組和輕癥組患兒補體C3、C4含量明顯低于健康兒童，隨著病情的加重而降低。可能因為IgM是感染早期產生的免疫球蛋白，病毒感染初始階段B細胞被激活分化為漿細胞產生IgM發揮抗病毒免疫作用保護機體，并且隨著病情的進展而產生更多的抗體，經過治療后抗體與病毒結合被清除而好轉。C3、C4作為重要的補體成分參與機體免疫應答，通過多個補體激活途徑參與調理吞噬靶細胞、促進炎癥反應以及清除免疫復合物而被消耗，所以會隨著病情的加重含量降低。說明可根據免疫球蛋白和補體含量判斷患兒病情進展及轉歸為臨床治療提供依據。

3.2 細胞免疫及細胞因子在EV71感染中的作用

研究表明抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）處理抗原片段后激活NK細胞和Tc細胞，通過分泌顆粒酶穿孔素直接殺傷靶細胞。Th細胞作為輔助細胞分泌細胞因子促進體液免疫系統發揮作用。彭宏君等［21］研究顯示EV71感染樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）后感染組DCs分泌的TNF?α、IL?1α、IL?6和IL?12含量明顯高于對照組且TNF?α刺激后的DCs能夠強烈刺激同種異體T淋巴細胞增殖。表明EV71能夠刺激機體免疫細胞發揮免疫應答作用。EV71可促進NK細胞、T細胞凋亡，T細胞、NK細胞比例降低對機體免疫反應產生抑制作用，而隨著病情加重比例不斷下降［22］。提示患兒病情進展進入重癥期時，細胞免疫進一步受損，B細胞介導的體液免疫可能起更大作用，由此引發的抗體和炎性因子會大量增加。疾病的嚴重程度與細胞因子的水平有關，表明細胞因子的釋放可以導致HFMD患兒的免疫損傷［23］。細胞因子可促進炎性細胞滲出，吸引中性粒細胞和單核巨噬細胞遷移至炎癥灶，增強免疫細胞的吞噬殺傷功能，還可刺激白細胞和內皮細胞釋放炎性介質導致組織損傷，加重病情發展。IFN?γ、IL?13等細胞因子能增加肺血管通透性，加重肺毛細血管滲漏，可能參與導致肺水腫，促炎因子TNF?α、IL?2、IL?6及抗炎因子IL?10在重癥HFMD患兒體內均高于普通患兒［24］，表明病毒在機體內引起嚴重的應激和全身炎癥反應，機體內存在復雜的炎癥抑制和炎癥亢進狀態。一個細胞因子的激活可引起連鎖反應激活一系列細胞因子。近年陸續報告EV71感染患者血液和腦脊液IL?10、IL?13、IFN?γ、IFN?γ誘導蛋白?10（inducible protein 10，IP?10）、單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP?1）、IFN?γ誘導單核因子（monocyte interferon inducing factor，MIG）、IL?1受體拮抗劑和粒細胞集落刺激因子（colony stimu?lating factor，G?CSF）等增高，并與EV71疾病嚴重程度相關［25?26］，說明由IL?6、IL?1β、和TNF?α等介導的急性期蛋白和趨化因子激活可能會導致病毒感染后炎癥加重和病理變化。這些研究發現有助于理解免疫細胞及其分泌的細胞因子在HFMD發病中的作用，說明細胞因子可能參與HFMD疾病進展過程，可作為患兒疾病進展的監測指標。

動態監測患兒體內免疫球蛋白、免疫細胞及細胞因子含量可有效反應機體免疫功能狀況，有效掌握患兒病情變化，作為臨床治療和預后的指導。

4 小結

目前還沒有治療HFMD的特效藥，臨床上只能對癥處理，進一步研究HFMD的病原特征、發病機制及病毒介導的免疫功能改變對于評價預后風險就顯得更加重要。通過對HFMD病原學的進一步分析和研究，揭示病毒生命周期中起關鍵作用的分子，以參與病毒生命周期復制和翻譯的分子為靶點，對病毒感染進行控制，防止病毒持續感染導致病程遷延；通過對發病機制的進一步研究可有效阻斷病毒與細胞表面分子的相互作用，減少患兒發病率和死亡率，減少后遺癥提高患兒生存質量，有助于HFMD的進一步防治；通過對患兒免疫功能的監測分析在疾病過程中免疫細胞和免疫活性物質在病情進展中的作用分析患兒病情及預后，有助于輔助臨床診斷和治療。

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Research into the etiology and alterations in immunological function of hand, foot and mouth disease caused by Enterovirus 71

WANG Yujing,CHENG Bangning
(Pediatric Clinical College of Anhui Medical University(Anhui Province Children’s Hospital),Hefei,Anhui, China,230051)

Hand,foot,and mouth disease(HFMD)is a self?limited disease characterized by multiple herpes of the hand,foot,and mouth,and caused by multiple enteroviruses in children under 5 years old. Enterovirus 71（EV71）is the major pathogen of HFMD,that can cause neurological manifestations and even death due to its neuronal apoptosis function.The purpose of this review is to summarize recent discoveries regarding the pathogen,etiopathogenesis,EV71?derived alterations in immunological function,and to provide guidance on preventing and curing HFMD.

Hand,foot and mouth disease;Enterovirus 71;Humoral immunity;Cellular immunity

安徽省衛生和計劃生育委員會科研項目（14FR017）

安徽醫科大學兒科臨床學院（安徽省兒童醫院），安徽，合肥230051

★通訊作者：程邦寧，E?mail：pcbncbn@126.com