穿心蓮轉錄因子ApNAC1的克隆、亞細胞定位及原核表達

王健+齊夢蝶+郭娟+申業+林慧馨+黃璐琦

[摘要]從穿心蓮葉片中克隆了1個NAC家族的轉錄因子，命名為ApNAC1，GenBank注冊號為KY196416。生物信息學分析表明該基因的完整編碼區包含972 bp，編碼1個323個氨基酸的多肽，預測蛋白相對分子質量為35.9 kDa，等電點為6.14。原生質體瞬時表達研究證實了ApNAC1-GFP融合蛋白特異定位在穿心蓮葉肉細胞的細胞核中，是一個核定位蛋白。實時定量PCR結果表明ApNAC1基因表達與穿心蓮內酯的積累模式一致：主要在穿心蓮的葉片里表達，而且茉莉酸甲酯處理能急劇上調其表達水平。ApNAC1基因在大腸桿菌中進行異源表達，并且被成功純化。該研究為進一步探索ApNAC1蛋白參與穿心蓮內酯生物合成的研究奠定了基礎。

[關鍵詞] 穿心蓮； NAC轉錄因子； 亞細胞定位； 表達模式； 原核表達

[Abstract] Andrographis paniculata is widely used as medicinal herb in China for a long time and andrographolide is its main medicinal constituent. To investigate the underlying andrographolide biosynthesis mechanisms， RNA-seq for A. paniculata leaves with MeJA treatment was performed. In A. paniculata transcriptomic data， the expression pattern of one member of NAC transcription factor family （ApNAC1） matched with andrographolide accumulation. The coding sequence of ApNAC1 was cloned by RT-PCR， and GenBank accession number was KY196416. The analysis of bioinformatics showed that the gene encodes a peptide of 323 amino acids， with a predicted relative molecular weight of 35.9 kDa and isoelectric point of 6.14. To confirm the subcellular localization， ApNAC1-GFP was transiently expressed in A. paniculata protoplast. The results indicated that ApNAC1 is a nucleus-localized protein. The analysis of real-time quantitative PCR revealed that ApNAC1 gene predominantly expresses in leaves. Compared with control sample， its expression abundance sharply increased with methyl jasmonate treatment. Based on its expression pattern， ApNAC1 gene might involve in andrographolide biosynthesis. ApNAC1 was heterologously expressed in Escherichia coli and recombinant protein was purified by Ni-NTA agarose. Further study will help us to understand the function of ApNAC1 in andrographolide biosynthesis.

[Key words] Andrographis paniculata； NAC transcription factor； subcellular localization； expression pattern； heterologous expression

穿心蓮為爵床科Acanthaceae植物穿心蓮Andrographis paniculata的干燥地上部分，味苦、性寒，具有清熱解毒、消腫止痛、抗菌及抗癌作用^[1-3]，臨床應用于心血管系統疾病、呼吸系統疾病、胃腸道系統疾病等^[4]。其抗炎抗感染的主要活性物質是二萜內酯類， 如穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯等^[5]。

研究表明包括茉莉酸甲酯（MeJA）在內的多種誘導子可以刺激穿心蓮內酯及其相關萜類化合物在穿心蓮體內的積累^[6-7]。為了闡明穿心蓮體內合成機制，作者對MeJA不同誘導時間的穿心蓮葉片進行了轉錄組測序。在轉錄組數據中，一個NAC轉錄因子家族成員的表達模式與穿心蓮內酯的積累模式較為吻合：在MeJA處理12 h后急劇上升，在隨后的24，48 h里都維持一個較高的表達水平。NAC轉錄因子超家族是植物中特有的轉錄因子家族，包含了眾多成員。其N-端有一個高度保守的 NAC 結構域，具有DNA結合或蛋白質和二聚體結合功能；而其C-端無論是在氨基酸序列還是長度方面都具有高度的多樣性，具有轉錄激活、抑制或者與蛋白質結合等功能^[8]。NAC家族的轉錄因子參與了植物的發育、衰老、次生壁形成以及對外界生物和非生物脅迫的各種應答反應^[9]。然而，NAC轉錄因子參與植物次生代謝卻鮮見報道。為了探索新的調控萜類代謝的轉錄因子并增加對NAC轉錄因子調控功能的理解，本研究首次克隆得到了穿心蓮NAC家族中的1個成員，命名為ApNAC1。

本研究首先對ApNAC1基因進行了生物信息學分析，并對其亞細胞定位、表達模式進行研究。最后ApNAC1在大腸桿菌進行異源表達，并被成功純化。以上工作為后續進一步研究ApNAC1的體內功能奠定了基礎。

1 材料

穿心蓮采自福建漳州，中國中醫科學院中藥資源中心郝近大研究員鑒定為穿心蓮A. paniculata。所有的大腸桿菌菌株均購自全式金生物科技公司。SYBR Green PCR Master Mix購自大連寶生物技術有限公司，KOD聚合酶購自日本TOYOBO公司，RNA提取試劑、反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司，瓊脂糖膠回收試劑盒購自Thermo Fisher公司，質粒提取試劑盒購自Omega公司，pEASY-Blunt Zero Cloning Kit，pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit，DNA marker購自全式金生物科技公司，其他試劑為國產分析純。引物合成和測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

2 方法

2.1 穿心蓮葉片RNA 提取

取100 mg穿心蓮葉片，液氮速凍后研磨成粉，加入plant RNA Reagent提取總RNA，利用NanoDrop 2000分光光度計測定RNA濃度。以總RNA為模板，以oligo（dT）為引物，利用反轉錄試劑盒合成cDNA。

2.2 穿心蓮ApNAC1編碼序列的克隆和測序

根據穿心蓮轉錄組注釋結果，ApNAC1的序列為全長cDNA。為了擴增該基因完整的編碼序列（coding sequence，CDS），設計上游引物ApNAC-F1，5′-ATGGGTGTCCGAGAAACCG-3′，下游引物ApNAC-R1，5′-TCACAGCATGAACCCGGAC-3′，以葉片RNA反轉錄得到的cDNA為模板進行擴增。將回收的特異性片段克隆到pEASY-Blunt Zero載體上，轉化到大腸桿菌 Trans1 T1中，菌落PCR鑒定陽性克隆，并提取質粒進行測序分析。

2.3 穿心蓮ApNAC1基因序列的生物信息學分析

將測序所得的CDS序列翻譯成氨基酸序列，在National Center for Biotechnology Services （NCBI） 數據庫中應用BLAST程序 （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov） 進行同源性檢索，并應用MEGA 7.0，使用NJ 法（bootstrap 1000） 構建系統進化樹。

2.4 穿心蓮ApNAC1 蛋白的亞細胞定位分析

2.4.1 構建ApNAC1亞細胞定位載體 利用引物ApNAC-F2，5′-CTTCTGCGGGGCCCGGGGATGGGTG- TCCGAGAAACCG-3′和ApNAC-R2：5′-TCCACTAGTATTTAAATGCAGCATATGAACCCGGACCCA-3′，以已測序正確的pEASY-Blunt-Zero-ApNAC1質粒為模板進行擴增，利用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit將ApNAC1克隆入雙元載體pCAMBIA1300-GFP，并測序驗證，命名為p1300-ApNAC1-GFP。

2.4.2 定位分析 取用生長4周的穿心蓮的幼嫩葉片，根據文獻的方法^[10]游離葉片原生質體，并將p1300-ApNAC1-GFP和不含插入片段的pCAMBIA1300-GFP質粒作為對照，分別轉化入穿心蓮原生質體。室溫孵育24 h，用激光共聚焦顯微鏡觀察結果。

2.5 穿心蓮ApNAC1基因的表達譜分析

采用SYBR Green Premix染料進行實時定量PCR（real-time qPCR）分析，分別用上游引物ApNAC-F3，5′-GGGAATTTCGATTGGCCTAC-3′，和下游引物 ApNAC-R3，5′-TCAGGCTGAATCGGGTACCG-3′，檢測ApNAC1在MeJA處理穿心蓮水培苗0，12，24，48 h時的基因表達變化。PCR體系為SYBR Premix 5 μL，正反引物各0.2 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL，稀釋10倍的cDNA模板1.0 μL，加ddH₂O至10 μL。PCR程序為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環。每個樣品設立3個生物學重復。

2.6 穿心蓮ApNAC1原核表達載體的構建

構建原核表達載體上pET-32a（+）-ApNAC1，首先使用限制性內切酶BamH I和Sal I對載體pET-32a（+）進行雙酶切線性化。利用引物ApNAC-F4，5′-AGGCCATGGCTGATATCGGAATGGGTG- TCCGAGAAACCG-3′和ApNAC-R4，5′-GTCGACGGAGCTCGAATTCGTCACAGCATGAACCCGGAC-3′，以測序正確的pEASY-Blunt-Zero-ApNAC1質粒為模板進行擴增。利用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit同源重組試劑盒進行克隆，將重組質粒轉化Trans1 T1大腸桿菌感受態細胞，并利用含有氨芐青霉素的LB平板進行篩選，挑選陽性克隆進行PCR鑒定，并送測序。將測序正確的重組質粒pET-32a-ApNAC1轉化入Transetta（DE3）原核表達菌株感受態細胞中。

2.7 穿心蓮ApNAC1蛋白的原核表達及分離純化

挑取陽性重組菌的單菌落，接種于2 mL含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃活化過夜后，按照1∶50接種200 mL，250 r·min^-1振搖至生長對數期（A₆₀₀約為1.0），加入終濃度為1 mmol·L^-1的IPTG于16 ℃誘導表達16 h（留取未加IPTG菌液于相同條件下培養）。誘導表達結束后，取200 μL菌液，8 000 r·min^-1離心5 min，收集菌體，用去離子水洗滌2次，加入50 μL PBS緩沖液重懸菌體，加入50 μL 2×SDS上樣緩沖液煮沸10 min，至于4 ℃備用。將剩余菌液于4 ℃，8 000 r·min^-1離心5 min收集菌體，加入5 mL Buffer A （20 mmol·L^-1 NaH₂PO₄，500 mmol·L^-1 NaCl，20 mmol·L^-1 Imidazole）重懸菌體，超聲破碎7 min，4 ℃，12 000 r·min^-1離心10 min，去除沉淀，加入Ni-NTA agarose 200 μL 于4 ℃搖晃45 min，充分結合后，4 ℃，1 400 r·min^-1離心10 min，并使用Buffer A 清洗2次后，使用250 μL Buffer B（20 mmol·L^-1 NaH₂PO₄，500 mmol·L^-1 NaCl，500 mmol·L^-1 Imidazole）洗脫蛋白2次。取2 μL洗脫液加入198 μL PBS稀釋，加入200 μL 2×SDS上樣緩沖液煮沸10 min。4 ℃，12 000 r·min^-1離心10 min后取10 μL上樣，用100 g·L^-1的聚丙酰胺凝膠進行SDS-PAGE分析。

3 結果與分析

3.1 穿心蓮ApNAC1基因的克隆及序列分析

根據轉錄組測序結果，設計特異引物，以穿心蓮葉片的cDNA做為模板，擴增該基因從起始密碼子到終止密碼子的完整編碼區，得到1條大約1 000 堿基對的特異條帶。切膠回收該片段，連接pEASY-Blunt Zero載體，鑒定出陽性克隆后，送往公司測序。測序結果表明載體中插入了目的片段（圖1）。序列分析表明該片段包含972個堿基對，編碼1個包含323個氨基酸的多肽，相對分子質量為35.9 kDa，預測等電點為6.14。利用NCBI網站的Smart Blast軟件進行同源比對，發現該蛋白與模式植物擬南芥NAC家族RD26和大豆NAC4的同源性分別為70%和59%，而在所有物種中與之同源性最高的是芝麻中的NAC蛋白，同源性高達72%。該多肽的N端包含了高度保守的NAM結構域。因此，該基因被命名為ApNAC1， GenBank注冊號為KY196416。將ApNAC1與Genbank中17個物種的23種蛋白的氨基酸序列對比，利用MEGA 7.0，使用NJ（boot-strap 1000）構建系統進化樹。ApNAC1與巴旦木Prunus persica NAC5 （PpNAC5， ALK27824.1），蘋果Malus domestica NAC （MdNAC， XP_008345087.1），煙草Nicotiana tomentosiformis NAC （NtNAC， XP_009594219.1），葡萄Vitis vinifera NAC （VvNAC， XP_002284668.1），蓖麻Ricinus communis NAC （RcNAC， XP_002533913.1），芝麻Sesamum indicum NAC （SiNAC， XP_011098342.1），擬南芥Arabidopsis thaliana NAC1-1 （AtNAC1-1， NP_001078452.1）構成一支，親緣關系較近。然而，同一植物內不同的NAC成員則具有較大差異。如擬南芥中的NAC1-1，NAC1-2，NAC1-3都分布在不同的分支里，說明盡管NAC家族成員都具有類似的保守結構域，但不同亞家族成員間序列變異顯著（圖2）。

3.2 穿心蓮ApNAC1蛋白的亞細胞定位

由于預測ApNAC1蛋白是一個轉錄因子，而轉錄因子通常為核定位蛋白。為了驗證ApNAC1的亞細胞定位，通過同源重組技術ApNAC1基因被克隆到了綠色熒光蛋白（GFP）的N末端。通過原生質體轉化，ApNAC1基因被瞬時表達在葉肉細胞中。培養24 h后，在熒光顯微鏡下觀察ApNAC1蛋白的亞細胞定位，以未融合其他基因的空載體作為對照。空載體對照中，GFP的熒光廣泛地分布于細胞的各個亞細胞結構。而融合了ApNAC1的GFP蛋白集中地分布在細胞核中，細胞的其他部位觀察不到GFP熒光。該結果驗證了生物信息學的預測結果，證實了ApNAC1定位于細胞核中，是一個核蛋白（圖3）。

3.3 穿心蓮ApNAC1基因的表達模式

穿心蓮中最重要的藥效成分穿心蓮內酯主要分布在穿心蓮的葉片中，而且它的含量受到茉莉酸甲酯（MeJA）的誘導^{[6， 11]}。為了探討ApNAC1參與穿心蓮內酯積累的可能性，對該基因的表達模式進行了分析。首先，檢測了該基因的組織特異性表達。實時定量PCR的結果表明ApNAC1主要分布葉片中，而在根和莖中的分布遠低于葉片中的分布。在MeJA處理后，該基因表達水平急劇增加，在12 h時表達量達到最高。在24，48 h時盡管表達水平略有下降，但依然遠高于未處理對照組（圖4）。該qPCR的結果與轉錄組測序的結果吻合。因此，不論是從組織特異性還是MeJA處理后的mRNA積累，ApNAC1基因都呈現出與穿心蓮內酯一致的表達模式。這個結果表明ApNAC1有可能參與穿心蓮內酯生物合成途徑的調節。

3.4 穿心蓮ApNAC1基因原核蛋白的表達

電泳遷移率變動分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是研究轉錄因子功能的重要手段。獲取有活性的轉錄因子蛋白是進行該研究的前提條件。為了獲得可溶ApNAC1蛋白，重組質粒pET32a-ApNAC1被轉化到大腸桿菌菌株Transetta （DE3）中，在IPTG誘導表達后，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳分析（圖5）。第1泳道為未加入IPTG誘導的陰性對照，第2泳道為誘導后的菌體蛋白。比較這2道菌體蛋白，發現誘導后比誘導前的蛋白在55 kDa附近之間明顯增加了1個蛋白條帶。ApNAC1蛋白預期相對分子質量為35.9 kDa，而原核表達載體pET-32a的表達標簽約為20 kDa，所以該重組蛋白大小約為56 kDa。因此表達出來的蛋白大小符合預期。采用親和色譜法，用 Ni-NTA Agarose對ApNAC1進行純化。第3泳道為純化后的蛋白，結果顯示已經獲得了純度較高的重組蛋白。

4 討論

逆境（包括生物和非生物脅迫環境）是導致植物體內次生代謝物增加的重要原因^[12]。在各種逆境下，植物能夠產生茉莉酸及其衍生物，誘導編碼次生代謝物合成酶及轉錄因子的基因表達，以適應脅迫環境^[13]。穿心蓮生物合成途徑的研究表明，在MeJA處理24 h后，穿心蓮內酯含量增加了5.25倍^[7]。目前已知AP2/ERF，bHLH，MYB 以及 WRKY等多種轉錄因子都參與了茉莉酸相關的次生代謝物積累途徑的調控^[14]。但植物中特有的轉錄因子家族——NAC家族成員直接參與次生代謝的報道卻甚為少見。最近研究顯示AaNAC2，AaNAC3，AaNAC4蛋白能夠與AaTPS1基因啟動子結合，參與調控獼猴桃果實成熟過程中單萜的合成。該結果首次表明NAC轉錄因子直接參與萜類代謝^[15]。在前期轉錄組測序結果中，盡管多種轉錄因子的表達都隨著MeJA處理時間的延長而增加，但是ApNAC1的表達增加得最為明顯：在MeJA處理12 h時，ApNAC1的表達量增加了100倍以上。本研究的qPCR數據驗證了轉錄組測序的結果，并進一步證明了該基因的葉片組織特異性分布。穿心蓮內酯和ApNAC1的積累模式的一致性暗示了ApNAC1可能參與了穿心蓮內酯合成的調控。但要確定ApNAC1基因在穿心蓮體內的功能還需要通過RNAi或過表達等手段，觀察相應的表型，最后才能闡明其確切的生物學功能。

用基因槍瞬時轉化洋蔥表皮細胞是研究蛋白亞細胞定位的常用方法，但是它也存在需要特定設備、價格昂貴、操作較為繁瑣等缺點。本研究借鑒擬南芥的原生質體轉化技術，用穿心蓮葉肉細胞的原生質體進行瞬時表達研究，不僅比基因槍法方便快捷，而且能夠更加真實地反映ApNAC1蛋白的亞細胞定位。穿心蓮葉肉細胞原生質體瞬時轉化技術不僅能用于研究穿心蓮蛋白的亞細胞定位，還可以通過共轉化報告基因的方法用于鑒定轉錄因子的生物學功能。由于穿心蓮尚未建立穩定的遺傳轉化體系，所以這項技術對鑒定轉錄因子的功能顯得尤為重要。

電泳遷移率實驗（electrophoretic mobility shift assay， EMSA）是檢測轉錄因子與體內特定基因啟動子結合的重要手段。獲得可溶的轉錄因子蛋白質是進行EMSA實驗的關鍵步驟。本文通過原核表達獲得了高純度的重組蛋白。在后續的實驗中我們將利用純化的ApNAC1蛋白，通過EMSA實驗，驗證其能否與穿心蓮內酯相關合成酶的啟動子的特定區段結合，闡明其是否直接參與穿心蓮內酯生物合成的調控。本研究為進一步探索ApNAC1在穿心蓮內酯生物合成中的功能奠定了基礎。

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[責任編輯 呂冬梅]