玄參內生真菌分離、鑒定及系統發育分析

2017-04-06 21:41:37伍曉麗宋旭紅楊宏國劉飛張雪劉金

中國中藥雜志 2017年5期

伍曉麗+宋旭紅+楊宏國+劉飛+張雪+劉金亮+陳大霞+李隆云

[摘要]分別從武隆產區玄參根、主莖、側枝、葉片和重慶市區栽培玄參側枝中分離內生真菌，根據形態學特征和26SrDNA D1/D2測序結果對其進行鑒定，并進行了種群多樣性分析，對優勢屬炭疽菌屬內生真菌構建了系統發育樹。試驗結果顯示：真菌種群多樣性指數，武隆玄參葉片>主莖=側枝>根，重慶玄參側枝>武隆玄參側枝。共計分離得到內生真菌58株，絕大部分是各種植物病原菌，其優勢屬為刺盤孢屬Colletotrichum，其中絕大多數是C. gloeosporioides和C. boninense。葉片和子芽可能是內生菌侵染的主要途徑；內生菌和病原菌可能相互轉化，受環境、基因型等多種因素影響。

[關鍵詞] 玄參；內生真菌；鑒定；系統發育分析

[Abstract] The endophytic fungi from root， main stem， branch and leaf of Scrophularia ningpoensis were isolated and identified from Wulong and Chongqing， and the population diversity analysis and phylogenetic analysis were followed. The result indicated that， as to population diversity index， S. ningpoensis from Wulong： leaf>main stem = branch>root， branch from Chongqing>branch from Wulong. Fifty-eight endophytic fungi were obtained， most of which were the pathogens of the plant. Colletotrichum was the prevailing genus， of which C. gloeosporioides and C. boninense were the prevailing strains. Leaf and seedlings might be the main path of infection. Endophytic fungi and pathogen might convert to each other， influenced by such factors as environment， genotype et al.

[Key word] Scrophularia ningpoensis； endophytic fungi； identification； phylogenetic analysis

玄參為玄參科玄參屬植物玄參Scrophularia ningpoensis的干燥根，始載于《神農本草經》，性微寒，味甘、苦、咸，具有涼血滋陰、瀉火解毒的功效，主治熱病傷陰諸證，如骨蒸、癆咳、津傷便秘、溫毒發斑，及目赤、咽痛、臃腫等^[1]。玄參是我國大宗藥材品種，市場需求巨大。目前玄參栽培以施用化肥為主，多年連續施用影響藥材品質，損害土壤肥力，破壞生態環境。而很多植物內生菌對宿主具有明顯的促生作用。內生菌（endophyte）廣泛存在于植物各器官、組織細胞內及細胞間隙，其種類隨宿主植物種類、植株器官、地域、季節氣候而變化，具有豐富的多樣性，國內外相關研究報道很多[2-5]。有研究表明，內生菌及其代謝產物具有拮抗、促生長、抗腫瘤等多種活性，可廣泛應用于農業、工業、醫藥領域^[6-9]。玄參內生菌方面的研究極少，僅見文獻報道了玄參塊根內生菌產哈巴俄苷的相關研究，且未明確鑒定出內生菌的種類^[10]。本研究對玄參內生真菌進行了分離和鑒定，并對優勢屬炭疽菌屬內生真菌進行了系統發育分析，旨在為篩選對玄參具有促生長作用的內生真菌，研發微生物肥料，減少化肥施用奠定基礎。同時也揭示了玄參內生真菌的分布規律，為進一步研究玄參化學成分與內生菌的相關性，篩選活性物質提供前期基礎。

1 材料

1.1 試驗材料采集

2015年8月，在玄參生長盛期，分別采取重慶市中藥研究院植物園（以下簡稱植物園，海拔400 m，北緯29.35°，東經106.33°）人工栽培玄參的側枝和重慶武隆仙女山楊柳村玄參基地（海拔1 350 m，北緯 29.43°，東經 107.77°）人工栽培玄參全株（葉、主莖、側枝、根），采回后立即進行內生真菌分離。

1.2 試劑與儀器

Takara9164和RR178試劑盒購自寶生物公司。DYY-6C水平電泳儀，PTC-100 型 PCR儀，Gel Doc XR凝膠成像儀。

1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：土豆200 g，切碎塊，煮汁過濾，加葡萄糖20 g，瓊脂粉7 g，定容至1 L。

2 方法

2.1 內生真菌分離與純化

植物園栽培玄參植株上部、中部、下部健壯無病蟲害側枝各取3～5枝，全部混合后剪3 cm長小段。仙女山玄參植株分解為塊根、主莖、側枝、葉片。塊根洗去泥土，輕輕刮去表面薄皮，洗凈，切小塊；植株主莖上部、中部、下部各取一段（約15～20 cm長）后混合，剪3 cm長小段；植株上部、中部、下部健壯無病蟲害側枝各取3～5枝，全部混合后剪3 cm長小段；植株上部、中部、下部健壯無病蟲害葉片各取4～6片后全部混合，剪3～4 cm²小塊。以上材料用洗衣粉水洗滌2 min，流水沖洗40 min，75%乙醇洗滌1 min，0.1%升汞消毒5 min，無菌水洗滌4次，取最后一次洗滌的洗液數滴于PDA涂布，共接種3皿，作為對照。材料用無菌濾紙吸干后，再次將根塊分為1 cm²小薄片，莖段剪0.5～1 cm長小段，葉片切0.5～1 cm²小片，接種PDA。對照和材料均置于25 ℃培養箱，黑暗，培養5～10 d后，挑取組織周圍長出的菌絲轉接入 PDA平板中純化，直到得到純凈無污染的菌落。

2.2 內生真菌鑒定

2.2.1 形態觀察觀察培養的內生真菌菌落形態，對照《真菌鑒定手冊》[11]，根據菌落以及菌絲體和孢子的形態特征進行鑒定。

2.2.2 分子鑒定采用Takara9164和RR178試劑盒對分離出的內生真菌進行基因組 DNA 提取及26S rDNA D1/D2區域序列 PCR擴增。

真菌基因組DNA提取：挑取少量菌絲體于1.5 mL EP管，加入Takara 9164 真菌裂解液50 μL，80 ℃水浴15 min，4 000 r·min^-1離心，取上清液作為PCR模板。

PCR（50 μL）體系：ddH₂O 20 μL；PCR premix（Takara） 25 μL；真菌DNA模板 4 μL；D1/D2 Forward Primer和D1/D2 Reverse Primer（Takara）各0.5 μL PCR擴增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環30次，72 ℃延伸 10 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送華大基因公司測序。

2.3 種群多樣性分析

定義 ITS-rDNA 序列同源性大于97%，同屬菌株作為同一分類單元^[12]，計算Shannon-Wiener 指數（H）^[13]。H=-∑（P_i）（log₂P_i），P_i為樣品中屬于第i種的個體的比例。

2.4 DNA 序列分析及系統發育樹構建

登陸NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）利用 BLAST將測序獲得的各菌株26S rDNA D1/D2區域序列與GenBank中的已知序列進行比對，查找相似性最高的菌種，結合形態學特征，確定分離菌株的分類地位。并用MEGA6.0 軟件按照鄰接法（Neighbour-Joining，N-J），自展數（bootstrap）為 1 000，構建系統發育樹。

3 結果與分析

3.1 玄參內生真菌的分離

內生真菌分離結果見表1，對照平板沒有菌生長。內生真菌含量葉片>側枝>主莖>根。植物園玄參側枝>武隆玄參側枝。研究中還發現，內生真菌的分離效果還受到培養基、培養溫度等因素影響。但總體來說，根部內生菌含量不如莖、葉高。

3.2 玄參內生真菌鑒定

玄參內生真菌菌落形態及分子鑒定結果見表2。分離出的內生菌形態多種多樣，見圖1。

從表2可見，武隆基地玄參內生真菌從種類來看，在所有鑒定出的41株菌株中，炭疽菌屬Colletotrichum有24株，占總數的58.54%；其次是枝穗霉屬Clonostachys 6株和莖點霉屬Phoma 5株，分別占14.63%，12.2%。在24株炭疽菌屬菌株中，有41.67%是膠孢炭疽菌C. gloeosporioides，29.17%是博寧炭疽菌C. boninense。可見炭疽菌屬Colletotrichum是武隆玄參內生真菌的優勢屬，而其中膠孢炭疽菌C. gloeosporioides和博寧炭疽菌C. boninense是優勢種。

從分布部位看，葉片中Colletotrichum占絕對優勢，占葉片內生真菌總量的71.43%，且以C. gloeosporioides和C. boninense為主；側枝中Colletotrichum也占絕對優勢，占側枝內生真菌總量的77.78%，仍然以C. gloeosporioides和C. boninense為主；主莖中Clonostachys sp.和Phoma sp.各占30%，Colletotrichum數量上占相對弱勢；根中的內生真菌僅2種。

各部位橫向比較，側枝和葉片中真菌種類接近，均以C. gloeosporioides，C. boninense為主，兼有Clonostachys sp.，Glomerella fioriniae，即側枝中77.78%的真菌與葉片中真菌一致；而主莖中只有55.56%的真菌在葉片中存在；主莖和側枝共有的真菌不多，僅有C. gloeosporioides，Clonostachys sp.這2種菌在葉片中也存在；主莖、葉片和根均有Phoma sp.。

植物園的玄參莖部內生菌，從種類看，50%是Colletotrichum，其中以C. gloeosporioides為主。可見和武隆玄參側枝一樣，Colletotrichum是優勢種屬，C. gloeosporioides是優勢種。

將植物園的玄參側枝內生真菌和武隆基地玄參側枝內生真菌橫向比較，C. gloeosporioides 是二者共有的菌，且是相同菌株，均是C. gloeosporioides strain CMT53 和C. gloeosporioides strain HC-73，不過植物園玄參側枝中的C. gloeosporioides isolate IA11在武隆玄參側枝中未分離到。

以上真菌，有14株僅鑒定到屬，主要是Phoma sp.，Clonostachys sp.，Penicillium sp.，Phomopsis sp.，說明這14株可能包含尚未發現的新種。

3.3 玄參內生真菌種群多樣性分析

計算多樣性指數結果如下：武隆玄參葉片3.268，主莖2.725，側枝2.725，根1.000，植物園側枝3.379。以葉片中真菌多樣性最高，其次是主莖和側枝，根部最低。植物園玄參側枝內生真菌多樣性高于武隆基地玄參植株的側枝。

3.4 玄參炭疽菌屬內生真菌系統發育樹構建結果

根據前述分子鑒定結果，選取20個近緣種的菌株，與分離所得炭疽菌屬菌株構建系統發育樹，結果見圖2。

從圖2可見， 13株與C. gloeosporioides的不同株系聚到一起；12株與C. boninense的不同株系聚到一起；2株與C. crassipes聚為一枝；各有1株分別與C. abscissum，C. destructivum，C. kahawae，C. fructicola聚為一枝。C. gloeosporioides組可分為4個亞組，以C. gloeosporioides strain HC-73亞組菌株數最多；C. boninense組也可分為4個亞組，以C. boninense CMT17亞組的菌株數最多。

4 討論

4.1 內生真菌的普遍性和多樣性

內生菌在植物體中的分布具有普遍性、多樣性的特點。在目前研究過的所有植物中均發現有內生菌^[14-15]。各植物體中存在的內生菌的數量、種類受植物的種類、組織、生存環境、生長階段、營養供給及兩者的基因型等多種因素影響^[16]。本研究結果再一次證明了同一植株，不同器官的內生真菌組成不同；同樣的器官和取材季節，不同取材地點的玄參側枝內生真菌組成不同。武隆玄參側枝內生真菌多樣性就遠小于植物園玄參側枝，推測是由于植物園海拔低（400 m左右），氣溫較高，環境中真菌種類繁多。而武隆基地海拔高（1 400 m左右），氣溫低，環境中真菌種類較少。

4.2 玄參內生真菌入侵途徑分析

內生菌可通過多種途徑對宿主植物進行侵染。可從植物葉片的外表皮滲入，也可以通過分解植物表皮細胞壁或通過各種自然開口（包括側根發生處、氣孔、水孔等）或傷口等傳播途經進入植物^[17-21]。就玄參而言，內生真菌浸染植株可以通過幾個途徑：塊根浸染，子芽帶菌，莖部侵染，葉部侵染。前述真菌多樣性分析結果和分子鑒定的結果表明，側枝中77.78%的真菌與葉片中真菌一致；而主莖中只有55.56%的真菌在葉片中存在；主莖和側枝共有的真菌僅有C. gloeosporioides，Clonostachys sp.，這2種菌在葉片中也存在；主莖、葉片和根均有Phoma sp.。分析玄參各部位的特性：根部表皮較致密，除了土壤或昆蟲造成的微小傷口，其余部位不利于真菌入侵，且根部組織致密不透氣，水分較多，不利于多數真菌定殖；葉片表皮細胞柔軟，有大量氣孔，適合真菌入侵，且葉片內部組織疏松透氣，有一定弱光，水分適宜，適合很多真菌定殖；莖部表皮較硬，不適合真菌入侵，但內部疏松透氣，水分適宜，適合真菌定殖；此外，筆者曾分離子芽內生真菌，得到多達7個菌，和主莖、側枝帶菌量相近。根據以上分析推測，玄參中大多數內生真菌是從葉片（氣孔、傷口等）入侵，經側枝到主莖，最后進入根部。其次是子芽本身內部帶菌以及褶皺帶菌侵入幼莖。而根部、主莖、側枝也可以由微小傷口侵染少量內生真菌。即葉片是玄參內生真菌侵入的主要途徑，子芽帶菌是次要途徑。由此也可以推測，大多數玄參病原真菌也是由葉片和子芽侵入植株。因此，預防玄參病害，應該主要在葉面噴施藥劑，其次，應該選擇健壯無病子芽以及對子芽進行殺菌藥劑浸泡。

4.3 內生菌和病原菌的關系探討

目前，植物內生菌較被公認的定義是指那些在其生活史的一定階段或者全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內部的真菌或者細菌，被感染的宿主植物（至少是暫時）不表現出外在癥狀^[22]。它們不僅包括了互惠共利的和中性的內生共生微生物，也包括了那些潛伏在宿主體內的病原微生物。根據這個概念，內生菌和病原菌的界限就比較模糊。有的內生菌對宿主具有一定毒性，在雙方的各種力量處于均衡狀態，寄主不會產生明顯的病癥。如果這種均衡被破壞，比如在宿主植物衰老或受環境條件脅迫導致抵抗能力減弱，則內生菌有可能使宿主致病或抑制宿主植物生長^[23-24]，即轉化為了病原菌。如Faeth^[25]發現，在貧瘠的土地上感染Festuca arizonica的植物明顯比沒有感染的植株生長慢，而在營養豐富條件下生長的植株則不存在這種現象。此外，曹理想等^[26]發現健康香蕉葉中的內生真菌主要為C. gloeosporioides，占60.7%；而曾大興^[27]的研究文獻提到，C. gloeosporioides和引起香蕉果實腐爛的香蕉炭疽病菌C. musae在分子水平其實差異很小，至今C. musae是獨立的一個種還是屬于C. gloeosporioides仍然存在很大爭議。這從一個側面佐證了內生菌和病原菌其實可能相互轉化。

可見，同一植物中，對有的內生真菌而言，是作為內生菌促進宿主生長、對宿主無影響還是作為病原真菌導致宿主病害，受地理位置、季節、外界小環境變化、宿主基因型及生理狀態、真菌自身基因型及活性等多種因素影響。這反映了自然界真菌與植物關系極其豐富的多樣性、可變性以及動態平衡。可以據此推斷，不少病原菌初期就是以內生菌方式潛伏于宿主細胞中。內生真菌與宿主植物的關系見圖3。絕大多數玄參內生真菌是各種植物的病原菌，Phoma sp.還是玄參葉斑病病原，見表3。玄參大田病害比較嚴重，推測分離出的內生真菌中可能有一些是玄參的病原菌，在條件不適宜爆發時，它們以內生菌的形態潛伏于玄參植株內，當條件合適，即導致玄參病害。

既然在外界條件適宜時，內生菌和致病菌是能夠相互轉換的，因此，在防治植物病害時，不能一味被動地在病害爆發后施用藥劑，而應在充分研究發病條件的基礎上，通過選擇和培育壯苗、選育抗病品種、改變田間通風透光條件、選擇栽培適合的地塊等農藝措施預防病害，或在病害發生后通過這些措施促使致病菌向內生菌方向轉換，從而治療病害。

下一步筆者擬分別開展分離所得內生真菌對玄參的促生長作用和致病性研究，以篩選促生真菌，同時進一步研究內生菌和病原菌的內在聯系。

[參考文獻]

[1] 夏聰華，石森林，葛衛紅，等.玄參藥理活性研究進展[J]. 中國藥師，2008，11（8）：911.

[2] 王菲. 陜西漢中古旱蓮內生菌多樣性的研究[D].漢中：陜西理工學院，2016.

[3] 王雪君，賈瑞宗，郭運玲，等.水稻4個生長時期莖部可培養內生菌多樣性分析[J]. 熱帶作物學報，2015，36（6）：1078.

[4] 張輯.中國蘭屬植物內生菌多樣性研究[D].北京：中國林業科學研究院，2012.

[5] 楊兵，張春英，王獻，等.杜鵑花根系內生菌資源調查及多樣性分析[J].河南農業大學學報，2010，44（3）：290.

[6] 姚廣龍，李樂，邢炎慧，等.海南全緣褶萼苔內生真菌的分離及抑菌活性的初步研究[J]. 化學與生物工程，2016，33（7）：52.

[7] 董金香，鄧毅，劉靚，等.甘肅栽培甘草內生菌發酵液與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷體對LPS致raw264.7分泌炎癥因子的影響[J].陜西中醫藥大學學報，2016，39（4）：76.

[8] 阮迪申，曾加會，晁元卿，等.重金屬脅迫下內生菌對宿主植物的解毒機制[J].微生物學通報，2016，43（12）：2700.

[9] 王真真，徐婷，袁珊珊，等.水稻內生放線菌OsiRt-1的分離鑒定及對稻瘟病的防治作用[J].微生物學通報，2016，43（5）：1009.

[10] 張林甦，趙德剛.玄參愈傷、不定根和內生菌產哈巴俄苷的比較[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（20）：136.

[11] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979：2.

[12] McCaig A E， Glover L A， Prosser J I. Molecular analysis of bacterial community structure and diversity in unim-proved and improved upland grass pastures[J].Appl Environ Microbio1， 1999， 65（4）： 1721.

[13] 吳曉菡，李文超，秦路平.天目山山胡椒不同部位內生真菌組成及多樣性分析[J].植物資源與環境學報，2012，21（2）：107.

[14] Rodriguez R J， White Jr J F， Arnold A E， et al. Fungal endophytes： diversity and functional roles[J]. New Phytol， 2009， 182 （2）：314.

[15] Rodriguez R， Redman R. More than 400 million years of evolution and some plants still can′t make it on their own plant stress tolerance via fungal symbiosis[J].J Expe Bot， 2008，59（5）： 1109.

[16] 姚領愛，胡之璧，王莉莉，等.植物內生菌與宿主關系研究進展[J].生態環境學報，2010，19（7）：1750.

[17] Hashiba T， Narisawa K. The development and endophytic nature of the fungus Heteroconium chaetospira[J].FEMS Microbiol Lett， 2005，252（2）：191.

[18] 王堅，刁治民，徐廣，等.植物內生菌的研究概況及其應用[J].青海草業，2008，17（1）： 24.

[19] 孫劍秋，郭良棟，臧威，等.藥用植物內生真菌多樣性及生態分布[J].生命科學， 2008， 38（5）： 475.

[20] Kumar D S， Hyde K D. Biodiversity and tissue-specificity of endophytic fungi in Tripterygium wilfordii[J].Fungal Divers，2004，17（1）：69.

[21] Arbara S， Christine B. The endophytic continuum[J]. Mycol Res，2005， 109（6）： 661.

[22] 胡桂萍，鄭雪芳，尤民生，等.植物內生菌的研究進展[J].福建農業學報，2010，25（2）：2264.

[23] 杜素娟，郭曉恒.植物內生真菌對植物次生代謝產物的影響[J]. 現代農業科學， 2009， 16（5）： 17.

[24] Kogel K H， Franken P，Ckelhoven R. Endophyte or para-site-what decides[J]. Curr Opin Plant Biol，2006，12（9）：358.

[25] Faeth S H， Helander M L，Saikkonen K T. Asexual neotyphodium endophytes in a native grass reduce competitive abilities[J].Ecol Lett， 2004，7（4）： 304.

[26] 曹理想，田新莉，周世寧.香蕉內生真菌、放線菌類群分析[J].中山大學學報：自然科學版，2003，43（2）：70.

[27] 曾大興，戚佩坤，姜子德.香蕉炭疽菌菌株親緣關系的RAPD分析[J].菌物系統，2001，20（3）：324.

[28] 琚亮亮.葡萄座腔菌（Botryosphaeria spp.）致病性分化及蘋果輪紋病侵染來源研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2014.

[29] 馬健.楊樹（Populus spp.）與茶藨子葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）互作中SA和H₂O₂的信號轉導特征[D].北京：中國林業科學研究院，2012.

[30] 崔朝宇.江西葡萄生長后期3種爛果病害病原菌的初步研究[D].南昌：江西農業大學，2015.

[31] 邵帥，戴軍，杜馨，等.降解黃曲霉毒素B-1菌株的發酵條件優化及降解機制[J].食品科學，2016，37（5）：138.

[32] 曾學英.大葉桉炭疽病病原菌的鑒定及室內藥劑篩選[J].林業科技開發，2015，29（4）：121.

[33] 湯銥泠，周國英，李河，等.多基因序列鑒定油茶炭疽病原Colletotrichum boninense新種[J].熱帶作物學報，2015，36（5）：972.

[34] 張國輝，王龍，任永權，等.藥用植物太子參3種病害的病原鑒定與病害分析[J].江蘇農業科學，2016，44（7）：177.

[35] 何平，周娟，李敏慧，等.荔枝葉部真菌病害鑒定[C]. 廣州：中國菌物學會第五屆會員代表大會暨2011年學術年會，2011：2.

[36] 劉威，蔣妮，葉云峰，等.砂仁莖枯病病原菌的分離與鑒定[J].貴州農業科學，2014，42（11）：127.

[37] 趙振玲，張智慧，楊維澤，等.云南黃蓮、唐松草、開口箭炭疽病病原的初步鑒定[J].西南農業學報，2014，27（4）：1543.

[38] 賈玉，鄭翠梅，張廣民，等.山東省主產煙區煙草炭疽病菌的鑒定與分子檢測[J].山東農業科學，2012，44（4）：10.

[39] 馬甲強，王生榮，袁慶華，等. 苜蓿毀滅刺盤孢菌的主要生物學特性[J].植物保護，2016，42（4）：105.

[40] 邢紅梅，丁平，王克榮，等.紅掌毀滅炭疽菌的分子檢測[J].華中農業大學學報，2011，30（5）：589.

[41] 李河，周國英，徐建平，等.一種油茶新炭疽病原的多基因系統發育分析鑒定[J].植物保護學報，2014，41（5）：602.

[42] 劉威，葉乃興，陳玉森，等.茶樹炭疽菌Colletotrichum fructicola的鑒定及系統發育分析[J].茶葉科學，2014，34（1）：95.

[43] 王薇，符丹丹，張榮，等.蘋果炭疽葉枯病病原學研究[J].菌物學報，2015，34（1）：13.

[44] 劉倩麗，周國英，劉成鋒，等.檀香炭疽病病原鑒定及其生物學特性研究[J].熱帶作物學報，2014，35（11）：2266.

[45] 張春霞，李加智，何明霞，等.兩種橡膠炭疽病菌生物學特性的比較[J].西南農業學報，2008，21（3）：667.

[46] 張榮，王素芳，崔靜秋，等.陜、豫兩省蘋果炭疽病病原鑒定[J].中國農業科學，2009，42（9）：3224.

[47] 趙振玲，劉丹婷，楊維澤，等.川芎炭疽病病原鑒定及4種殺菌劑對病原的抑制作用[J]. 安徽農業科學，2010，38（12）：6260.

[48] 楊蕊，石明旺，趙榮艷，等.蒜薹炭疽病病原鑒定及其生物學特性研究[J].中國農學通報，2011，27（4）：160.

[49] 張敬澤，胡東維，徐同.柿樹炭疽菌侵染寄主的細胞學研究[J].菌物系統，2003，22（4）：645.

[50] 戴啟東，李廣旭，楊華，等.樹莓炭疽病病原菌鑒定[J].果樹學報，2013，30（4）：672.

[51] 張國輝，張文華，劉冬蓮.八月瓜炭疽病的病原菌鑒定及病害分析[J].中國農學通報，2011，27（13）：277.

[52] G O Alwora， E K Gichuru. Advances in the use of fungicides to manage coffee leaf rust and coffee berry disease in Kenya[C]. 北京：第十屆國際植物病理學大會暨中國植物病理學會2013年學術年會，2013：1.

[53] 李秀豐，謝美華，李雪玲，等.一株石榴炭疽病病原真菌的鑒定[J].楚雄師范學院學報，2014，29（3）：53.

[54] 楊友聯，李樹江，劉作易.虎耳草炭疽病病原菌鑒定[J].微生物學通報，2016，43（6）：1.

[55] 周娜，胡軍華，姚廷山，等.江津龍華W·默科特桔葉片黃化致病真菌的分離與鑒定[J]. 中國南方果樹，2015，44（3）：38.

[56] 楊友聯，蔡磊，喻子牛，等.蘭科植物上炭疽菌屬真菌系統學研究[C].張家界：2010年中國菌物學會學術年會，2010：2.

[57] 商鴻生，賈明貴.白三葉黃斑病的發現和病原菌鑒定[J].草業科學，1990，7（2）：35.

[58] 尹萬瑞. 核桃枝枯病病原鑒定及藥劑防治研究[D].雅安：四川農業大學，2015.

[59] 李淑斌，張顥.柏木枯萎病病原菌的形態特征及分子鑒定[J].華北農學報，2011，26（2）：190.

[60] 袁志林，陳益存，汪陽東.一種新發生的油桐葉枯病病原真菌[J].菌物學報，2011，30（4）：658.

[61] 楊友聯，李樹江，胡海雪，等.灰氈毛忍冬頂枯病病原菌的分子鑒定[J].西南農業學報，2015，28（5）：2107.

[62] 倪萌.玄參葉斑病的病原學、發生規律及防治技術研究[D].武漢：華中農業大學，2009.

[63] 呂茹婧. 荸薺莖點霉稈枯病病原學及其毒素基本性質研究[D].武漢：華中農業大學，2012.

[64] 嚴加林.紫莖澤蘭褐斑病的診斷鑒定及病原菌的主要生物學特性研究[D].重慶：西南大學，2014.