擬層孔菌屬中7種羊毛甾烷型三萜抗腫瘤活性及構效關系研究

史幀婷+包海鷹+馮爽

[摘要]對擬層孔菌屬中紅緣擬層孔菌Fomitopsis pinicola和藥用擬層孔菌F. officinalis子實體的7種羊毛甾烷型三萜類化合物fomitopsin C（1）、3-酮基-去氫硫色多孔菌酸（2）、去氫齒孔酮酸（3）、3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸（4）、松苓酸A（5）、栓菌酸（6）和齒孔酸（7）進行了分離純化；體外抗腫瘤方面，采用MTT法測試7種單體化合物對人乳腺癌MCF-7細胞、人宮頸癌Hela細胞、人肝癌HepG2細胞和人肺癌A549細胞增殖的影響，結果表明7種化合物對MCF-7細胞較為敏感，對MCF-7半數抑制濃度IC₅₀為2<5<4<1<3<6<7；體內抗腫瘤方面，采用H22荷瘤小鼠模型，對比研究體外抗腫瘤活性較好的化合物2～5對小鼠的影響，結果表明化合物2和化合物4抗腫瘤活性好，并呈現一定的劑量依賴關系，化合物2， 4， 5劑量為20 mg·kg^-1時的抑瘤率分別為65.31%， 59.75%， 58.72%，接近陽性藥組的抑瘤率69.19%；近一步試驗表明抗腫瘤作用與抑制VEGF表達和免疫調節相關，對細胞因子IL-4和IFN-γ表達的影響較大，與抗氧化作用關聯性較少，根據結果推斷出羊毛甾烷型四環三萜結構抗腫瘤構效關系可能為，在3位羥基被酮基或乙酰基取代和C環中15位連有羥基時，此類化合物的抗腫瘤作用增強。

[關鍵詞] 紅緣擬層孔菌； 藥用擬層孔菌； 羊毛甾烷型四環三萜； 抗腫瘤； 構效關系

[Abstract] Seven lanostane-type triterpenes including fomitopsin C（1），3-keto-dehydrosulfurenic acid（2），dehydroeburiconic acid（3），3-acetyloxylanosta-8， 24-dien-21-oic acid（4），pinicolic acid A（5），trametenolic acid B（6），and eburicoic acid（7），were isolated from the fruitbodies of Fomitopsis pinicola and F. officinalis. In vitro assay， all compounds were evaluated against MCF-7， HeLa， HepG2 and A549 cells lines using the MTT assay and the structure-activity relationship of antitumor activity was discussed. The results showed that the seven compounds were more sensitive to MCF-7 cells.The IC50 value for MCF-7 was 2<5<4<1<3<6<7. H22 tumor mouse model was used to assay compounds 2， 3， 4 and 5 in vivo. Compounds 2 and 4 had obvious effect and the necrosis area and measurement were positively correlated. The results showed that compounds 2， 4 and 5 had significant antitumor activities at a dose of 20 mg·L^-1with 65.31%， 56.71%， 58.72% suppression， respectively， approaching to CTX group with 69.19% suppression in subcutaneous H22-implanted mice.The results showed that these compounds had significant against the expression of VEGF，cytokines IL-4 and IFN-γ tumor， additionally， the structure-activity relationship of lanostane-type triterpenes indicated that the acetoxyl or carbonyl at C-3 and hydroxy at C-15 can enhance the antitumor activity.

[Key words] Fomitopsis pinicola； Fomitopsis officinalis； lanostane-type triterpenes； antitumor； structure-activity relationship

癌癥疾病人們談之色變，它是人類健康的主要威脅之一，其分布廣、患者多，目前各國學者對其研究一直火熱，本研究以隸屬于真菌界Fungi，擔子菌門Basidiomycota，擔子菌綱Basidiomy cetes，多孔菌目Polyporales，多孔菌科Polyporaceac擬層孔菌屬Fomitopsis紅緣擬層孔菌F. pinicola和藥用擬層孔菌F. officinalis子實體為試驗原材料^[1]，紅緣擬層孔菌其味微苦、性平，具滋補強壯、扶正培本、祛風除濕、安神定志和強心等作用，在東北地區民間當作“桑黃”藥用^[2]，趙興華等^[3-5]研究表明其子實體和發酵產物氯仿提取物均具有較高的抑瘤率，能夠顯著地延長小鼠的生存率，并證明了3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸和松苓酸A為其活性成分。藥用擬層孔菌在新疆被稱為“阿里紅”，是維吾爾醫常用的民族藥材，用于治療腹痛、感冒、肺結核患者盜汗和慢性氣管炎^[6]。研究表明其子實體乙酸乙酯提取層具有非常好的抗腫瘤活性及提高機體免疫力的活性，進一步研究表明3-酮基-去氫硫色多孔菌酸，去氫齒孔酮酸為其活性成分^[7-8]。本研究在前人研究的基礎上，分離得到的7種羊毛甾烷型三萜類化合物：fomitopsin C（1）、3-酮基-去氫硫色多孔菌酸（2）、去氫齒孔酮酸（3）、3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸（4）、松苓酸A（5）、栓菌酸（6）和齒孔酸（7），進行了體內外的抗腫瘤實驗，并對其構效關系進行了分析。

1 材料

原材料：藥用擬層孔菌子實體F. officinalis采自內蒙古阿爾山，紅緣擬層孔菌子實體F. pinicola采自吉林省長白山，均由吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心圖力古爾教授鑒定。

瘤株：人乳腺癌細胞 MCF-7、人宮頸癌細胞Hela、人肝癌細胞 HepG2和人肺癌細胞A549均由吉林大學基礎醫學部藥理實驗室提供。

實驗動物：清潔級昆明種小鼠，雌性，5～6 周齡，體重18～22 g，由吉林大學實驗動物中心提供，許可證號SCXH-（吉）2015-0067。

萬能高速粉碎機（奧豪斯儀器（上海）有限公司）、 N-1200B型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）、 A-1000S型循環水真空泵（上海愛朗儀器有限公司）、 DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）、RY-2型顯微熔點檢測儀（天津市國銘醫藥設備有限公司）、 AUY電子分析天平（日本SHIMAOZU公司）、 WFH-308B手提式紫外分析儀（上海精科實業有限公司）、SB-54原子吸收分光光度計（Avanta PN GBC，Australia）、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、甲醛（北京化工廠）、MCO-15AC型CO₂培養箱（SANYO）、A-5082酶標儀（Sunrise）；新生牛血清（杭州四季青公司）；青霉素和鏈霉素（華北制藥有限公司）；RPMI-1640培養基，DMEM培養基，MTT （Sigma），A-5082酶標儀（Sunrise），RM2016型石蠟切片機（Leica），TGL-16C離心機（上海安亭科學儀器廠），高效切片石蠟（上海華永石蠟有限公司），HE染色材料（上海遠慕生物科技有限公司），MDA，SOD， CAT，GSH-Px，IL-2，IL-4 試劑盒（南京建成生物制品有限公司）。

2 方法

2.1 化合物的提取、分離和純化

藥用擬層孔菌子實體陰干（5 kg），粉粹后置于提取罐中，利用冷凝回流法，依次使用石油醚（60～90 ℃）提取溫度 65 ℃、乙酸乙酯提取溫度80 ℃分別提取3次，減壓濃縮分別合并浸膏，得到石油醚層（150 g）和乙酸乙酯層浸膏（820 g），將2層提取物浸膏分別用適量80～100目硅膠拌樣，干樣上200～300目及300～400目硅膠柱多次，用石油醚-乙酸乙酯（200∶1～1∶1），石油醚-丙酮（30∶1～1∶1），二氯甲烷-甲醇（50∶1～1∶1）洗脫劑系統進行多次梯度洗脫，從石油醚層得到化合物1（60 mg），乙酸乙酯層得到化合物2（1 146 mg）和3（2 582 mg）。紅緣擬層孔菌（5 kg）經過同上方法，得到石油醚層（200 g）和乙酸乙酯層浸膏（790 g），從石油醚層中得到化合物4（400 mg），乙酸乙酯層中得到化合物4（1 164 mg）和5（1 132 mg），經過高效液相制備得到化合物6（98 mg）和7（131 mg），通過重結晶等方法對得到的7個化合物進行純化。

2.2 體外抗腫瘤活性研究

本研究采用MTT法檢測細胞的存活率，將人乳腺癌細胞 MCF-7、人宮頸癌細胞Hela、人肝癌細胞 HepG2和人肺癌細胞A549的細胞保存管從液氮中取出，迅速轉移到37 ℃ 恒溫水域中，不斷振搖直至完全溶解，置于1 000 r·min^-1離心機中，離心10 min，無菌條件將細胞凍存液倒出，移入1 mL完全培養液，輕輕吹打使細胞懸浮，然后轉移到培養瓶中，再向培養瓶中加入4 mL完全培養液，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，如有細胞團快，輕輕吹打使細胞，使呈單個細胞分散狀態，瓶口半旋置于細胞培養箱中，培養條件為 5% CO₂，37 ℃和飽和濕度；4種細胞均為貼壁細胞，每隔12 h將細胞培養瓶置于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態，當細胞培養瓶底部有80%的面積有細胞附著生長時，棄去培養液，用PBS緩沖液沖洗2次，棄去PBS緩沖液，加入2 mL胰酶，置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態，當細胞變成圓粒形，輕輕敲打瓶壁，加入1 mL完全培養液，終止消化，并移入到無菌離心管中，1 000 r·min^-1離心5 min，倒去上清，用1 mL完全培養液輕輕吹懸，并移入到培養瓶中，向培養瓶繼續中加入4 mL完全培養液，輕輕吹打使細胞，使呈單個細胞分散狀態，瓶口半旋置于細胞培養箱中繼續培養，培養條件為同上；將傳夠3代的單個細胞懸液（6×10⁴個/mL）接種于96孔板上，每孔100 μL。在培養箱（37 ℃，5% CO₂）中培養24 h后分別加入化合物1～7的不同濃度待測樣品，終質量濃度分別為1.56，3.13，6.25，12.50，25.00，50.00，100.00，200.00 mg·L^-1，每組設5個復孔，繼續培養48 h，于培養結束前4 h，每孔加入20 μL的MTT 溶液（5 g·L^-1）。終止培養，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在570 nm處用酶標儀測定各孔吸光度值（A），記錄結果，采用 SPSS 19.0 對數據進行統計分析，計算細胞增殖抑制率及半數抑制濃度（IC₅₀）。

2.3 體內抗腫瘤活性研究

體內實驗接近生理條件更能反映出藥物對機體的綜合作用，萜類化合物發揮抗腫瘤的藥理作用基本途徑一般有3種：①抑制癌細胞生長；②免疫調節；③對抗自由基。本研究選擇體外抑瘤作用較好的化合物2～5，檢測對H22荷瘤小鼠的影響，通過腫瘤的大小，腫瘤切片細胞的形態的變化，腫瘤勻漿液中血管內皮生長因子VEGF 的含量，檢測4種單體化合物對實體腫瘤本身的影響；通過檢測荷瘤小鼠的免疫器官指標及血清中免疫因子IL-2，IL-4，IFN-γ，TNF-α 含量的變化，探討4種化合物對荷瘤小鼠免疫系統的影響；通過檢測荷瘤小鼠肝臟組織勻漿液中MDA，SOD酶，CAT酶，GSH-Px酶含量水平的改變，初步探討4種化合物對荷瘤小鼠抗氧化功能方面的作用。

參照池夢怡^[8]試驗方法，建立小鼠H22腹水瘤模型，給藥體積為20 mL·kg^-1，陽性組腹腔注射環磷酞胺（CTX），質量分數為20 mg·kg^-1，每48 h 1次；陰性組灌胃生理鹽水20 mL·kg^-1，每24 h 1次；供試組灌胃給藥化合物2～5，其中高劑量組為20 mg·kg^-1，中劑量組為10 mg·kg^-1，低劑量組為5 mg·kg^-1，每隔24 h 1次。連續10 d后禁食禁水12 h，第11天小鼠眼球靜脈取血靜置30 min，2 000 r·min^-1低溫離心15 min，取血清，利用ELISA法測免疫因子IL-2，IL-4，TNF-α，IFN-γ的含量，后處死小鼠，取脾臟、胸腺、瘤塊，稱重，計算胸腺指數、脾指數和抑瘤率；每組隨機選取5個瘤塊用4 %甲醛固定，待做腫瘤切片用，剩余瘤塊-80 ℃保存，待測瘤塊中的VEGF；取肝臟，待測肝臟中MDA，SOD酶，CAT酶，GSH - Px酶的含量，對結果進行分析。

抑制率=1-給藥組瘤質量模型組瘤質量×100%

胸腺（脾）指數=1 000×胸腺（脾）質量體重

3 結果與分析

3.1 化合物的結構鑒定和純度檢測

MS，¹H-NMR，¹³C-NMR結合COSY，HSQC，HMBC，ROESY譜圖化合物1～7分別為fomitopsin C^[9]，3-酮基-去氫硫色多孔菌酸^[10-11]，去氫齒孔酮酸，3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸^[12]，松苓酸A^[13]，栓菌酸^[12]，齒孔酸^[14]。經高效液相色譜法檢測，7種純化后的單體化合物純度均在95%以上。

3.2 體外抗腫瘤活性研究

7種化合物對人乳腺癌MCF-7細胞、人宮頸癌Hela細胞、人肝癌HepG2細胞和人肺癌A549抑制細胞增殖的作用，見圖1。化合物2對4種瘤細胞的抑制作用較強，化合物6和化合物7對4種細胞的抑制作用較弱。

采用SPSS 19.0軟件對不同濃度化合物抑瘤率曲線進行擬合，見表1。

7種化合物對MCF-7細胞較為敏感，對MCF-7半數抑制濃度IC₅₀分別為化合物2<化合物5<化合物4<化合物1<化合物3<化合物6<化合物7。

3.3 體內抗腫瘤活性研究

3.3.1 H22對荷瘤小鼠腫瘤的影響 腫瘤的大小可以直接反映出藥物的抑瘤效果，見表2，4種單體化合物對H22荷瘤小鼠腫瘤都有一定的抑制作用，并呈一定的量效關系，其中化合物2>化合物4>化合物5>化合物3，化合物2高劑量的抑瘤率達到了65.31%，化合物4高劑量的抑瘤率達到了59.75%，接近陽性藥環磷酰胺的抑瘤率69.19%。

通過觀察HE染色的H22實體瘤組織切片細胞形態，可以從細胞水平反映藥物對腫瘤的影響，將腫塊石蠟包埋、切片、HE 染色后置于光鏡下觀察（×200）腫瘤細胞形態學的變化，結果見圖2，可知模型組小鼠腫瘤細胞生長旺盛，細胞核大，排列緊密，細胞膜完整，壞死區少見；用藥組腫瘤細胞呈局灶性或大片狀壞死，可見大面積紅染的壞死區，腫瘤組織的排列疏松，腫瘤細胞失去常規形態，并且腫瘤壞死區的面積與劑量呈正相關。由此推斷，4種化合物可以使腫瘤細胞變形、壞死及生長受到抑制。

利用面積檢測軟件Motic Images Advanced 3.2對切片中壞死區進行面積檢測分析，結果見表3，綜合比較腫瘤壞死面積化合物2>化合物4>化合物5>化合物3，壞死面積大小與用藥劑量呈現正相關，與對H22荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用結果相符。

癌癥的增長、入侵和轉移與血管生成密不可分，VEGF家族參與了血管的形成過程，并且大多數的實體腫瘤都表現出血管內皮生長因子的超表達^[15-17]，與模型組相比，4種化合物的高劑量組對小鼠腫瘤中VEGF有明顯的抑制作用，可以有效地降低VEGF的表達，化合物2和化合物4的抑制作用較好，高劑量組可以明顯降低小鼠腫瘤中VEGF的含量，并且存在一定的量效關系，由此推斷4種化合物抗腫瘤作用與抑制VEGF的表達相關，可能是通過干擾VEGF的表達這一途徑來影響血管的形成，從而達到抗腫瘤的目標見表4。

3.3.2 H22對荷瘤小鼠免疫系統的影響 脾臟與胸腺是機體重要的免疫器官，參與調解機體的免疫反應，見圖3，4，模型組與正常對照組相比，胸腺指數與脾臟指數指數明顯升高，有可能說明小鼠在這階段正處于免疫亢進狀態；而與模型組相比，化合物2和化合物3的高劑量組可使脾臟指數降低，低劑量組沒有使脾臟指數降低，反而明顯升高，由此可以初步推斷化合物2和化合物3為免疫增強劑，但達到一定的劑量時，可能有免疫抑制作用；化合物4的作用趨勢與陽性藥相似，說明化合物4可能為免疫抑制劑。

血清中的細胞因子IL-2，IL-4，IFN-γ和TNF-α在精密調節機體自身免疫功能過程中起主要作用，其中IL-4已經被公認為是負向免疫調節細胞因子，抑制其他炎性因子的長生，與腫瘤免疫息息相關^[18]，IFN-γ能誘導細胞凋亡和抑制細胞周期的進展，并控制Th1 / Th2的平衡^[19]。

與空白對照組相比，模型組小鼠血清中的IL-4值升高，IFN-γ的值降低；與模型組相比，各給藥組的IL-4含量均有不同程度的下降，而化合物2，4，5的高劑量組IFN-γ含量有顯著性升高（P<0.01）；4種化合物對細胞因子IL-2和TNF-α的表達影響較小，見表5。

3.3.3 H22對荷瘤小鼠抗氧化功能的影響 氧化應激反應與腫瘤密切相關，參與腫瘤發生、發展、預防和治療的各個階段^[20]，腫瘤患者機體中氧化還原酶系統（包含的酶有CAT，SOD，GSH-Px及GR等^[21-22]）不能對腫瘤細胞活性氧的產生進行正常的調控，而活性氧的增多可增強脂質過氧化反應，產生有害的氧化產物，如MDA^[23]。本研究對4種化合物作用到H22荷瘤小鼠后，肝臟中CAT，SOD，GSH-Px 3種酶水平及MDA含量的進行了檢測，見表6，與模型相比，各給藥組的MDA含量均有不同程度的下降，而各化合物高劑量組的MDA含量顯著性降低（P<0.05）；與模型組相比，各給藥組對SOD和CAT含量水平影響小，只有化合物2中劑量和化合物5高劑量組顯著性升高（P<0.05）；與模型組及環磷酰胺組相比，各給藥組GSH-Px含量均升高，各化合物的高劑量組GSH-Px的含量顯著性升高（P<0.05），結果顯示，4種化合物對CAT酶和SOD酶幾乎沒影響，僅高劑量組可以降低MDA含量，升高GSH-Px的水平，推斷4種化合物的抗腫瘤作用的機制與抗氧化作用關聯性較少。

3.4 構效關系分析

本研究對分離的7種羊毛甾烷型三萜類化合物進行了初步的構效關系討論，化合物1，4～7結構中8，9位碳是雙鍵，化合物2，3母核結構中的雙鍵位置是7，9（11）共軛結構，2類物質的IC₅₀沒有特別明顯的差異，故在體外抑瘤作用中，母核上雙鍵的位置對抗人肝癌HepG2功效影響較小。化合物2在結構上比化合物3在15位多了1個羥基，而化合物2，3的抗腫瘤活性差別較大，說明C-15位置上的羥基有助于化合物抗腫瘤活性的增強。化合物4在3位有乙酰氧基，IC₅₀較小，說明3位酯基取代能增強抗腫瘤活性。化合物1的13位羥基與26位羧基發生分子內酯化，在13位形成聚酮結構，化合物1的IC₅₀較大，分子間酯化對抗腫瘤作用的影響還有待進一步研究。化合物2與化合物3相比較，結構上僅在15位多1個羥基，化合物4與化合物5相比較，結構上僅是3位取代基不同，體內抗腫瘤構效研究表明，在腫瘤抑制率、抑制VEGF表達方面，3位是乙酰氧基，C環中15位連有羥基可以增強抑制腫瘤的效果。化合物2與化合物3對免疫器官的影響趨勢相似，化合物2和化合物3母核結構中的雙鍵位置是7，9（11）共軛結構，并且側鏈雙鍵為24與31位碳形成的雙鍵，故在體內抑瘤作用中，結構上雙鍵的位置可能影響著荷瘤小鼠的免疫調節功能。

4 討論

關于羊毛甾烷型三萜的抗腫瘤構效關系及機制研究目前還處于初期階段，本研究采用MTT法測試了7種羊毛甾烷型三萜類化合物對MCF-7細胞、Hela細胞、HepG2細胞和A549細胞增殖的影響，對其構效關系進行了分析，并選取了體外活性較好的單體化合物2～5，以移植實體瘤、免疫器官、細胞因子和肝臟酶系作為考察指標，研究4種化合物對H22荷瘤小鼠的整體影響，初步探索了4種化合物在體內抗腫瘤方面與結構是否存在一定的關聯性以及抗腫瘤的作用機制。結果表明，7種化合物對MCF-7細胞較為敏感，化合物2～5可以使腫瘤細胞變形、壞死及生長受到抑制，對細胞因子IL-4和IFN-γ表達的影響較大，其抗腫瘤作用與抑制VEGF表達和免疫調節相關，可能是通過干擾VEGF的表達及免疫調節這一途徑，來影響血管的形成和提高機體的免疫力，從而達到抗腫瘤的目標，抗腫瘤作用的機制與抗氧化作用關聯性較少。體內抗腫瘤構效研究表明，在腫瘤抑制率和抑制VEGF表達方面，3位是乙酰氧基，C環中15位連有羥基可以增強抑制效果，與體外抗腫瘤構效關系相近；另外，在調節脾臟指數方面，母核為7，9（11）共軛結構，側鏈為24（31）-烯-21酸的化合物表現出構效關系傾向。綜合研究結果表明，其中3位羥基被酮基或乙酰基取代與15位連有羥基可以增強抑瘤作用，這一構效關系在體內外抗腫瘤方面均成立，其中化合物2和化合物4的體外體內抗腫瘤活性好，有進一步開發和研究的價值。本研究為多孔菌的研究開發和羊毛甾烷型三萜作為天然抗腫瘤藥物等研究奠定了基礎，為4種化合物在抗腫瘤作用方面的繼續研究提供一定的研究基礎，為羊毛甾烷型三萜化合物及其衍生物藥理活性和構效關系的研究提供了參考。

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[責任編輯 丁廣治]