舒郁抑斑方對慢性心理應激促發動脈粥樣硬化大鼠的保護作用

鄭曉俊+胡志強+欒淑偉+李冉+李赟+李建良+李玉潔+朱曉新

[摘要]舒郁抑斑方（SYYB）對伴有慢性心理應激的冠心病患者有較好的治療作用。為觀察SYYB對慢性心理應激促發大鼠動脈粥樣硬化（athero-sclerosis，As）早期病變形成及其炎癥反應的影響，采用高脂餌食+維生素D₃（VD₃）腹腔注射建立大鼠As早期病變模型（As），在此基礎上采用不可預知慢性應激刺激法（As+CUMS），觀察慢性心理應激是否加重大鼠病變及SYYB（6.6，13.2，26.4 mg·kg^-1）的干預作用。采用懸尾實驗和新奇實驗法觀察大鼠行為學改變，檢測血清應激激素促腎上腺素（adrenocortico-tropic hormone，ACTH）、皮質醇（cortisol，Cor）、去甲腎上腺素（noradrenaline，NE）的含量，稱量胸腺、腎上腺的質量，綜合評價SYYB對模型大鼠心理應激的影響。取主動脈弓HE染色觀察血管組織病理改變，測定血清甘油三酯（triglycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（HDL-C），評價SYYB對大鼠As病變的影響。檢測血清高敏C反應蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hsCRP）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6），評價SYYB對As大鼠炎癥反應的影響。實驗結果顯示，與空白組相比，As組TC，TG含量增高，HDL-C明顯降低，HE染色可見主動脈壁增厚。As+CUMS組TC，TG含量顯著增高，HDL-C明顯降低，HE染色可見主動脈弓內膜增厚，泡沫細胞形成，行為學評價及血清應激激素檢測結果顯示動物存在慢性應激反應，該實驗As+CUMS模型復制成功。SYYB可降低血清中TC，TG含量，減輕主動脈泡沫細胞、鈣化灶及炎性細胞浸潤，對血清中ACTH和Cor，NE有明顯的降低作用，同時有效降低了血清中動脈粥樣硬化相關的炎性標志物hs-CRP，IL-1和IL-6。提示SYYB對心理應激促發As大鼠的保護作用，其作用與改善神經-內分泌網絡平衡及調節相關炎癥反應有關。

[關鍵詞] 舒郁抑斑方； 動脈粥樣硬化； 心理應激； 炎癥

[Abstract] Shuyu Yiban decoction（SYYB） has significant effect in treating the patients with coronary heart disease combined with chronic psychological stress. In this study， in order to observe the effects of SYYB on early formation of atherosclerosis（As） and inflammation response induced by chronic psychological stress， high-fat diet+intraperitoneal injections of Vitamin D3 were given to establish As early lesion models， and based on these models， chronic unpredictable mild stress（CUMS） was used to observe whether the chronic psychological stress could increase coronary atherosclerotic lesions investigate the intervention effect of SYYB（6.6， 13.2， 26.4 mg·kg^-1）. The tail suspension test and novelty-feeding test were adopted to detectadrenocortico-tropic hormone（ACTH）， cortisol（Cor） andnoradrenaline（NE） in serum and weigh thymus and adrenal gland， in order to assess the effects of SYYB on CUMS model rats. The pathological changes of vascular tissues in aortic arch were observed by using hematoxylin and eosin（HE） staining， and then the levels of triglycerides（TG）， total cholesterol（TC） and high density lipoprotein（HDL-C） in serum were determined to assess effects of SYYB on As lesions. The effects of SYYB on the inflammatory response in As rats were assessed by detecting high-sensitivity C-reactive protein（hsCRP）， interleukin-1β（IL-1β） and interleukin-6（IL-6） in serum. The results showed that as compared with the blank control group， TC and TG levels in As group were increased while HDL-C was markedly decreased； furthermore， the aortic wall was thickened in HE staining.Meanwhile， foam cells were formed， and the behavioral assessment and serum stress hormone test showed that there was a chronic stress response， indicating successful establishment of As+CUMS models in this study. The experiment demonstrated that SYYB could lower the levels of serum TC and TG， reduce foam cells， calcification and inflammatory cells infiltration. Moreover， SYYB could obviously lower levels of ACTH， Cor and NE and the As related inflammatory indicatorhs-CRP， IL-1β and IL-6 in serum.These results indicated that SYYB had protective effect on chronic psychological stress induced in As rats， and the mechanism was associated with balancing the neuroendocrine-immune network system and regulating inflammation response.

[Key words] Shuyu Yiban decoction； atherosclerosis； psychological stress； inflammation

隨著我國社會經濟的變革和人們生活方式的變化，心血管病，特別是動脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）性心血管病發病率和死亡率持續增長，已經成為我國重要的公共衛生問題。近年來的大規模流行病學研究不斷證實，心理因素可影響As斑塊形成，有報道約40%的冠心病與心理應激密切相關，特別是高脂人群和久坐人群^[1]，可以直接誘發心絞痛、心肌梗死急性發作及使預后惡化。有報道，長期慢性心理應激人群自主神經功能紊亂，頸動脈內膜中膜厚度明顯增高，且在遭受急性應激后心率、竇性心律及射血前期恢復緩慢，表明慢性應激促進As形成，增加心血管疾病的風險^[2]。心理應激已發展成為促進As的發展、觸發臨床心血管事件的關鍵危險因素之一^[1，3-4]。通過調整生活方式、改善心理狀態、適當服用藥物等方法減少As的形成發展^[5]已成為心血管病預防領域新的趨勢和共識。

中醫學認為，心理應激當屬“郁證”、“肝燥”、“百合病”、“瞀悶”等范疇，為情志不舒，氣機不暢，始發于肝，出現情緒低落或情緒不穩的證候群。治療多以疏肝解郁、安神開竅、調和肝脾、豁痰理氣、補益心脾、活血化瘀為法。舒郁抑斑方（SYYB）來源于國家級名老中醫李濟春先生臨床經驗方，以疏肝、活血、解毒為法，主要由柴胡、川芎、丹參、穿心蓮等藥味組成，可明顯減輕As心腦血管疾病患者臨床癥狀，同時改善患者心理狀態，其作用機制亟需深入研究。該文在建立慢性心理應激促發的As模型基礎上，觀察SYYB對As病變形成、進展過程及其炎癥反應的影響，并從神經-內分泌紊亂角度探討SYYB作用機制。

1 材料

1.1 動物

雄性Wistar大鼠，體重180～200 g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2012-0001；每籠5只，自由攝食、飲水，飼養室溫度為20～25 ℃，相對濕度40%～70%。

1.2 藥品與試劑

維生素D₃注射液（上海通用藥業股份有限公司，批號 20130910）。舒郁抑斑方（SYYB）：采用水提醇沉法制備，濃縮至生藥4 g·mL^-1，高壓滅菌保存，由中國中醫科學院中藥研究所提供，批號20140930；阿托伐他丁鈣片（美國輝瑞公司，批號029012K）；鹽酸帕羅西汀片（中美天津史克有限公司，批號H10950043）；大鼠高脂飼料（SPF級，北京科澳協力飼料有限公司，批號20141024）。

2 方法

2.1 造模

用高脂飼料（3%膽固醇，10%豬油，0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉，5%白糖）飼養大鼠，適應性喂養1周后，單次以30 mg·kg^-1的劑量腹腔注射維生素D₃（vitamin D₃，VD₃）。在高脂造模4周后，采用不可預知的慢性應激模型^[6-7]（chronic unpredictable mild stress，CUMS）通過心理應激刺激加重As損傷。CUMS主要的方法是施以28 d長期應激刺激，刺激類型包括：夾尾（2 min）、禁水（24 h）、潮濕墊料（將200 mL水加入有鋸末的籠底，24 h）、晝夜顛倒（24 h）、水平震蕩（15 min），每天隨機給予1種刺激，共進行28 d，制備慢性心理應激下的動脈粥樣硬化早期病變模型。

2.2 動物分組及處理情況

將高脂+VD₃建立的As模型大鼠隨機分成As模型組（As）、As模型+應激刺激組（As+CUMS）、SYYB分為低劑量組（6.6 mg·kg^-1）、中劑量組（13.2 mg·kg^-1）、高劑量組（26.4 mg·kg^-1）、陽性藥組（AT+PL，各 2 mg·kg^-1），每組10只，各組喂食高脂飼料滿8周。另取10只Wistar大鼠作為空白組（Control），并給予8周普通飼料。喂食高脂飼料4周后除空白組和As模型組外，其他各組大鼠給予不間斷28 d不可預知的慢性應激。造模結束后開始灌胃給藥，除空白組大鼠喂食8周普通飼料外，其他組大鼠持續喂食8周高脂飼料。

2.3 檢測指標

8周后，采用懸尾實驗，記錄大鼠倒置體位不動時間，每只大鼠觀察5 min^[8-9]。采用新奇實驗方法，將大鼠在禁食36 h后，放入一個新的未接觸過的新環境中，測試并記錄動物自放入籠中至首次攝食的時間^[10-11]。取血，放免方法檢測應激激素促腎上腺素（ACTH）、皮質醇（Cor）的含量，用ELISA方法檢測去甲腎上腺素（NE）含量，取出胸腺和雙側腎上腺，稱量質量，計算胸腺指數、腎上腺指數，胸腺指數（腎上腺指數）=胸腺質量（腎上腺質量）/大鼠體重，綜合反映動物的慢性心理應激的程度。

取血檢測總膽固醇（TC），甘油三酯（TG），高密度脂蛋白（HDL-C）含量，采用全自動生化檢測儀進行檢測，并計算動脈硬化指數（AI）。ELISA法檢測高敏c反應蛋白（hs-CRP）及白介素-1（IL-1β），白介素-6（IL-6）。主動脈弓取材，蘇木素-伊紅（HE）染色處理后，觀察其病理變化。

2.4 統計方法

數據以±s表示。運用SPSS 16.0軟件，采用方差分析（ANOVA）進行統計處理，2組間比較采用LSD檢驗，以P<0.05作為差異存在統計學意義的界限。

3 結果

3.1 SYYB對As+CUMS大鼠應激反應的影響

3.1.1 對As+CUMS大鼠行為學的影響 與As組相比，As+CUMS組大鼠攝食時間明顯延長（P<0.01），懸尾靜止時間有延長趨勢。與As+CUMS組相比，SYYB低、中、高劑量組大鼠攝食時間均顯著縮短（P<0.05），見圖1。

3.1.2 SYYB對As+CUMS大鼠血清應激激素ACTH，Cor，NE含量的影響 與As組相比，血清中ACTH，Cor的含量顯著升高（P<0.05），NE的含量無明顯變化。與As+CUMS組相比，SYYB低、中、高劑量組血清中ACTH，Cor，NE的含量有不同程度的改善作用，其中高劑量組作用顯著（P<0.05或P<0.01），見圖2。

3.1.3 SYYB對As+CUMS大鼠臟器指數影響 與As組相比，As+CUMS組大鼠的腎上腺指數顯著升高（P<0.05），胸腺指數無明顯變化。與As+CUMS組相比，SYYB低、中、高劑量組大鼠的腎上腺指數顯著降低（P<0.05），見圖3。

3.2 SYYB對As+CUMS大鼠As病變的影響

3.2.1 SYYB對As+CUMS大鼠血脂變化的影響 與As組相比，As+CUMS組大鼠血清中TC，TG的含量明顯升高（P<0.01），HDL-C的含量明顯降低（P<0.05）。與As+CUMS組相比，SYYB低、中、高劑量組及陽性藥組大鼠血清中TC，TG的含量明顯降低（P<0.05），HDL-C的含量有升高趨勢。與As+CUMS組相比，SYYB低、中、高劑量組及陽性藥組大鼠的動脈硬化指數（AI）明顯降低（P<0.05），見圖4。表明SYYB可改善脂質代謝，對As形成有一定的作用。

3.2.2 SYYB對As+CUMS大鼠血管病理形態學改變的影響 空白組動脈內膜表面光滑完整，無炎性細胞浸潤及鈣化灶。As模型組主動脈增厚，可見脂紋。As+CUMS組血管內膜增厚，粗糙，管壁鈣化明顯，可見脂紋、水腫及炎性細胞浸潤。SYYB低劑量與As+CUMS組無明顯變化，但中劑量組、高劑量組的內膜完整，斑塊形成程度與As+CUMS組比有明顯減輕，炎性細胞較少，見圖5。

3.2.3 SYYB對As+CUMS大鼠血清炎癥因子的影響 與As組相比，As+CUMS組大鼠的血清中hsCRP，IL-1β和IL-6含量明顯升高（均P<0.01）；與As+CUMS組相比，SYYB低、中、高劑量組大鼠的血清中IL-1β和IL-6的含量顯著下降（P<0.05），hsCRP含量有降低趨勢，差別無統計學意義，見圖6。表明SYYB可以有效降低血清中As相關的炎性標志物，從而影響斑塊穩定性。

4 討論

現代醫學已經由過去單純生物醫學模式向生物-心理-社會醫學模式轉變，世界衛生組織（WHO）對“健康”的認識不僅僅是停留在沒有疾病，而是身體-心理-社會適應的一種良好的狀態^[12-13]。與之相應，我國明代的中醫古籍《景岳全書》中既已明確提出了“因病而郁”和“因郁而病”理論。近年來隨著生活水平的不斷提高以及社會競爭的日益激烈，心理因素促發的動脈粥樣硬化性疾病嚴重威脅人類的健康，有心理應激傾向人群罹患心血管疾病的危險性增加2～4倍^[14]，心理應激成為冠心病發生的一個獨立的危險因素^[15-16]。

作者的前期研究顯示中藥SYYB既可改善冠心病癥狀又可效緩解患者緊張情緒。本課題在動脈粥樣硬化經典模型的基礎上給予不可預知的慢性應激（CUMS），從干預心理應激角度探索SYYB干預As的作用機制。

CUMS模型的建立經歷了多種慢性低強度刺激，更能表現心理應激的病理生理狀態。CUMS主要的方法是接收28 d長期應激刺激，刺激包括夾尾、禁水、潮濕墊料、晝夜顛倒、水平震蕩，每天隨機給予1種刺激，讓動物沒有任何心里準備。CUMS模型可使抑郁狀態保持較長時間，具有高度有效性，更加接近現實。對于CUMS模型評價該文采用懸尾實驗和新奇實驗及血清應激激素變化。實驗造模過程中，動物在接受28 d長期應激刺激同時，施以高脂餌食及VD₃注射，多因素誘發As斑塊形成。實驗結果顯示，模型組TC，TG含量顯著增高，HDL-C明顯降低，HE染色可見主動脈弓內膜明顯增厚，泡沫細胞聚集，炎癥細胞的浸潤，并可見明顯的鈣化灶，同時懸尾實驗和新奇實驗結果及血清應激激素水平表明，模型大鼠存在明顯慢性心理應激反應，本實驗模型復制成功。

心理應激誘導、加重的As機制十分復雜，其發病機制可能與機體的神經內分泌-免疫系統網絡系統調節紊亂有關^[17-20]。心理應激使神經-內分泌系統反應較為敏感，藍斑-去甲腎上腺素能神經元/交感-腎上腺髓質軸（locus ceruleus-nore pineph-rine/sympathetic-adrenal medulla axis，LC/NE）和下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸（hypothalamus-pituitary-adrenal cortex system，HPA） 功能持續亢進，從而增加了促腎上腺素、皮質醇、去甲腎上腺素的合成與分泌，且神經或淋巴細胞衍生的細胞因子顯著增加，在應激損傷中發揮重要作用，導致嚴重神經精神癥狀，并可以反饋機制調節HPA軸以及靶器官。同時，交感神經節后纖維釋放的神經遞質能夠在軟組織中彌散，與軸突附近的巨噬細胞等細胞腎上腺素能受體相互作用，也可介導交感神經調節的細胞因子水平和炎癥反應^[21-23]。

SYYB對模型組血清中促腎上腺素和皮質醇、NE有明顯的降低作用，同時有效降低血清中動脈粥樣硬化相關的炎性標志物hs-CRP，IL-1β，IL-6升高，表明SYYB可能通過影響神經-內分泌-免疫系統網絡減輕心理應激大鼠As進程及其炎癥反應。

本課題在建立大鼠CUMS刺激促發As模型基礎上，初步證實SYYB改善心理應激促發As病變的作用與影響神經-內分泌調節有關，相關機制有待進一步研究。

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[責任編輯 張寧寧]