硬皮病分子機制研究進展

劉慶梅+楚海燕+姜帥+魯佳瑩+朱興宇+石祥廣+吳文育+鄒和建+王久存

摘 要 硬皮病是以皮膚及內臟器官纖維化為特征的自身免疫性疾病。目前，硬皮病發病機制尚不明確，且治療手段有限，效果欠佳。研究表明，血管病變、自身免疫反應和膠原沉積是導致硬皮病產生多系統損害的3大因素。

關鍵詞 硬皮病 纖維化 分子機制

中圖分類號：R593.25 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2017）S1-0022-05

Advances in the molecular mechanism of systemic sclerosis*

LIU Qingmei1，2**， CHU Haiyan1， JIANG Shuai1， LU Jiaying2， ZHU Xingyu1， SHI Xiangguang1， WU Wenyu2， ZOU Hejian3， WANG Jiucun2***（1. School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438， China； 2. Division of Dermatology， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040， China； 3. Institute of Rheumatology， Immunology and Allergy， Fudan University， Shanghai 200040， China）

ABSTRACT Systemic sclerosis（SSc）is an autoimmune disease which is characterized by the fibrosis of skin and internal organs. The pathogenesis of SSc is still unknown till now and there are limited therapies and poor efficacy. Current studies have shown that vascular injury， autoimmune reaction and collagen deposition are the most important factors leading to multi-system damage of SSc.

KEY WORDS scleroderma； fibrosis； molecular mechanism

硬皮病（scleroderma），即系統性硬化（systemic sclerosis， SSc），是以皮膚增厚和纖維化為特征并累及內臟器官，同時伴有微血管系統損害的自身免疫性疾病[1-3]。可分為較少侵犯內臟的肢端型硬皮病（limited cutaneous scleroderma，lcSSc）和常伴系統損害的彌漫型硬皮病（diffuse cutaneous scleroderma，dcSSc）。硬皮病患者癥狀輕的可致殘、毀容，重的可導致死亡。血管病變、自身免疫反應和皮膚、內臟組織中的膠原纖維增生是導致硬皮病產生多系統損害的3大因素。但其中的具體機制尚不完全清晰，以致其治療效果不理想。因此，深入探索硬皮病發病機制具有重要的意義，硬皮病分子機制的研究已成為臨床及科研工作者共同關注的重要課題。

1 硬皮病血管損傷病變的分子機制研究

病理學檢查發現SSc患者早期即有微血管內皮細胞的破壞。血管損傷的組織病理學證據在纖維化前就存在，血管受累表現（如雷諾現象）常出現在其他臨床表現之前。研究顯示，內皮細胞損傷可能是SSc發病的始動因素之一[4]。硬皮病的血管病變是遺傳因素及環境因素等各種原因（如氧化壓力、外傷）引起的免疫復合物介導的免疫損傷，血液中的免疫復合物沉積于血管壁，激活補體，通過氧化應激以及抗體產生等途徑，損傷血管內皮細胞。內皮細胞損傷及功能障礙 ，勢必導致 E C 分泌功能失調，表現為舒血管物質與縮血管物質比例平衡發生改變。研究顯示，從硬皮病患者分離出的皮膚微血管內皮細胞分泌NO量明顯減少，縮血管物質ET-1等增加，并且隨著病程的進展，ET-1也隨之增加。損傷的內皮細胞可釋放細胞因子、化學因子并改變自身通透性，加速單核細胞等炎癥相關的細胞滲透，再激活成纖維細胞從而產生大量的膠原蛋白等細胞外基質成分，同時細胞外基質降解減少，導致器官組織內大量細胞外基質沉積，引起器官纖維化[5]。疾病晚期，血管平滑肌細胞增生、纖維蛋白廣泛沉積以及血管周圍纖維化導致進行性官腔閉塞，血供減少導致組織慢性缺氧，進一步引起血管內皮細胞等一系列細胞凋亡，造成組織損傷。且損傷組織中的小血管明顯減少，甚至出現無血管區域。臨床中廣泛出現的小動脈中等大小動脈的增殖性/閉塞性血管病變是所有類型SSc的病理學標志[6]。

內皮素-1是迄今為止發現的作用最強的縮血管物質，不僅存在于血管內皮，也廣泛存在于各種組織和細胞中，是調節心血管功能的重要因子，對維持基礎血管張力與心血管系統穩態起重要作用。相關研究已表明，升高的血漿內皮素水平與系統性硬皮病肺纖維化程度呈正相關。應用波生坦阻斷內皮素-1受體雙通路可以有效延緩硬皮病疾病進展、降低死亡率，尤其對并發間質性肺纖維化硬皮病患者的療效明顯[7]。NO是很強的擴血管分子，可以抑制ET-1的生物學作用。目前，多個研究報道SSc中NO的產生受損[8]。

2 硬皮病炎癥及免疫異常反應的分子機制研究

在硬皮病發病初期，甚至在纖維化發生之前，受感染的組織就發生了巨噬細胞、肥大細胞以及淋巴細胞的浸潤。急性炎癥的發生及抗原的呈遞進一步引起獲得性免疫的異常改變，并有一系列研究證實，免疫細胞是導致纖維化的眾多復雜的分子及生化過程的起始因素。迄今研究表明，外界感染可引起急性炎癥和固有免疫反應的發生，進而誘發獲得性免疫的失衡，氧化壓力、外傷等可引起血管內皮細胞或上皮細胞損傷。通過固有免疫細胞的呈遞以及損傷的內皮細胞釋放細胞因子、化學因子，引起CD4+ T淋巴細胞浸潤，調節Th1/Th2及Th17/ Treg亞群的比例與功能，釋放多種炎癥細胞因子，同時引起自身免疫性B細胞的活化以及細胞間的相互作用，產生自身抗體。免疫系統的失衡進一步激活成纖維細胞從而產生大量的膠原蛋白等細胞外基質（extracellular matrix， ECM），同時ECM合成與分解失衡，導致器官組織內大量ECM沉積，引起器官纖維化。

2.1 免疫細胞活化與失衡

2.1.1 單核/巨噬細胞的活化

SSc發病初期巨噬細胞的活化以及肥大細胞等脫粒會引發病灶的急性炎癥反應，SSc患者皮膚組織中巨噬細胞是主要的免疫細胞浸潤類型[9]。之后組織中的巨噬細胞及循環系統中的單核細胞會進一步活化，分泌大量的炎癥因子。I型干擾素是分泌的主要細胞因子，患者血漿中的I型干擾素的含量顯著高于正常人，且干擾素誘導基因（ISGs）在患者的外周血中高表達，暗示I型干擾素的升高在硬皮病發生和發展中起重要作用[10]。

2.1.2 T細胞的活化

SSc早期的皮膚活檢顯示，皮膚血管周圍有T淋巴細胞和單核細胞浸潤，部分患者有肥大細胞和嗜酸性粒細胞浸潤[9]，肺累及的硬皮病患者的肺部活檢同樣發現有T細胞浸潤。Kalogerou等[11]觀察到在硬皮病患者皮膚組織中浸潤T細胞的活化，且活化的細胞表面標志表達也增加，如IL-2R和CD69。同時，活化的T細胞釋放的細胞因子如IL-4和IL-17也隨之增加[12]。

2.1.3 Th1/Th2平衡

基于T細胞分泌的細胞因子，T細胞可分為Th1型和Th2型細胞。Th1與Th2型細胞因子在炎癥性疾病中發揮重要作用，Th1型細胞主要分泌細胞因子IL-2和干擾素-γ（IFN-γ），而Th2型細胞主要產生促炎因子IL-4，IL-13和IL-5。硬皮病患者體內Th2型細胞是主要的活化細胞類型，在患者皮膚、肺及外周血中產生大量的促炎及促纖維化因子IL-4和IL-13。Th1/Th2平衡和硬皮病活動度有關[13]。體內體外研究表明，Th1反應在介導SSc早期的炎癥過程中發揮重要作用，而Th2活躍可促進纖維化的形成，后者在活化成纖維細胞、促進膠原等ECM生成和沉積中發揮更顯著的作用[14]。

2.1.4 Th17/Treg平衡

Th17主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22，誘導產生其他細胞因子和趨化因子（如IL-6、IL-8和粒細胞集落刺激因子等），對固有免疫和獲得性免疫炎癥均有促進作用，Th17細胞介導的大多數反應都通過IL-17A實現，IL-17A常被稱作IL-17。另一方面，調節性T細胞（Tregs）在免疫應答反應中發揮重要作用。Foxp3基因特異表達于CD4+CD25+T細胞表面，直接參與CD4+T細胞向Treg細胞的分化，通常所說的Treg細胞就是CD4+CD25+Foxp3+T細胞。Treg與Th17之間存在反作用關系。Radstake等[15]報道，SSc患者的外周血CD4+ T細胞群中輔助性T細胞17（Th17）亞群比例增多，雖然在SSc外周血中Treg細胞數量也增多，但Treg細胞的功能受損[16]。萬琳琳等[17]也認為，Th17/Treg與SSc病情相關，Th17細胞亞群在活動期SSc患者體內增殖，其增殖程度與SSc活動度密切相關。這些線索提示，炎癥導致的硬皮病纖維化很可能與Th17/Treg亞群的平衡有關。

2.1.5 B細胞的活化

利用芯片技術分析發現，SSc皮損中一系列與B細胞有關的基因表達上調[18]。此外，在SSc中，外周血中B細胞的穩態及亞類表現異常：幼稚B細胞增多而記憶B細胞及早期漿細胞減少，雖然硬皮病的記憶B細胞數量減少但其產生抗體的能力增強，且SSc患者的記憶B細胞在體內長期處于活化狀態[19]。活化的B細胞可分泌IL-6和IL-10，誘導Th2型免疫反應[20]。同時，活化的B細胞可高表達MHC II類分子和共刺激分子，與樹突狀細胞有相似的抗原呈遞能力，但樹突狀細胞可通過產生IL-12而激起Th1型反應[21]。活化的T細胞也可與B細胞相互作用，促進B細胞產生各種自身抗體。綜上所述，SSc中存在B細胞的活化，并且活化的B細胞可能是SSc自身抗體的來源，同時活化的B細胞可能通過調節輔助T細胞的平衡及細胞因子的產生進而促進纖維化的發生。

2.2 促炎癥因子

活化的T細胞不僅可直接與成纖維細胞相互作用還可以通過間接方式作用于成纖維細胞，即通過分泌各種促炎因子。IL-6是促炎促纖維化因子，可由T細胞、單核細胞、內皮細胞及成纖維細胞產生。IL-6在硬皮病內皮細胞功能紊亂和纖維化形成中有重要作用，硬皮病患者血清中IL-6水平顯著升高，且皮損處IL-6表達明顯增加[22]。IL-6可促進膠原的產生并可增強Th2型細胞分化，且在T細胞分化過程中IL-6可誘導T細胞發展為Th17細胞，促進炎癥的發生[23]。IL-4和IL-13是Th2型細胞因子，SSc患者IL-4和IL-13等細胞因子水平顯著上升[24-25]。體外實驗同樣表明，IL-13是成纖維細胞增殖和膠原沉積的潛在調節因子[26]。IL-4是一種多能性的細胞因子，可刺激與成纖維細胞增殖相關的基因表達及促進ECM蛋白合成[27]。此外，SSc患者血漿及皮損中腫瘤壞死因子TNF-α水平顯著升高[28]，而TNF-α具有聚集炎癥細胞及刺激成纖維細胞增殖、促進膠原合成等功能[29]。

S100A8、S100A9是S100鈣結合蛋白家族中的重要成員，主要由髓系來源細胞如單核細胞、中性粒細胞和分化早期的巨噬細胞分泌，與機體炎癥及免疫功能有關。本項目組酶聯免疫吸附測定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測結果發現 ，S100A8、S100A9在彌漫型硬皮病患者血漿中的表達顯著升高。S100A8、S100A9表達水平與硬皮病患者的器官累及、免疫學特征相關，可能影響了疾病發展的進程。我們進一步研究發現，S100A9可協同博萊霉素誘導小鼠的皮膚炎癥及纖維化反應，S100A9可通過活化ERK1/2和NF- κB通路單獨誘導小鼠皮膚炎癥及纖維化反應。S100A9可激活NF-κB信號通路，誘發炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β的表達增加，促進肌成纖維細胞的增殖活化，導致膠原纖維增生。這些研究證明，炎癥因子S100A9參與了硬皮病的發生與發展[30-31]。

3 硬皮病纖維化發生的分子機制研究

3.1 成纖維細胞增殖與活化

膠原是纖維化組織的主要成分，人體合成膠原的最主要場所是成纖維細胞，故成纖維細胞的數量及活性與膠原的合成密切相關。成纖維細胞活化后表達更多的膠原以及促纖維化因子，國內外研究均顯示，體外培養的系統性硬化病（SSc）患者的皮膚成纖維細胞合成Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的量明顯增加。

3.2 促纖維化因子

轉化生長因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）是硬皮病發生及發展過程中作用最強的促纖維化細胞因子之一，在組織纖維化產生的病理機制中起重要作用，可刺激細胞產生大量的細胞外基質，包括膠原蛋白、結締組織生長因子（connective tissue growth factor， CTGF）等，并抑制細胞外基質降解酶（MMP）的活性，增加這些降解酶抑制物（TIMP）的活性，降低細胞外基質的降解能力，導致細胞外基質產生和降解的不平衡，從而引起纖維化[32]。Smad是 TGF-β最重要的胞內信號轉導分子，TGF-β與細胞表面受體復合物結合引起胞內 Smad2 和Smad3的磷酸化作用，并且與Smad4 形成復合物轉運至細胞核，調控相關基因的轉錄。已有的研究表明，Smad信號傳導路徑在硬皮病的發病過程中起著重要作用。此外，除了Smad依賴的TGF-β信號通路，TGF-β還可激活Smad非依賴的信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase， MAPK）信號通路等。

CTGF、PDGF、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）、HSP47、LTBP-4等作為促纖維化因子與肌成纖維細胞的活化、纖維化的發生存在密切關系。上述細胞因子在硬皮病中主要作用如下：

1）CTGF在纖維化的發生過程中是一個重要的細胞因子，TGF-β是調控其轉錄的最強、最直接的刺激因子[33]。纖維化的組織中CTGF表達增加，在硬皮病的成纖維細胞培養基中CTGF表達也增加，此外，在系統性硬皮患者的血漿中檢測到CTGF呈現高水平表達[34]。

2）血小板衍化生長因子（PDGF），是由血小板、巨噬細胞、內皮細胞以及成纖維細胞分泌，刺激成纖維細胞分裂，使成纖維細胞聚集，促進膠原、纖黏連蛋白及蛋白聚糖的合成，在傷口的愈合及纖維化發生中起作用。發現SSc患者的血漿中有PDGFR的抗體，SSc患者的皮損處組織中有大量的PDGF及其受體存在[35]。PDGF還刺激外周血單核細胞向成纖維細胞轉化[36]，而選擇性地抑制PDGF通路對皮膚成纖維細胞的增殖有抑制作用。

3）富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）是ECM的非膠原糖蛋白中的一種鈣結合蛋白，廣泛分布于人體的各種組織，尤其是在發育和重建的組織中[37]。來自不同實驗室的研究發現，在纖維化患者中SPARC呈明顯升高現象，本項目組發現硬皮病患者的成纖維細胞中SPARC的表達顯著高于正常成纖維細胞，利用siRNA特異性的抑制SPARC表達可以有效地緩解硬皮病小鼠的皮膚纖維化及肺纖維化[38-39]。因此，作為一種調控組分，SPARC在纖維化的形成中起到了重要的作用。

4）HSP47是分子量為47kD的熱激活蛋白，在膠原成熟過程中發揮至關重要的作用，輔助膠原蛋白的正確折疊與修飾[40]。本實驗室血清學檢測結果顯示，SSc患者血漿中HSP47的蛋白水平高于正常對照，同時HSP47 在硬皮病患者外周血細胞中的表達水平高于正常人，且 HSP47的高水平表達與患者血漿中存在 ACA 顯著相關。而 ACA 通常存在于肢端型硬皮病患者血清中，且是 SSc 良好預后的標志。免疫組化結果顯示， HSP47在硬皮病患者皮膚中表達水平高于正常對照，HSP47 主要表達于分泌膠原的肌成纖維細胞中，說明 HSP47 的表達與膠原的產生相關，且 HSP47的表達受 TGF-β通路調節[41]。

5）TGF-β前體結合蛋白4（latent TGF-beta binding protein-4，LTBP-4 ）作為TGF-β信號通路上游的關鍵蛋白，可與 TGF-β在細胞內結合形成復合物，并進一步協助TGF-β分泌至胞外，使其在ECM中沉積及儲存[42]。本項目組免疫組化結果顯示，LTBP-4在硬皮病患者皮損中蛋白表達水平高于正常人，同時LTBP-4在SSc血漿中的表達水平亦顯著高于正常人。此外，SSc患者血漿LTBP-4濃度與TGF-β濃度呈正相關，而TGF-β在肺及食管累及的SSc患者血漿濃度均高于無上述器官累及者，提示血漿LTBP-4及TGF-β表達水平可能與硬皮病嚴重程度密切相關。此外，體外細胞實驗結果顯示，LTBP-4可通過調控TGF-β信號通路影響皮膚成纖維細胞中膠原蛋白的表達，從而在硬皮病纖維化過程中發揮重要作用[43]。

4 結語

硬皮病發病機制復雜，在遺傳及環境因素促發下，血管微循環被破壞，血管內皮細胞損傷，免疫系統紊亂，效應細胞釋放多種細胞因子，成纖維細胞激活增殖，膠原等細胞外基質過度沉積，導致組織纖維化。深入探索硬皮病分子機制，將有助于硬皮病等纖維化疾病發生機制的揭示及治療。

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