畜禽保種理論與方法在豬保種工作中的應用

甘麥鄰，楊 露，蒲紅州，楊 瓊，李 智，朱 礪，張順華

（1.四川農業大學動物科技學院，成都 611130；2.四川省旺蒼縣畜牧食品局，廣元 旺蒼 628200；3.四川省南江縣農業局，巴中 南江 635600；4.成都農業科技職業學院，成都 6111305；5.四川省瀘縣畜牧局，瀘州 瀘縣 646100）

畜禽保種理論與方法在豬保種工作中的應用

甘麥鄰1，楊 露2，蒲紅州3，楊 瓊4，李 智5，朱 礪1，張順華1

（1.四川農業大學動物科技學院，成都 611130；2.四川省旺蒼縣畜牧食品局，廣元 旺蒼 628200；3.四川省南江縣農業局，巴中 南江 635600；4.成都農業科技職業學院，成都 6111305；5.四川省瀘縣畜牧局，瀘州 瀘縣 646100）

畜禽遺傳資源是重要的生物遺傳資源，是實現畜牧業可持續發展的重要基礎。文內綜述了國內外近年來保種理論與方法在豬保種工作中的應用情況，認為目前豬的保種應當是以群體遺傳學為基礎的活體保種方法和分子遺傳學為基礎的生物技術輔助保種方法相結合的保種技術體系。分析了相關理論和方法在實際應用中存在的問題，以期為我國地方品種豬的保種提供參考。

豬；保種理論；保種方法

生物遺傳資源是國家的戰略資源，是關系到國計民生的基礎生物資源。畜禽遺傳資源是重要的生物資源，是培育新品種和新品系、保護動物多樣性、實現畜牧業可持續發展的重要材料，也是滿足人們未來各種需求的重要基因庫。豬肉作為世界第一肉類品種，在為人類提供營養需要和解決溫飽問題方面做出了重要貢獻[1]。縱觀世界畜禽養殖業的發展，畜禽養殖正朝著規模化、工廠化的方向發展，這種方向轉變和人們對短期經濟效益的追求導致了人們飼養畜禽品種的單一化——少數經濟價值高的品種，畜禽品種多樣性遭到嚴重破壞。世界上豬主要飼養杜洛克、大白、長白等少數幾個品種，品種結構較為單一，同時這些品種在選育過程中不斷突出其某一方面的生產性能使得品種內部也高度同質化，豬遺傳資源的多樣性受到嚴峻挑戰[2]。但是隨著人們對生物遺傳資源重要性的進一步認識，豬遺傳資源的保護正受到人們的關注。

1 保種理論

隨著人們對保種工作的不斷認識，相關研究也不斷深入，盡管不同的學者對保種的理解和認識存在偏差，但目前對于豬保種的理論主要有兩種：隨機保種和系統保種。

隨機保種理論建立在群體遺傳學基礎上，追求群體遺傳結構的平衡，將品種視為一個整體，保存品種的全部基因[3]。盡管隨機保種理論最大程度上保存了品種的所有遺傳特性，但有限的群體很難實現哈代-溫伯格平衡，同時很難實現保種與選育的可持續發展。

系統保種理論根據系統科學的思想，把某一品種在一定時空內的基因庫作為保護對象，利用現代生物技術在保種的同時結合選育最大限度保存品種的基因庫。系統保種理論在保存品種基本基因體系、特征和特性基因的同時可以實現對品種的選育，打破了隨機保種存在的束縛，可實現畜禽遺傳資源利用的可持續發展[4]。但由于無法保存品種所有基因，不可避免會丟失一些未知性狀基因，隨著現代生物技術和信息數據挖掘在保種工作的應用可以有效減少系統保種理論存在的不利影響。目前的豬保種工作主要依據了系統保種的理論思想。

2 活體保種

活體保種是指通過建立以群體為保種對象的保種場、保種基地進行保種。最大的群體是一個品種，而最小的群體是一個家系。活體保種由于可以在保種的同時開展選育工作，實現了在利用中動態的保護遺傳資源，是目前最實用的畜禽保種方法[5]。活體保種由于需要維持一定數量個體的保種群并合理規劃管理，需要較大的維持成本，同時活畜還面臨著疾病、自然災害等風險。在活體保種工作中近交系數增量可以反映保種效果，群體大小、性別比例、留種交配制度等因素可以影響近交增量。在理想群體（群體每個世代含量保持不變，完全隨機交配，無其他系統影響因素存在）中近交系數增量（△F）的大小由群體有效含量（N）決定，假設初始群體無近交存在，則t世代時的近交系數（Ft）與近交系數增量之間存在如下關系：

2.1 群體大小

2.2 性別比例

2.3 留種交配制度

常用的留種方式有隨機留種和各家系等量留種兩種方式[6]，考慮到不同性別親本對后代遺傳貢獻存在差異，同時盡可能保持每個世代群體大小一致，因此通常采用各家系等量留種的方式在每一個世代留種時，從每一頭種公畜的后代中選留一個公畜，每一頭種母畜的后代中選留一頭雌性個體。對于選留的個體施行非同型交配系統，在隨機交配的基礎之上進行人為干預，盡量避免全同胞、半同胞等親緣關系接近的個體進行交配，可以有效控制群體近交系數的增加。

3 生物技術輔助保種

3.1 超低溫冷凍保種

利用冷凍保存技術可以將細胞置于-196 ℃的環境中使其暫時脫離生長狀態新陳代謝停止進行保存，在需要時再將細胞升溫后恢復細胞活力[8]。冷凍保存技術需要遵循一定的操作程序并配套使用相關的冷凍保護劑。冷凍保存的方法目前有程序化慢速冷凍法和玻璃化冷凍法。程序化慢速冷凍采用較低濃度的冷凍保護劑在程序化冷凍儀的控制下緩慢降溫使冷凍保護劑進入細胞，稀釋細胞內的電解質使細胞內的冰晶損傷和溶質性損傷降到最低。玻璃化冷凍法使用高濃度的冷凍保護劑，降溫速度可超過1 500 ℃/ min，使胞質內外的水快速通過冷凍敏感區減少胞內冰晶產生，冷凍效率更高[9，10]。研究表明減少細胞中的脂質含量可以降低細胞在冷凍保存中的損傷[11]，Momozawa等發現離心去脂可明顯改善卵母細胞解凍后的形態正常率、受精率和卵裂率[12]。目前大量研究表明玻璃化冷凍法優于傳統的程序化慢速冷凍法，具有操作簡單、凍融效果好、存活率高等特點[13，14]。冷凍保護劑主要分為膜滲透性冷凍保護劑和非膜滲透性冷凍保護劑兩種。膜滲透性冷凍保護劑主要使用乙二醇、二甲基亞砜等，可在細胞表面形成一層玻璃樣狀，同時降低溶液的冰點，防止細胞內冰晶的形成[15]。非膜滲透性冷凍保護劑主要使用蔗糖、葡萄糖、脂蛋白等，可增加溶質的濃度產生跨細胞膜的濃度梯度，不能滲透到細胞內部，作為細胞外液抗凍保護劑[16]。研究表明通過二者聯用可以達到更好地抗凍保存效果[17]。目前冷凍保存在豬的保種應用中以配子冷凍（精子和卵細胞）和胚胎冷凍技術較為成熟[18]。

3.1.1 精液的冷凍保存

早在1949年Polge等就已經利用低溫保存的精液進行人工授精[19]，隨后又有人分別利用顆粒狀冷凍精液和細管狀冷凍精液進行豬的人工授精并獲得了成功[20，21]。由于不同動物精子質膜結構不同[22]，與牛、羊等動物相比豬精子的抗凍效果差[23]，精液冷凍之后存在存活率低，人工授精妊娠低等問題，同時豬是多胎動物使用冷凍精液會導致產仔數下降，因此全世界范圍內應用豬冷凍精液進行人工授精的比例不到1%[24]。但是保種更關注時間的延續，冷凍精液保存技術結合人工授精技術的實施得以使配種可以不受公畜所處環境和生命體征的限制，相當于延長了公畜的配種年齡，延續了公畜的性狀和基因[18]，因此利用豬冷凍精液保存技術對品種予以保護仍然是一種安全經濟的豬保種措施，并在豬保種工作中得到了廣泛的推廣和應用。

3.1.2 卵母細胞或卵巢的冷凍保存

除了對精液進行冷凍保存，還可以通過冷凍卵細胞或卵巢來進行保種。由于卵細胞的體積較大、結構復雜等原因，卵細胞的抗凍能力不如精子，因此復活率往往也比精子更低[24]。但是冷凍卵細胞技術仍在不斷的發展，有研究表明在卵母細胞成熟階段中的GV期、GVBD期和MⅡ期被認為是最有利進行玻璃化冷凍的階段[25-27]，但還有一些研究發現冷凍保存在減數分裂階段不會影響卵母細胞的發育能力[28]。目前利用超數排卵與活體采卵等技術收集所選雌性個體的卵細胞然后進行冷凍保存，相當于延長了母畜的配種年齡，保存了所選母畜的性狀和基因。在合適的時候進行升溫，迅速恢復卵細胞的活性，進行體外受精與胚胎移植。

胚胎冷凍保存則可以同時實現延長保種公母畜配種年齡的目的，但胚胎冷凍保存需要采取特殊的保存方法和程序來避免解凍過程中可能造成的胚胎細胞的骨架發生改變、染色體或DNA異常以及細胞膜結構發生的改變。在冷凍保存上，卵母細胞的冷凍保存技術遠遠落后于胚胎的冷凍保存，早在1972年就有人成功進行了小鼠8細胞期胚胎的冷凍保存[29]，此后冷凍胚胎技術成功地應用在了多種動物身上，但是豬胚胎由于對溫度和冷凍劑的敏感，豬胚胎冷凍保存效果一直不理想[30]，Nagashima等人將豬胚胎離心后通過顯微操作移除胚胎中的脂肪有效改善了豬胚胎冷凍保存效果不佳的問題[31]。

3.1.3 體細胞冷凍保存

體細胞冷凍保存，胚胎、幼體或成年動物的肝、腎、皮膚等組織，經體外傳代培養，再經酶消化等處理后以預定的程序冷卻，然后就可以在液氮中長期保存。通過解凍復蘇后可在體外實現增殖、分化。早在1885年W Roux首次提出組織培養這一概念，1907年 R Harrison就進行了體外培養實驗，觀察到了蛙神經突起生長的過程，之后建立了體外培養活體組織的培養體系[32]。目前全世界范圍內建立了多個用于統一保存典型培養物的保存中心，1986年中國科學院昆明動物研究所籌建了野生動物細胞庫，2001年中國農業科學院畜牧研究所遺傳資源研究室構建了包含狼山雞、民豬在內的多個地方畜禽品種的成纖維細胞庫[33]。

由于目前還沒有離體完成胚胎發育全過程的技術，不論是冷凍配子還是冷凍胚胎，最終解凍復蘇后都面臨需要活體母畜承擔受體的功能，盡管可以用親緣關系較近的品種進行代孕但冷凍保存是否會引起配子和胚胎遺傳上的改變還不清楚，因此冷凍保種技術往往還須結合活體保種才能實現。

3.2 基因文庫

基因文庫可分為基因組文庫和cDNA文庫[34]，利用基因文庫進行保種是運用重組DNA技術將需要保種品種細胞的總DNA運用DNA酶切之后隨機連接到合適的載體上，然后轉移到合適的宿主細胞中，通過宿主細胞的增殖實現各個片段的無性繁殖系，在需要的時候通過轉基因工程將保存的基因重新整合到受體動物基因組中，使想要表達的性狀在轉基因動物中表現出來[35]。

利用基因文庫進行保種需要建立完善的基因工程技術、細胞體外培養技術和相關的分子遺傳學技術作支撐，難度較大[36]。Murraya 等人首次成功構建了一個長度為55kb的酵母人工染色體[37]。1997年完成了豬的酵母人工染色體構建[38]，在2000年李雪梅等人以pBluescriptKS+噬菌粒為載體，構建了豬的小插入片段基因組文庫[39]。基因文庫保種只有厘清了基因的作用才能有的放矢地利用基因文庫中的基因同時避免其帶來的副作用，由于基因文庫保種相關技術還不夠成熟，構建有效的保存文庫較困難，加之基因文庫在擴增期間有可能發生突變和重組，因此在建立基因文庫的同時仍然需要飼養一定數量的保種群體[40]。

3.3 分子遺傳標記

分子遺傳標記主要有限制性內切酶片段長度多態性（RFLP）、隨機擴增多態性DNA（RAPD）、擴增片段長度多態性（AFLP）、單核苷酸多態性（SNP）和微衛星標記幾種。利用與目標基因有緊密連鎖的DNA標記，對目標基因在保種過程中的分離和重組進行跟蹤，通過有意識地選留而加以保護，使之不因遺傳漂變而丟失[35]。利用廣泛存在于基因組的DNA標記，可以分析各個世代不同個體的基因同源度，指導種畜的選留[41]。在提高保種準確性的同時，使小群體保種成為可能。通過QTL（數量性狀位點）定位尋找到相關的基因簇，可以提高豬的保種、選育效率[42]。隨著相關配套綜合技術的發展，分子遺傳標記輔助保種發展迅速，近年來相關研究發現豬的基因組約有1 000多個DNA 標記被定位能較好地覆蓋豬整個基因組。Sun等繪制了豬18號染色體上的生長激素受體基因圖譜[43]，還有人利用微衛星標記研究了大白、約克夏和漢普夏豬的遺傳差異[44]。吳豐春等人利用AFLP技術對貴州小型香豬的基因組DNA進行了研究[45]。但是單純地利用分子遺傳標記對保種群體進行選留，往往不能全面考慮到豬保種群的實際生產性能、生活力等因素，因此分子遺傳標記仍然要結合傳統的豬保種方法進行。

3.4 其他生物技術在豬保種中的應用

盡管豬是多胎動物，利用超數排卵和胚胎分割、移植相關技術可進一步發揮優秀母畜的作用，豬的超數排卵一般采用PMSG + HCG的方法處理，可以獲得比正常排卵更多的卵子[46]。克隆胚胎也已在牛、羊、豬等動物獲得成功。1997年多利羊的誕生揭開了體細胞克隆技術的序幕，緊接著2002年誕生了第一頭體細胞克隆豬[47]。這些生物技術豐富了豬的保種研究和實踐工作，為豬保種工作的進一步開展實施提供了思路。

4 總結

隨著時間的推移，相關的理論體系不斷完善，相關的科學技術和手段也不斷發展；不同學科間的交叉越來越普遍，聯系越來越密切。保種工作需要利用當前社會可利用的先進科學技術和理論才能實現長足有效的進展。目前豬的保種應當是以群體遺傳學為基礎的活體保種方法和分子遺傳學為基礎的生物技術輔助保種方法相結合的保種技術體系，只有這樣才能夠實現對地方豬種的有效保護。

[1] 程廣燕， 劉珊珊， 楊禎妮， 等. 中國肉類消費特征及2020年預測分析[J].中國農村經濟，2015（2）：76-82.

[2] 武建勇， 薛達元， 王愛華， 等. 生物多樣性重要區域（Key Biodiversity Areas， KBAs）識別——國外案例、國內研究進展[J]. 生態學報，2016，36（10）： 3108-3114.

[3] 芒來. 隨機保種群體遺傳結構變化規律的研究[J]. 內蒙古農業大學學報： 自然科學版， 2002， 23(1)： 1-8.

[4] 盛志廉. 探索畜禽保種的新理論[C].第五次全國畜禽遺傳育種科學學術討論會，1989.

[5] 路國彬， 王夏暉， 呂文魁， 等. 中國畜禽遺傳資源保護問題分析[J]. 家畜生態學報， 2014； 35（4）： 1-6.

[6] 張沅. 家畜育種學[M]. 北京：中國農業出版社， 2001：320-322.

[7] 朱武洋. 畜禽品種保存規劃[D]. 保定：河北農業大學， 2003.

[8] 李廣武， 鄭從義， 唐兵. 低溫生物學[M]. 長沙：湖南科學技術出版社，1998.

[9] VAJTA G， DIVALD A， PAKU S，et al. Fatty degeneration in cultured hepatocytes[J]. Virchows Archiv B，1986， 52： 177-184.

[10] LIEBERMANN J， NAWROTH F，ISACHENKO V， et al. Potential importance of vitrification in reproductive medicine[J]. Biology of Reproduction， 2002， 67： 1671-1680.

[11] PARK KE， KWON IK， HAN MS，et al. Effects of partial removal of cytoplasmic lipid on survival of vitrified germinal vesicle stage pig oo-cytes[J]. Journal of Reproduction & Development， 2005， 51： 151-160.

[12] MOMOZAWA K， IWASAKI H，ONODA Y， et al. In Vitro Development of Porcine In Vitro Matured Oocytes Vitrified after Removal of Cytoplasmic Lipid Droplets[J]. Journal of Mammalian Ova Research，2013， 30： 36-40.

[13] 叢晶， 吳效科. 玻璃化冷凍技術的研究進展[J]. 國際生殖健康/計劃生育雜志， 2008， 27（3）： 151-154.

[14] 鄭愛燕， 丁潔， 顧斌， 等. 玻璃化冷凍與程序化冷凍對胚胎發育潛能及臨床結局的影響[J]. 生殖與避孕， 2013， 33（1）： 16-20.

[15] POLGE， AMP C， ROWSON LEA. Fertilizing capacity of bull spermatozoa after freezing at 79 degrees C[J]. Nature， 1952， 169： 626-627.

[16] ORIEF Y， SCHULTZE-MOSGAU A， DAFOPOULOS K， et al. Vitrification： Will it replace the conventional gamete cryopreservation techniques[J]. Middle East Fertility Society Journal， 2005， 10： 171-184.

[17] GUPTA MK， UHM SJ， LEE HT. Cryopreservation of immature and in vitro matured porcine oocytes by solid surface vitrification[J]. Theriogenology， 2007， 67： 238-248.

[18] 陳守云， 徐海濤， 高海燕. 畜禽遺傳資源保護和利用的有效途徑[J]. 浙江畜牧獸醫， 2010， 35（6）： 10-11.

[19] POLGE C， SMITH AU， PARKES AS. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures[J]. Nature， 1949， 164：666-666.

[20] PURSEL VG， JOHNSON LA. Freezing of boar spermatozoa： fertilizing capacity with concentrated semen and a new thawing procedure[J]. Journal of Animal Science， 1975， 40： 99-102.

[21] WESTENDORF P， RICHTER L，TREU H. Deep freezing of boar sperma. Laboratory and insemination results using the Hülsenberger paillete method[J]. Dtw Deutsche Tier rztliche Wochenschrift ，1975，82： 261-267.

[22] 胡建宏. 豬精液冷凍保存研究[D]. 楊凌： 西北農林科技大學， 2006.

[23] BWANGA CO， EINARSSON S，RODRIGUEZ-MARTINEZ H. Deep Freezing of Boar Semen Packaged in Plastic Bags and Straws[J]. Reproduction in Domestic Animals， 1991，26： 117-125.

[24] 周鑫. 豬精液冷凍保存的研究[D]. 呼和浩特：內蒙古大學， 2012.

[25] WU G， JIA B， MO X， et al. Nuclear maturation and embryo development of porcine oocytes vitrified by cryotop： Effect of different stages of in vitro maturation[J]. Cryobiology， 2013， 67(1)： 95-101.

[26] Mo XH， Fu XW， Yuan DS， et al. Effect of meiotic status， cumulus cells and cytoskeleton stabilizer on the developmental competence of ovine oocytes following vitrification[J]. Small Ruminant Research， 2014，117： 151-157.

[27] WU G， JIA B， MO X， et al. Nuclear maturation and embryo development of porcine oocytes vitrified by cryotop： effect of different stages of in vitro maturation[J]. Cryobiology， 2013， 67： 95-101.

[28] GAL FL， MASSIP A. Cryopreservation of Cattle Oocytes： Effects of Meiotic Stage， Cycloheximide Treatment， and Vitrification Procedure[J]. Cryobiology， 1999， 38：290-300.

[29] WHITTINGHAM DG， LEIBO SP，MAZUR P. Survival of Mouse Embryos Frozen to -196 and -269℃[J]. Science， 1972， 178： 411-414.

[30] SUZUKI T， TAKAGI M， YAMAMOTO M， et al. Pregnancy rate and survival in culture of in vitro fertilized bovine embryos frozen in various cryoprotectants and thawed using a one-step system[J]. Theriogenology， 1993， 40： 651-659.

[31] NAGASHIMA H， KASHIWAZAKI N， ASHMAN RJ， et al. Removal of cytoplasmic lipid enhances the tolerance of porcine embryos to chilling[J]. Biology of Reproduction，1994， 51： 618-622.

[32] 劉希斌， 關偉軍， 張洪海， 等. 瀕危動物遺傳資源的保存[J]. 中國農業科技導報， 2005， 7（5）： 34-38.

[33] 屈小平， 寧美艷， 武琳， 等. 動物遺傳育種方法研究進展[J]. 家畜生態學

報， 2012， 33（1）： 81-85.

[34] EFSTRATIADIS A， KAFATOS FC，MAXAM AM， et al. Enzymatic in vitro synthesis of globin genes[J]. Cell， 1976， 7： 279-288.

[35] 呂蓓， 鄭景生. 基因表達文庫的構建及其方法分析[J]. 分子植物育種， 2003（Z1）： 751-755.

[36] 李海權， 刁現民. 基因組細菌人工染色體文庫(BAC)的構建及應用[J]. 生物技術通報， 2005（1）：6-11.

[37] MURRAY AW， SZOSTAK JW. Construction of artificial chromosomes in yeast[J]. Physical Review B Condensed Matter ，1983， 51： 10193-10196.

[38] ALEXANDER LJ， SMITH TP， BEATTIE CW， et al. Construction and characterization of a large insert porcine YAC library[J]. Mammalian Genome， 1997， 8： 50-51.

[39] 李雪梅， 龔炎長. 豬 pBluescript KS^+ 文庫構建， 微衛星 DNA 克隆及序列測定[J]. 河北農業大學學報，2000， 23(2)： 10-12.

[40]關偉軍， 馬月輝. 頻危畜禽品種細胞庫的構建與鑒定[J]. 中國農業科技導報，2003， 5（5）： 66-70.

[41] 薛慧良. 遺傳標記輔助選擇及其在動物育種中的應用[J]. 生物學教學， 2007，32（9）： 6-7.

[42] 李寧. 基因組學技術在動物遺傳育種中的應用[J]. 華南農業大學學報， 2005，26（增刊）：12-20.

[43] SUN HS， TAYLOR C， ROBIC A，et al. Mapping of growth hormone releasing hormone receptor to swine chromosome 18[J]. Animal Genetics，1997， 28： 351-353.

[44] KACIREK， STACY L. Variation at microsatellite loci in the Large White， Yorkshire， and Hampshire breeds of pigs[J]. 1998， 23， 640-643.

[45] 吳豐春， 魏泓， 甘世祥， 等. 貴州小型香豬基因組DNA的AFLP檢測研究[J]. 遺傳， 2001， 23（5）： 423-426.

[46] 陳乃清， 茍德明，路興中，等. 豬的超數排卵[J]. 畜牧獸醫雜志， 1997（1）：1-3.

[47] POLEJAEVA IA， CHEN SH，VAUGHT TD， et al. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells[J]. Nature， 2000，407： 86-90.

2016-12-06）

四川省科技支撐計劃項目（2016NZ0089；2015NZ0013），四川省科技富民強縣專項行動計劃項目“巴山土豬產業化關鍵技術開發與示范”和四川省教育廳科研項目（16ZB0038）資助

甘麥鄰(1993-)，新疆喀什人，男，碩士研究生，動物遺傳育種與繁殖專業。

E-mail：1660600546@qq.com。

張順華，博士，碩士生導師，研究方向：豬的遺傳育種。E-mail：363445986@qq.com；

朱礪，教授，博士生導師，研究方向：豬的遺傳育種。E-mail：zhuli7508@163.com