基于EST-SSR標記的貴州野生刺梨居群遺傳多樣性分析

張懷山，鄢秀芹，魯敏，王道平，安華明

（1貴州大學農學院/貴州省果樹工程技術研究中心，貴陽 550025；2貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴陽550002）

基于EST-SSR標記的貴州野生刺梨居群遺傳多樣性分析

張懷山1，鄢秀芹1，魯敏1，王道平2，安華明1

（1貴州大學農學院/貴州省果樹工程技術研究中心，貴陽 550025；2貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴陽550002）

【目的】通過分析評價貴州野生刺梨（Rosa roxburghii Tratt）資源居群遺傳多樣性和遺傳結構，為刺梨資源的保護和發掘利用提供科學依據。【方法】從刺梨EST-SSR引物中篩選擴增效果好、多態性較高的10對引物，對收集的12個野生刺梨自然居群（共255份資源）的遺傳多樣性及遺傳結構應用POPGENE 1.31軟件進行分析,并根據Nei’s標準遺傳距離，利用NTSYS-pc2.10e軟件對各居群進行聚類分析，同時進行Nei’s遺傳距離與地理距離的Mantel相關性檢驗?！窘Y果】居群內Shannon信息指數（I）為0.62—0.88，基因多樣性指數（Nei’s）為0.40—0.52，且除福泉（FQ）和晴隆（QL）居群外，其余10個居群的多態位點百分率均為100%。此外，卡方檢驗顯示12個居群在大多數位點上等位基因顯著偏離Hardy-Weinberg平衡（P<0.05），且居群內近交系數（Fit）、總近交系數（Fis）均為負值，居群間分化系數Fst平均值0.0403，居群間基因流Nem平均值為5.9484、遺傳一致度GI為0.9068—0.9926、最大Nei’s遺傳距離為0.0978。各自然居群間Nei’s遺傳距離與地理距離存在顯著相關性（r=0.2498，P=0.9512）?！窘Y論】10對EST-SSR引物具有高度的多態性，可作為有效的遺傳標記用于刺梨居群遺傳多樣性和遺傳結構評價。貴州省野生刺梨自然居群內的遺傳多樣性較高，存在雜合度過剩的現象，且絕大多數的遺傳變異發生在居群內；居群間具有基因交流頻繁、遺傳一致度高、Nei’s遺傳距離小等特點。

刺梨；SSR；遺傳多樣性；居群遺傳結構

0 引言

【研究意義】刺梨（Rosa roxburghii Tratt，2n=2x=14）為薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）植物，是中國特有的果樹資源。因其果實含有豐富的營養物質和藥用保健成分，尤其是極高的維生素C而倍受關注。刺梨作為貴州省重點發展的特色產業，種植面積已超過 300 km2。同時，貴州省還含有豐富的野生刺梨資源，多分布于海拔1 000—1 600 m的山區、丘陵地帶[1-2]。這些豐富的野生資源無疑是刺梨品種選育和產業可持續發展的重要基礎和必要前提。然而，近年來對野生刺梨資源進行調查收集時發現，貴州野生刺梨分布面積和群體數量正在急劇減少，這使得開展刺梨資源的收集、遺傳多樣性評價、保護性開發等方面的工作勢在必行?！厩叭搜芯窟M展】遺傳多樣性，包括群體遺傳結構的研究，有利于對種質資源提出科學合理的保護策略，尤其是對于現今正遭受人類直接干擾和破壞的物種。SSR標記是研究生物遺傳多樣性的重要方法，已在薔薇科植物群體遺傳學、種質資源、分類學與種系發生學等方面得到廣泛應用。ZHANG等[3]利用8對SSR標記對中國新疆伊犁地區4個種下居群109個新疆野蘋果實生株系，進行群體遺傳結構研究，結果表明鞏留縣遺傳多樣性最為豐富，故在制定原位種質保護計劃時應優先考慮鞏留縣居群。ZONG等[4]利用14對SSR標記分析了川梨的遺傳多樣性和遺傳分化，這14個位點在幼苗種群中顯示較高的多態性，并確定出3個群體將成為重點保護和調查使用的對象。LIU等[5]利用14對基因組SSR引物研究了中國浙江省8個居群共77份豆梨資源的遺傳多樣性和種群結構，結果顯示地理距離是目前豆梨遺傳結構形成的一個關鍵因素，并確定FY群體是最適合進行原地保護的種群。陳嬌等[6]采用10對SSR引物對四川野生中國櫻桃5個居群共133株的遺傳多樣性水平及居群遺傳結構進行了研究，并提出野生中國櫻桃的保護利用策略。MENG等[7]利用SSR標記及單拷貝核基因對云南特有物種大花香水月季的遺傳結構進行了研究，為保護這一瀕危物種提供了重要的規劃和決策。然而，刺梨種質資源分子水平的研究起步較晚，迄今為止，相關研究僅采用了少數幾個刺梨材料作為參比試材研究薔薇屬不同種間親緣進化的關系[8-13]，以及開展了刺梨種內遺傳多樣性研究，但僅局限于30個刺梨樣品的RAPD分析[14-15]。此外，筆者課題組在開發EST-SSR標記的過程中，曾涉及16份刺梨資源作為研究材料[16-17]。由此可知，刺梨種質資源在分子水平上的遺傳多樣性研究基礎還相當薄弱，表現為樣品數量不足、代表性差，且缺乏群體遺傳結構的研究?！颈狙芯壳腥朦c】SSR標記根據其來源可分為基因組SSR和EST-SSR，目前對刺梨遺傳背景的研究剛剛起步[18]，基因組信息較缺乏，可用的遺傳標記較少，EST-SSR作為一種新型的分子標記，不僅具有傳統SSR標記多態性高、共顯性與重復性好等特點，更重要的是開發成本低；而且由于EST-SSR來源于表達的基因組區域，可直接反映相關基因的多樣性，在不同物種間也具有良好的通用性[19]。本研究基于課題組前期對刺梨果實轉錄組測序獲得的數據，篩選有效的刺梨EST-SSR引物，以研究刺梨種質資源的遺傳多樣性和群體遺傳結構?！緮M解決的關鍵問題】從批量開發并合成的102對引物中，篩選出多態性最好的10對引物用于研究；基于EST-SSR標記技術，分析12個居群共255份貴州野生刺梨的遺傳多樣性及其居群遺傳結構，以期為刺梨種質資源的科學保護和可持續利用提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于 2014—2016年在貴州省果樹工程技術研究中心進行。

1.1 試驗材料

選擇刺梨資源分布最為豐富的 12個縣作為居群代表采樣點（表1、圖1），根據現有分布規模決定居群樣本數量，每個居群取樣 12—38個不等，共 255株，居群內單個樣本間距離至少50 m以上，每個采樣株均進行GPS定位，并詳細記錄各居群經度、緯度、海拔等地理條件（表1）。每株采取幼嫩葉片10—20 g，將采樣葉片就地迅速保存于自封袋，置于冰盒，帶回實驗室用液氮處理后存于-70℃超低溫冰箱，用于DNA提取。

表1 貴州12個野生刺梨居群采樣點概況Table 1 Description of the 12 sampling sites of wild R. roxburghii in Guizhou province

圖1 貴州省12個野生刺梨居群分布情況Fig. 1 Description of the 12 sampling sites distribution of wild R. roxburghii in Guizhou province

1.2 DNA提取和SSR-PCR

1.2.1 DNA的提取 試驗材料基因組DNA提取參照POREBSKI等[20]的CTAB法。

1.2.2 引物篩選 從本課題組前期已完成的批量開發的EST-SSR引物中，隨機選取102對交由上海英駿生物技術公司合成。選取栽培種‘貴農5號’（Rosa roxburghii Tratt cv. GuiNong 5）、2份野生刺梨資源進行初步引物篩選。選取‘貴農5號’、15份不同來源的野生刺梨資源對篩選出的有擴增條帶的引物進行多態性檢測，最終確定出10對多態性較好的引物用于本研究（表2）。

1.2.3 PCR擴增 PCR反應體系為20 μL，其中包括2×Mix 10 μL；10 μmol·L-1的Primer-F、Primer-R各0.5 μL；ddH2O 8 μL；50 ng·μL-1的DNA模板1 μL。擴增程序為94℃下預變性3 min；然后進行35個循環，每個循環包括94℃變性40 s，55℃退火40 s（退火溫度因不同引物而異），72℃延伸1 min；最后72℃延伸10 min。1.2.4 電泳檢測 擴增產物利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，于DYCZ-30C型垂直電泳槽中電泳分離，150 V電壓下電泳90 min。電泳后參照BASSAM等[21]的方法進行銀染顯色，并在BIO-RAD凝膠成像系統中拍照記錄、分析。

1.3 數據分析處理

根據分子量大小對擴增結果讀帶，以二倍體形式記錄，從大到小依次記為 A、B、C…[22]。應用POPGENE 1.31軟件[23]對各居群在多基因座位上的Hardy-Weinberg平衡進行檢測，計算觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、多態性位點比率（P）、Nei’s基因多樣性指數（Nei’s）、Shannon信息指數（I），觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）、基因流（Nem）、居群內近交系數（Fit）、總近交系數（Fis）、居群間分化系數（Fst），Nei’s標準遺傳距離（GD）和遺傳一致度（GI）。根據Nei’s標準遺傳距離，利用NTSYS-pc2.10e 軟件中的UPGMA方法對各居群進行聚類分析，并進行Nei’s遺傳距離與地理距離的Mantel 相關性檢驗。

2 結果

2.1 EST-SSR標記的多態性

以‘貴農5號’和2份野生刺梨材料的基因組DNA為模板，對隨機選取并合成的102對引物進行PCR擴增、篩選。結果表明，其中的71對引物產生理想的PCR產物，有效擴增率為69.61%，通過篩選確定為有效的EST-SSR引物。進一步選取‘貴農5號’和15份野生刺梨材料對71對有效引物進行擴增、多態性評價。結果31對引物呈現出多態性，占有效引物的43.66%。從31對具有多態性的引物中選取10對效果良好、結果穩定的引物（表2），對255份刺梨材料進行擴增，進而分析刺梨種質資源的遺傳多樣性。10對引物在255份樣品上均能擴增出清晰的條帶，共擴增出33個條帶，不同引物的擴增條帶在2—8條之間，平均3.3條，其中有27條為多態性條帶，多態率為76.67%（表2）。圖2為引物24在44份材料中的擴增情況。

表2 用于本研究的EST-SSR引物信息Table 2 Polymorphic SSR primers used for the analyses of all 255 R. roxburghii samples

圖2 引物24對刺梨基因組DNA的擴增圖譜Fig. 2 SSR amplification pattern of R. roxburghii genomic DNA by primer 24

2.2 居群遺傳多樣性

在居群水平上，10對EST-SSR引物在12個自然居群中共擴增出33個等位基因，平均每個微衛星位點擴增 3.3個（Na=3.3）。除晴隆（QL）居群在位點17、19上，福泉（FQ）居群在位點19上只擴增出單一條帶，未表現出多態性，10個居群的多態位點百分率 P為 100%（表 3），表明貴州野生刺梨具有較豐富的遺傳多樣性。各居群觀測等位基因數 Na為 2.20—3.70；有效等位基因數 Ne為1.84—2.29；Shannon信息指數I為0.62—0.88，觀測雜合度Ho為0.64—0.76；預期雜合度 He為0.44—0.54，且Ho極顯著高于He（P=0.0001）；惠水（HS）和花溪（HX）居群擁有最高的基因多樣性指數（Nei’s為0.52），晴?。≦L）居群的基因多樣性指數最低，為0.40（表3）。

2.3 居群遺傳結構

采用卡方檢驗對各居群的多基因座位進行檢測發現，除羅甸（LD）居群外，11個刺梨居群均在1/3以上的位點顯著偏離 Hardy-Weinberg平衡（表4），在04位點甚至全部顯著偏離。12個刺梨居群的基因多樣性指數Nei’s均大于0.4；Shannon信息指數I除晴隆（QL）外均大于0.70，最高為0.88（表3）。以上結果表明，12個刺梨居群內具有較高的遺傳多樣性。

貴州 12個刺梨居群在 10個微衛星位點上的F-statistics分析結果見表5。12個刺梨居群在各位點上Fit、Fis為負值，Fst值在位點65最大，為0.0773；在位點4最小，為0.0092。Fst平均值為 0.0403，居群各位點基因流Nem值均大于2，且平均值為5.9484。

貴州刺梨居群間 GI為 0.9068—0.9926，平均值0.9586，遺傳一致度非常高（表6）；平均Nei’s遺傳距離（GD）0.0431，花溪（HX）和平壩（PB）居群Nei’s遺傳距離最近，僅為0.0074，興義（XY）居群和晴隆（QL）居群之間的Nei’s遺傳距離最大，也僅為0.0978。

2.4 居群聚類結果

基于貴州刺梨居群間 Nei’s遺傳距離[24]，采用UPGMA 法進行聚類分析，進一步直觀分析居群間遺傳關系，如聚類圖（圖3）所示，在Nei’s遺傳距離0.06處可將12個貴州刺梨居群分為2個組。石阡（SQ）和興義（XY）居群聚為第一組，其他居群聚為第二組，其中地理位置相近的花溪（HX）和平壩（PB）居群首先聚在一起，顯示了最近的親緣關系。對居群間的Nei’s遺傳距離和地理距離之間的Mantel（r=0.2498，P=0.9512）檢測也表明，在采集地范圍，刺梨的遺傳變異分布和地理位置具有顯著的相關性，尤其當居群間地理距離小于500 km時，其相關關系如圖4所示。

圖3 基于 Nei's 遺傳距離的居群UPGMA 聚類圖Fig. 3 UPGMA dendrogram based on Nei’s genetic distance

表3 貴州12個刺梨居群在10個微衛星位點的多樣性指數Table 3 The genetic diversity index of 12 populations of R. roxburghii at 10 microsatellite loci

續表3 Continued table 3

圖4 12個刺梨居群間Nei’s遺傳距離與地理距離的相關關系Fig. 4 The correlation between Nei’s genetic distance and geographic distance for 12 populations of R. roxburghii

3 討論

3.1 刺梨遺傳多樣性

本研究利用10對EST-SSR引物，對采自貴州省12個自然居群的255份野生刺梨種質資源進行遺傳多樣性分析，10個微衛星位點在各居群中均表現出不同程度的多態性，除福泉（FQ）和晴?。≦L）居群外，各居群的多態位點百分率 P 均為 100%，表明這 10個微衛星位點具有高度的多態性，可作為有效的遺傳標記用于刺梨居群遺傳多樣性和遺傳結構分析。

觀測等位基因數（Na）是衡量SSR位點多態性和居群變異程度高低的重要指標。10對EST-SSR引物在12個居群（255份野生刺梨種質資源）中共擴增出33個等位基因，平均每個微衛星位點擴增 3.3個（Na=3.3），與MENG等[7]采用7對SSR標記對瀕危物種大花香水月季 27個居群的研究結果接近（Na=3.9），低于孫萍等[25]利用 10對SSR引物對清涼峰地區36份三葉海棠的擴增結果（Na=7.1），低于LIU等[5]利用14對SSR引物對中國浙江省77份豆梨資源的擴增結果（Na=9.5），也低于陳嬌等[6]采用10對SSR引物對5個中國櫻桃野生居群共133株的研究結果（Na=7.8），這可能是由于EST-SSR來源于表達的基因組區域，所以多態性比基因組SSR標記稍低[26]。

表4 Hardy-Weinberg平衡檢測的P 值Table 4 The P values for Hardy-Weinberg Equilibrium test

表5 各位點固定指數及基因流Table 5 The fixed index and gene flow of 10 microsatellite loci

平均有效等位基因數（Ne）、平均Shannon信息指數（I）、平均期望雜合度（He）平均基因多樣性指數（Nei’s）等是評價遺傳多樣性的重要指標。本試驗研究結果（Ne=2.19，I=0.87，Ho=0.70，He=0.51，Nei’s=0.51），低于同屬于薔薇科的中國櫻桃野生居群[6]（Nei’s=0.70，I=1.53），三葉海棠[25]（He=0.70，I=1.46，Ne=3.95）；卻高于野杏[27]（Nei’s=0.29，I=0.46）和新疆野蘋果[3]（He=0.26，I=0.41，Ne=1.43），表明相較于薔薇科其他植物而言，貴州野生刺梨群體遺傳多樣性處于適中到較高水平。這可能與刺梨的生活習性（如繁殖方式等）有關，刺梨可自花授粉結實，也可異花授粉結實，因此其遺傳多樣性傾向于界于雜交物種和自交物種之間。

3.2 刺梨遺傳分化

貴州野生刺梨居群間分化系數 Fst平均值為0.0403，低于浙江野生豆梨[5]（Fst=0.136），云南野生大花香水月季[7]（Fst=0.240）及云南野生川梨[28]（Fst=0.404），表明刺梨居群間屬低度分化[29]，居群間的遺傳變異只占總變異的較少部分（4.03%）；居群間基因流Nem=5.9484，表明居群間基因交流頻繁，從而有效抑制了由遺傳漂變而引起的遺傳分化[30]。同時，頻繁的基因交流必然導致居群間遺傳的均質化，使各居群間表現出較高的遺傳一致度（GI＞0.9）及較小的遺傳距離（GD＜0.0978）。本試驗所收集材料多集中在道路兩旁，人類采集活動頻繁，可能是促進刺梨居群間基因交流的重要原因。此外，也有相當部分試驗材料采自人跡罕至的山坡、河溝邊，因此流水和采食刺梨果實的鳥獸，也可能是刺梨遠距離傳播基因交流的主要方式。

表6 居群間的Nei’s遺傳距離（GD）和遺傳一致度（GI）Table 6 Nei’s genetic distance and genetic identity between populations

貴州野生刺梨 12個居群在多個位點上偏離Hardy-Weinberg平衡，且觀測雜合度高于期望雜合度，表明貴州野生刺梨居群內不僅遺傳多樣性高，還存在雜合度過剩的現象。推測可能主要存在兩方面的原因：一方面，由于刺梨遺傳背景較為狹窄，起源親本數量有限，奠基者效應（Founder effect）會導致連鎖不平衡現象，繼而造成雜合子過剩；另一方面，可能是蟲媒和風媒造成的高異花授粉率，導致刺梨野生自然居群內有性繁殖的自交率低（Fis、Fit＜0），而頻繁的基因交流（Nem=5.9484）使種內雜交產生的雜合子可通過無性繁殖方式進行有效固定，從而導致雜合度過剩。對居群間的Nei’s遺傳距離和地理距離之間的Mantel檢測表明，刺梨的遺傳變異分布和地理位置具有顯著的相關性，暗示地理距離可能是影響刺梨遺傳分化的主要因素。

3.3 刺梨保護策略

由于土地開墾以及城市化進程等導致的土地侵占、環境破壞以及生境破碎化等，加上農業耕作時的亂砍濫伐，使得野生刺梨分布面積和群體數量急劇減少。以前在田間地頭、房前屋后隨處可見的刺梨資源，現在必須要深入到荒山坡地才能覓其蹤影。可以預見，隨著城市化發展日新月異和生態環境的日趨惡化，刺梨種質資源大量丟失的現象將日趨嚴重。因此，刺梨資源的收集、評價、保護等方面的工作迫在眉睫。本試驗結果表明，貴州野生刺梨 12個居群中以花溪（HX）、惠水（HS）、平壩（PB）、安龍（AL）、遵義（ZY）等5個居群擁有高于平均值的觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Nei’s基因多樣性指數（Nei’s）、Shannon信息指數（I），觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）（表 3），遺傳多樣性較高，應當采取就地保存的策略進行種質保存，其中平壩（PB）和花溪（HX）居群遺傳距離最小，且地理距離也較近，可優先選擇遺傳多樣性更高的花溪（HX）居群進行保護；而對于人為破壞最為嚴重的石阡（SQ）、羅甸（LD）、盤縣（PX）等3個居群則應采取遷地保存的策略。下一步將擴大野生資源的采集范圍和SSR引物的篩選范圍，并選擇更多的分子標記技術，更加系統地開展不同區域間遺傳多樣性研究，為刺梨和其他薔薇科植物的資源分類、分子標記輔助育種、遺傳圖譜構建等研究提供更多專一有效的分子標記。

4 結論

基于EST-SSR標記對貴州野生刺梨12個居群255份種質資源的遺傳多樣性分析表明，10對 EST-SSR引物具有高度的多態性，可作為有效的遺傳標記用于刺梨遺傳多樣性和遺傳結構評價。貴州省野生刺梨自然居群內的遺傳多樣性較高，居群內存在雜合度過剩的現象，且絕大多數的遺傳變異發生在居群內（居群間分化系數Fst平均值0.0403），居群間具有基因交流頻繁（基因流Nem平均值為5.9484）、遺傳一致度高（GI為0.9068—0.9926）、Nei’s遺傳距離小（最大遺傳距離為0.0978）等特點?；谝陨辖Y果，應優先考慮對遺傳多樣性較高的花溪（HX）、惠水（HS）、安龍（AL）、遵義（ZY）等4個居群實施就地保存策略。

[1] 樊衛國, 夏廣禮, 羅應春, 陳夏爾, 何剛. 貴州省刺梨資源開發利用及對策. 西南農業學報, 1997, 21(3): 109-115.

FAN W G, XIA G L, LUO Y C, CHEN X E, HE G. Utilization of Rosa roxburghii resource and its developing strategy in GuiZhou province. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 1997, 21(3): 109-115. (in Chinese)

[2] 敖芹, 谷曉平, 孟維亮. 貴州刺梨研究進展. 耕作與栽培, 2010(6): 1-7.

AO Q, GU X P, MENG W L. Research progress of Rosa roxburghii in Guizhou province. Cultivation and Farming, 2010(6): 1-7. (in Chinese)

[3] ZHANG C, CHEN X, HE T, LIU X, FENG T, YUAN Z. Genetic structure of Malus sieversii population from Xinjiang, China, revealed by SSR markers. Journal of Genetics and Genomics, 2007, 34(10): 947-955.

[4] ZONG Y, SUN P, LIU J, YUE X Y, LI K M, TENG Y W. Genetic diversity and population structure of seedling populations of Pyrus pashia. Plant Molecular Biology Reporter, 2014, 32: 644-651.

[5] LIU J, ZHENG X Y, DANIEL POTTER, HU C Y, TENG Y W. Genetic diversity and population structure of Pyrus calleryana (Rosaceae) in Zhejiang province, China. Biochemical Systematics and Ecology, 2012, 45: 69-78.

[6] 陳嬌, 王小蓉, 湯浩茹, 陳濤, 黃曉姣, 梁勤彪. 基于 SSR標記的四川野生中國櫻桃遺傳多樣性和居群遺傳結構分析. 園藝學報, 2013, 40(2): 333-340.

CHEN J, WANG X R, TANG H R, CHEN T, HUANG X J, LIANG Q B. Assessment of genetic diversity and populations genetic structure in wild Chinese cherry from Sichuan province using SSR markers. Acta Horticulturae Sinica, 2013, 40(2): 333-340. (in Chinese)

[7] MENG J, HE S L, LI D Z, YI T S. Nuclear genetic variation of Rosa odorata var. gigantea (Rosaceae): Population structure and conservation implications. Tree Genetics & Genomes, 2016, 12(4): 1-14.

[8] 文曉鵬, 龐曉明, 鄧秀新. 刺梨及部分近緣種形態學性狀和 RAPD標記分析. 園藝學報, 2003, 30(2): 204-206.

WEN X P, PANG X M, DENG X X. A comparative study of RAPD and morphological approaches to characterize relationships of Rosa roxburghii Tratt. and its relatives. Acta Horticulturae Sinica, 2003, 30(2): 204-206. (in Chinese)

[9] WEN X P, PANG X M, DENG X X. Characterization of genetic relationships of Rosa roxburghii Tratt and its relatives using morphological traits, RAPD and AFLP markers. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 2004, 79: 189-196.

[10] 唐開學, 邱顯欽, 張顥, 李樹發, 王其剛, 蹇洪英, 鄢波, 黃興奇.云南薔薇屬部分種質資源的SSR遺傳多樣性研究. 園藝學報, 2008, 35(8): 1227-1232.

TANG K X, QIU X Q, ZHANG H, LI S F, WANG Q G, JIAN H Y, YAN B, HUANG X Q. Study on genetic diversity of some rosa germplasm in Yunnan based on SSR markers. Acta Horticulturae Sinica, 2008, 35(8): 1227-1232. (in Chinese)

[11] 鄧亨寧, 高信芬, 李先源, 周洪英. 無籽刺梨雜交起源:來自分子數據的證據. 植物資源與環境學報, 2015, 24(4): 10-17.

DENG H N, GAO X F, LI X Y, ZHOU H Y. Molecular evidence for hybridization origin of Rosa×sterilis (Rosacea). Journal of Plant Resources and Environment, 2015, 24(4): 10-17. (in Chinese)

[12] FOUGèRE-DANEZAN M, JOLY S, BRUNEAU A, GAO X, ZHANG L. Phylogeny and biogeography of wild roses with specific attention to polyploids. Annals of Botany, 2015, 115(2): 275-291.

[13] ZHU Z M, GAO X F, FOUGèRE-DANEZAN M. Phylogeny of rosa sections Chinenses and synstylae (Rosaceae) based on chloroplast and nuclear markers. Molecular Phylogenetics & Evolution, 2015, 87: 50-64.

[14] 文曉鵬, 龐曉明, 鄧秀新. 不同自然分布區刺梨遺傳多樣性的RAPD分析. 中國農業科學, 2003, 36(7): 823-828.

Wen X P, Pang X M, Deng X X. Genetic diversity in wild accessions of Rosa roxburghii Tratt from four provinces as revealed by RAPD analysis. Scientia Agricultura Sinica, 2003, 36(7): 823-828. (in Chinese)

[15] 文曉鵬, 鄧秀新, 樊衛國. 刺梨主要基因型的RAPD鑒別. 山地農業生物學報, 2003, 22(4): 317-321.

WEN X P, DENG X X, FAN W G. Identification of genatypes of Rosa roxburghii as revealed by randomly amplified polymorphic DNA. Journal of Mountain Agriculture and Biology, 2003, 22(4): 317-321. (in Chinese)

[16] 鄢秀芹, 魯敏, 安華明. 刺梨轉錄組 SSR 信息分析及其分子標記開發. 園藝學報, 2015, 42(2): 341-349.

YAN X Q, LU M, AN H M. Analysis on SSR information intranscriptome and development of molecular markers in Rosa roxburghii. Acta Horticulturae Sinica, 2015, 42(2): 341-349. (in Chinese)

[17] YAN X Q, ZHANG X, LU M, HE Y, AN H M. De Navo sequencing analysis of the Rosa roxburghii fruit transcriptome reveals putative ascorbate biosynthetic genes and EST-SSR markers. Gene, 2015, 561: 54-62.

[18] LU M, AN H M, LI L L. Genome survey sequencing for the characterization of the genetic background of Rosa roxburghii tratt and leaf ascorbate metabolism genes. PLoS ONE, 2016, 11(2): e0147530. doi:10.1371/journal.pone.0147530.

[19] POWELL W, MACHRAY G C, PROVAN J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends in Plant Science, 1996, 1(7): 215-222.

[20] POREBSKI S, BAILEY G, BAUM R B. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polypheNal components. Plant Molecular Biology Reporter, 1997, 15(1): 8-15.

[21] BASSAM B J, CAETANA-ANALLES G, GRESSHOFF P M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry, 1991, 196: 80-83.

[22] 萬宣伍, 劉映紅, 張彬, 周浩東. 基于微衛星分子標記的重慶地區桔小實蠅遺傳分化研究. 中國農業科學, 2010, 43(13): 2688-2696.

WAN X W, LIU Y H, ZHANG B, ZHOU H D. Genetic differentiation among poupulations of the oriental fruit fly Bactrocera dorsalis (Hendel) in Chongqing based on microsatellite markers. Scientia Agricultura Sinica, 2010, 43(13): 2688-2696. (in Chinese)

[23] YEH F C, YANG R C, BOYLE T. Popgene version 1.31 quick user guide. Canada: University of Alberta and Centre for International Forestry Research, 1999.

[24] NEI M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics, 1978, 89: 583-590.

[25] 孫萍, 宗宇, 劉晶, 胡春云, 滕元文. 基于SSR標記的清涼峰地區三葉海棠遺傳多樣性研究. 果樹學報, 2013, 30(1): 8-15.

SUN P, ZONG Y, LIU J, HU C Y, TENG Y W. Study on genetic diversity of Malus sieboldii in Qingliangfeng region based on SSR markers. Journal of Fruit Science, 2013, 30(1): 8-15. (in Chinese)

[26] POWELL W, MACHRAY G C, PROVAN J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends in Plant Science, 1996, 1(7): 215-222.

[27] HE T M, CHEN X S, XU Z, GAO J S, LIN P J, LIU W, LIANG Q, WU Y. Using SSR markers to determine the population genetic structure of wild apricot (Prunus armeniaca L.) in the Ily Valley of west China. Genetic Resources and Crop Evolution, 2007, 54(3): 56-572.

[28] LIU J, SUN P, ZHENG X Y, DANIEL POTTER, LI K M, HU C Y, TENG Y W. Genetic structure and phylogeography of Pyrus pashia L. (Rosaceae) in Yunnan province, China, revealed by chloroplast DNA analyses. Tree Genetics & Genomes, 2013, 9: 433-441.

[29] WRIGHT S. Evolution and the Genetics of Populations, Volume 4: Variability within and among Natural Populations. Chicago: University of Chicago Press, 1978: 65-134.

[30] SLATKIN M. Estimating levels of gene flow in natural populations. Genetics, 1981, 99: 323-335.

（責任編輯 趙伶俐）

Analysis of the Genetic Diversity of Wild Rosa roxburghii Populations in Guizhou Province Based on EST-SSR Marker

ZHANG HuaiShan1, YAN XiuQin1, LU Min1, WANG DaoPing2, AN HuaMing1
(1College of Agriculture of Guizhou University/Guizhou Engineering Research Center for Fruit Crops, Guiyang 550025;2The Key Laboratory of Chemistry for Natural Product of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550002)

【Objective】Genetic structure and genetic diversity of wild Rosa roxburghii resources were analyzed and evaluated in order to provide a scientific basis of the protection and excavation of R. roxburghii resources.【Method】Ten EST-SSR primers with good amplification and high polymorphism were used to analyze the genetic diversity and genetic structure within 12 populations including 255 R. roxburghii germplasms by POPGENE 1.31 software. According to Nei’s standard genetic distance, NTSYS-pc2.10e software was used to cluster the populations, and the Mantel correlation relationship between Nei's genetic distance and geographical distance was tested.【Result】The range of Shannon’s information index (I) was from 0.62 to 0.88, Nei’s gene diversity from 0.40 to 0.52. Total percentage of polymorphic loci (P) was 100% in these populations, except for Fuquan and Qinglong populations. The Chi-square test results showed that the 12 populations of R. roxburghii did not follow with the Hardy-Weinberg Equilibrium at most loci, and the Fitand Fisvalues were negative. Characteristics, such as Fst=0.0403, gene flow Nem=5.9484, genetic identity (0.9068

Rosa roxburghii; SSR; genetic diversity; population genetic structure

2016-08-12；接受日期：2016-12-02

國家自然科學基金（31660558）、貴州省高層次創新型人才培養計劃（黔科合人才20164016）、貴州省科技計劃項目（黔科合SY字20153026-1）

聯系方式：張懷山，Tel：18798855583；E-mail：huaishan6013@163.com。通信作者安華明，E-mail：anhuaming@hotmail.com