誘變育種方法在霉菌中的應用

熊進，黃魁英，曹丁，甘祥武，陳瓊

（廣州市微生物研究所，廣東廣州510663）

誘變育種方法在霉菌中的應用

熊進，黃魁英，曹丁，甘祥武，陳瓊

（廣州市微生物研究所，廣東廣州510663）

介紹誘變育種方法在霉菌中的研究進展以及物理誘變、化學誘變、物理化學復合誘變的應用效果。研究表明，物理誘變方法比化學誘變方法應用廣泛；利用物理誘變，適當結合化學誘變也取得不錯效果。

誘變方法；霉菌；物理誘變；化學誘變

誘變育種是微生物選育最常用且行之有效的方法，在實際生產中，各種方法被不斷運用，已經有很多誘變得到的高產菌株投入工業化生產。然而，其方法多種多樣，物理誘變方法和化學誘變方法相互之間組合的形式也比較多，其有一個共同的特點就是不定向的突變。在霉菌中，因其種類繁多、分布廣泛，又有菌絲和孢子等獨有特性，故誘變育種有其比較獨特的育種特點。目前普遍采用人工誘變育種的方式，主要包括物理誘變、化學誘變、生物誘變三大類[1-2]。本文主要介紹目前已經運用在霉菌上物理和化學的誘變方法以及效果，為提供誘變選擇提供新思路。

1 物理誘變

物理誘變方法在菌株的選育方面應用廣泛，尤其獨特的特點，隨著物理技術的發展，逐步發展成為誘變技術對人體傷害小，處理時間短，環境污染小等特點。

1.1 紫外線誘變技術

紫外線是最簡單容易的物理操作技術，其突變具有不定向性，并且操作簡單，條件容易獲取，被廣泛的運用于各種微生物的誘變處理，在霉菌中也得到了廣泛的運用。采用紫外誘變對米曲霉K61菌株進行誘變，最終篩選出一株蛋白酶活力高且遺傳性能穩定的突變株米曲霉Y29，菌株的蛋白酶活力明顯高于米曲霉3.042菌株，其中性蛋白酶活力可達9 180.98（U/g）[3]。陳亞光等[4]采用滬釀3.042米曲霉的孢子為對象，對其孢子進行紫外誘變，篩得到一株蛋白酶活力高且遺傳穩定的突變株LY06，37℃培養44 h產酶活力由313 U/g曲料提高到556 U/g曲料，為原菌株的1.78倍，傳代培養15次，蛋白酶活力基本保持穩定，沒有明顯的下降。屈二軍等[5]以黑霉菌株W1作為出發菌株進行紫外線誘變，從中篩選出的高產纖維素酶菌株NW1的酶活均有不同程度的提高，較出發菌株W1提高了1.58倍。郭魯宏等[6]以黑曲霉No.13為出發菌株，經紫外線誘變處理獲得一株制備原生質體的起始菌，該菌株單寧酶活性比No.13提高55%。周長海等[7]以自然發酵的粟米醬中分離的野生型米曲霉為出發菌株（S），經分離、純化后，采用紫外線誘變育種的方法，得到菌株Y26比出發菌株S酶活提高了近5倍，突變株Y34孢子數比出發菌株S提高了近19倍。對于霉菌而言，紫外線處理原生質體液和孢子液的效果是不一樣的，很多試驗都用原生質體比直接的孢子液正突變效果要大。

1.260Co γ射線

γ射線穿透物質后強度減小，但能量幾乎不降低，運用于生物誘變具有很好的效果，這也是現在生物誘變技術里得到非常廣泛運用的技術之一。陳建愛等[8]利用60Co γ射線輻照木霉（Trichoderma spp）菌株的誘變效果，使木霉分生孢子萌發率顯著降低，孢子萌發時間加長，有的萌發菌絲長成畸形，并且隨著照射時間的延長，萌發率急劇下降。楊平平等[9]利用60Co γ射線對黑曲霉447-92菌種產植酸酶的誘變效應，篩選出產植酸酶較高的菌株，經傳代培養，該突變株具有穩定的遺傳性狀。梁新樂等[10]對綠色產色霉菌A-05菌株進行射線處理，確定了最佳劑量350 Gy，篩選出高產并且能夠穩定遺傳的菌株，阿維霉素發酵單位達到68.5 mg/L。宋安東等[11]以斜臥青霉（Penicillium decumbeus）A10為出發菌株，經450Gy射線誘變，篩選出纖維素酶高產菌株A50，發酵至60 h時，纖維素酶活和濾紙酶活均達到最高，分別為27.28U/mL和1.981 U/mL，較出發菌株A10分別提高了33.2%和45.59%。胡燕紅等[12]以米根霉As 3.819為出發菌株，采用60Co γ射線進行誘變處理，以正突變率為指標，誘變劑量為400 Gy，通過篩選得到耐38℃高溫的5號突變株mut-5經連續傳代7次，遺傳性狀穩定，突變株發酵液中的乳酸含量提高了24.15%，乙醇含量降低了9.27%。很多試驗都表明60Co γ射線對微生物具有良好的高產菌株作用。

1.3 超高壓

超高壓對微生物有多方面的影響，它不僅可使微生物細胞組分、體積形態發生變化，還可使微生物的基因表達和核酸結構及其生物學功能發生改變。隨著人們各種新技術的運用，超高壓被逐漸地應用于生物學各種領域中，并在許多方面得到了深入研究，特別是在食品方面取得了初步的應用[13-14]。王歲樓等[15]通過超高壓力誘變技術篩選出了2株具有較大應用潛力的高壓突變株，酶活比出發菌株分別提高了2.83倍和2.57倍，并且發酵時間縮短了1 d，增加了生產收益，縮短了生產時間。有些微生物在極端耐高壓的條件下生存，壓力保持一種平衡狀態，通過打破這種平衡，來達到誘變的目的，引起了人們對耐高壓菌的探索。

1.4 激光誘變

人們在微生物遺傳育種中發現激光誘變具有操作簡單、安全、正突變機率高、對菌株損傷小、誘變菌株較出發菌株比提高倍數大等特點，其在霉菌中也進行了很好的運用，特別是在黑曲霉中運用提高倍數較大，但是激光與微生物作用機制還不能完全被弄明白[16-17]。李俊剛等[18]研究表明激光對黑曲霉原生質體的致死率比對孢子的致死率高。激光對原生質體誘變比孢子正突變率要高，其最高突變株酶活提高了91%。彭益強等[19]通過激光輻射黑曲霉孢子液和原生質體液，表明原生質體比孢子耐受激光誘變的能力強，并且誘變正突變菌株較多，最終篩選到一株酶活提高達3.75倍的變異菌株。原生質體液和孢子液是霉菌誘變中比較典型的特征，并且霉菌產生的菌絲對液體的混勻也有一定的阻礙作用。

1.5 離子注入

曹小紅等[20]選用N+離子束注入米曲霉誘變，注入時選擇能量為20 keV，篩選得突變菌株TK-7，蛋白酶酶活較出發菌株提高36%。龐銳等[21]采用低能N+注入技術對米根霉As 3.819進行誘變選育，獲得L-乳酸產量最高達到103.81 g/L的菌株，較初篩前提高了30.71%。古紹彬等[22]采用低能離子注入誘變對米根霉PW352進行改良獲得高產L（+）-乳酸菌株RE3303產酸能力達131 g/L～136 g/L，最高可達140 g/L，產酸比PW352提高75%。龔加順[23]以單寧酸酶高產菌株用低能N+離子注入黑曲霉9701，使得正突變率達到27.61%，篩選得到高產菌株比出發菌株酶活力提高了2.68倍，且遺傳穩定性好。通過相關文獻[24]，通過離子注入的方法，運用不同的菌株處理發現菌株目的產物最大能提高到原來的16倍，在霉菌里面也能夠提高到原來的15倍[25]。研究表明[26]，離子注入處理是一種有潛力的微生物誘變育種新方法，且產生的菌株比原來菌株有較大的提高，正突變率較大，產生的新菌株遺傳性能穩定。

1.6 微波

邵淑娟等[27]采用微波輻照方法對產凝乳酶的黑曲霉JG進行誘變處理，選育出具有遺傳穩定性的突變株WB6-3、WB2-5凝乳活力分別比出發菌株提高了35%和14%。李永泉等[28]采用微波輻照，對黑曲霉木聚糖酶生產菌進行誘變處理，結果選育到一株產量較高的生產菌，發酵單位從15 000 U/mL提到21 500 U/mL所選育的菌株經多次傳代，遺傳性狀十分穩定。

還有其它物理誘變技術的運用，例如超聲波誘變[29-30]、航天誘變[31-32]、常壓室溫等離子體、重離子輻照、熱效應等誘變新技術。

2 化學誘變

在現在的應用中，化學誘變有多種形式，既有運用某一種化學誘變劑進行的單因素誘變，也有組合其它化學誘變劑或其他多種誘變方法的復合誘變，還有化學誘變劑聯合抗生素作用抗性篩選等。而化學誘變劑很多是致癌劑或劇毒藥品，使用時須十分小心。

亞硝基胍在霉菌中單一的化學誘變中運用的很少，更多的是化學誘變劑結合物理誘變，并且取得很明顯的效果。張同亮等[33]利用亞硝基胍對野生黑曲霉DH-010進行誘變，使用自制的培養基篩選出10株對羊毛細化具有效果的菌株，又通過搖瓶復篩出一株對羊毛細化具有明顯效果的菌株并命名為DH-CAO，同時設計了一種以羊毛作為底物的酶活力測定方法，用此法篩選出的菌株的最高產酶活力可以達到620 μg/mL。其他的單一化學誘變劑在霉菌中很少有看到報道，主要是和其他誘變方法組成復合誘變方法。

3 物理化學復合誘變

多種物理誘變方法和多種化學誘變方法結合使用，在霉菌中為了得到高產菌株產生了很好的效果。特別是物理誘變方法紫外線和化學誘變方法氯化鋰相結合運用較多，并且提高倍數較大[34-37]。趙炎生等[38]采用激光和氯化鋰復合誘變赤霉菌，復合誘變提高達189.6%。徐麗等[39]應用60Co γ射線照射并結合甲硫氛酸篩選模型和5-氟尿喀吮篩選模型誘變對出發菌株阿維鏈霉菌H20-16進行誘變處理，獲得發酵單位提高的菌株Co39-15和CF（20）-39-61比出發菌株分別提高了173.3%、76.5%。陳紅歌等[40]以黑曲霉MAO2 1為出發菌株，經紫外線、亞硝基胍單獨處理和復合處理，獲得一株植酸酶高產菌株UN-12-10是原始菌株的3.6倍。林劍等[41]對琥珀酸產生菌S-1進行紫外線亞硝基胍的復合誘變后，篩選出琥珀酸產量高，在運用激光誘變，得出高產菌株相對于未誘變的菌株產量提高了343倍。方春玉等[42]以紫紅紅曲霉為出發菌株，通過物理（紫外線、超聲波、微波）誘變和化學（氮化鏗）誘變的方法來選育紅曲色素高產菌株，紫外和超聲波復合誘變的方法產紅曲色素的色價為922 U/mL，比出發菌株產紅曲色素的能力提高了約3倍。魏培蓮等[43]紅曲霉出發菌株經紫外線,硫酸二乙酯,氯化鋰等誘變劑反復誘變處理，誘變株M7的含量比出發菌株相比提高了41倍。楊勁松[44]采用紫外線（UV）,激光（Laser）,亞硝基孤（NTG）復合誘變HN89青霉后，效價提高了100%以上的菌株為9株，占13%，其中突變株HN89-68活性物質的相對效價可提高到286%。

各種物理誘變方法和化學方法結合的常被運用到，常常是一種物理誘變方法和一種化學誘變方法結合，也有運用多種物理誘變方法和一種或多種化學誘變方法結合，或者一種處理方法多次重復使用來達到高產的目的，其中最常運用到的物理方法有紫外線、激光、微波、60Co γ射線等，最長運用到的化學方法有氯化鋰、亞硝基胍、亞硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等。

4 總結

在霉菌誘變方法中，物理方法比較多，并且相對于化學方法來說較安全、簡單，并且不會產生很多的有害物質對突變株的影響。在物理誘變方法中，新技術離子注入方法取得了很好的突破，提高了的倍數都比較大，并且適當的結合化學誘變劑，也能夠取得很不錯的突變效果。今后發展新的物理技術運用到霉菌微生物誘變中，會有很不錯的發展前景。

[1]Yan Tao.The research of the mutafacient hericium erinaceus poured by the nitrogen ion beam[J].Food industry science and technology, 2007,21(3)：11-17

[2]Chen Hao,Liang Yun-zhang.The using of Ion beam biological technology at Medicinal plant breeding[J].Chinese Medicine Magazine, 2005,5(5)：41-43

[3]郭繼平,馬鶯.紫外誘變選育米曲霉高產蛋白酶菌株[J].微生物學通報,2007,34(2)：246-250

[4]陳亞光,高朝輝,陳勇,等.滬釀3.042米曲霉紫外誘變及高活力蛋白酶菌株選育[J].中國調味品,2005,3(3)：15-18

[5]屈二軍,索向陽,趙楨,等.高產纖維素酶的黑曲霉菌種的選育[J].安徽農業科學,2008,36(24)：10303-10304

[6]郭魯宏,楊順楷.黑曲霉單寧酶高活性菌株的誘變選育[J].微生物學通報,2000,27(2)：105-108

[7]周長海,于洪梅,王淑杰,等.粟米醬米曲霉菌的紫外線誘變及優良菌種的選育[J].中國釀造,2006,11(20)：24-27

[8]陳建愛,王未名.輻照木霉菌株的生物學效應研究[J].核農學報, 2003,17(1)：16-19

[9]楊平平,王燕,陶文沂,等.60Co γ射線誘變黑曲霉菌株產植酸酶的研究[J].核農學報,2004,18(3)：193-196

[10]梁新樂,陳敏,張虹,等.60Co γ射線誘變阿維拉霉素篩選高產菌株及培養基優化[J].核農學報2007,21(5)：451-455

[11]宋安東,蘇麗娟,謝慧,等.γ射線對斜臥青霉的誘變篩選及產酶條件優化[J].核農學報,2008,22(3)：280-285

[12]胡燕紅,姜紹通,羅水忠,等.米根霉產L-乳酸耐溫菌株的60Coγ射線誘變選育[J].食品科學,2008,29(12)：452-456

[13]Rikimaru H.High pressure in bioscience and biotechnology：pure science encompassed in pursuit of value[J].Biochemical et Bio－physical Acta,2002,1595(1)：397-399

[14]Bartlett D H.Pressure effects on in vivo microbial processes[J].Biochemical et Biophysical Acta,2002,1595(1)：367-381

[15]王歲樓,吳曉宗,郝麗花,等.超高壓在工業微生物誘變選育中的應用初探[J].中國生物工程雜志,2005,25(6)：7-9

[16]van Breugel H,Bar PRD.Power density and exposure time of He-Ne laser irradiation are more important total energy dose in photobiomodulation of human fibroblasts in vitro[J].Lasers in Surgery and Medicine,1992,12(1)：528-537

[17]Femandez RO,Pizarro RA.Pseudomonas aeruginosa.UV-A-induced lethal effece：influence of salts,nutritional stress and pyocyanine[J].Photochem Photobiol B：Biol,1999,50(1)：59-65

[18]李俊剛,方善康.激光誘變黑曲霉原生質體選育高酶活生淀粉糖化菌的研究[J].微生物學通報,1993,20(4)：213-215

[19]彭益強,呂鳳萍,賀淹才,等.激光誘變篩選高產植酸酶黑曲霉菌株的研究[J].激光生物學報,2012,11(6)：434-437

[20]曹小紅,杜冰冰,魯梅芳.N十離子束注入米曲霉誘變效應的研究[J].中國食品學報,2005,5(4)：128-132

[21]龐銳,潘麗軍,姜紹通,等.N+注入誘變選育混合糖發酵L-乳酸高產菌株[J].食品科學,2010,31(21)：248-253

[22]古紹彬,葛春梅,汪青宏,等.產L-乳酸米根霉PW352特性及低能離子注入誘變高產菌株研究[J].工業微生物,2004,34(1)：12-16

[23]龔加順,劉勤晉,肖琳,等.單寧酸酶產生菌氮離子注人的誘變效應研究[J].食品與發酵工業,2000,26(5)：9-13

[24]宮春波,劉鷺,謝麗源,等.離子注入微生物誘變育種研究進展[J].生物技術,2003,13(2)：47-49

[25]劉連碧,朱春寶,珠寶泉.離子注入誘變育種技術在柔紅霉素高產菌選育中的應用[J].中國醫藥工業雜志,2001,32(7)：297-299

[26]桑金隆,竺莉紅,李孝輝,等.離子注入誘變選育之江菌素產生菌[J].科技通報,2002,18(1)：63-66

[27]邵淑娟,李鐵柱,李倬林,等.產凝乳酶黑曲霉JG的微波誘變育種研究[J].中國釀造,2010,7(1)：47-50

[28]李永泉.微波誘變選育木聚糖酶高產菌[J].微波學報,2001,17(1)：50-53

[29]楊勝利,王金宇,楊海麟,等.超聲波對紅曲菌的誘變篩選及發酵過程在線處理[J].微生物學通報,2004,31(1)：45-49

[30]趙興秀,方春玉,周健,等.紫外線與超聲波復合誘變選育紅曲色素高產菌株的研究[J].中國釀造,2010,216(3)：66-69

[31]印紅,謝申義,章光明,等.利用返回式飛船選育優良紅曲霉菌[J].核農學報,2004,18(4)：297-299

[32]王希季,林華寶,蘇連風.中國返回式衛星的搭載任務,空間生命科學試驗[J].中國空間科學技術,1995(4)：29-36

[33]張同亮,張揚,繆翔,等.亞硝基胍誘變選育酸性蛋白酶產生菌[J].四川紡織科技,2004,4(1)：4-7

[34]閔偉紅,李佳,王影,等.產纖溶酶霉菌的篩選及誘變[J].食品科學, 2007,28(6)：226-229

[35]李平,宛曉春,陶文沂,等.復合誘變黑曲霉選育β-葡萄糖苷酶高產菌株[J].菌物學報,2000,19(1)：117-121

[36]王偉平,吳思方.復合誘變紅曲霉選育紅色素高產菌株[J].湖業工學院學報,2003,18(4)：5-9

[37]盧燕云,林建國,李明.復合誘變選育酸性蛋白酶高產菌株[J].中國釀造,2009,202(1)：49-51

[38]趙炎生,肖燦鵬,蘇寶亮,等.赤霉素產生菌的激光、化學復合誘變育種研究[J].激光生物學報,1997,12(1)：1-7

[39]徐麗,張怡軒,王勇,等.Co60γ射線照射技術在阿維菌素產生菌誘變育種中的應用[J].安徽農業科學,2007,35(13)：3797-3799

[40]陳紅歌,苗雪霞,張世敏,等.植酸酶高產菌株的誘變選育[J].微生物學通報,1997,24(5)：272-274

[41]林劍,孫瑩,劉曉艷,等.琥珀酸產生菌的誘變與選育[J].食品科學, 2007,28(12)：309-312

[42]方春玉,周健,鄧靜,等.高產紅曲色素的紫紅紅曲霉誘變育種技術研究[J].中國釀造,2008,200(23)：19-22

[43]魏培蓮,周立平,毛建衛.高產降膽固醇活性物質的紅曲霉菌種選育研究[J].氨基酸和生物資源,2002,24(3)：18-22

[44]楊勁松,李斌,陳文學,等.海洋青霉菌抗真菌活性物質高產菌株的誘變選育[J].熱帶作物學報,2003,24(2)：77-80

The Application of Mutation Breeding Method in the Mould

XIONG Jin，HUANG Kui-ying，CAO Ding，GAN Xiang-wu，CHEN Qiong
（Guangzhou Institute of Microbiology，Guangzhou 510663，Guangdong，China）

The research progress of mutagenic breeding methods in mold was introduced.The effects of physical mutation，chemical mutation and physical-chemical compound mutation were introduced.Research showed that，physical mutation methods were more widely used than chemical methods，the use of physical mutation and the appropriate combination of chemical mutation also achieved good results.

mutagenesis；mold；physical mutation；chemical mutation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.045

2017-01-17

廣東省省級科技計劃項目（2016B090918055）；廣州市科技計劃項目（201705040004）

熊進（1989—），男（漢），助理工程師，碩士，研究方向：食品生物技術。