食物中食源性病原菌檢測技術研究進展

周威，胡梁斌，李紅波，張浩，莫海珍

（河南科技學院食品學院，河南新鄉453003）

食物中食源性病原菌檢測技術研究進展

周威，胡梁斌，李紅波，張浩，莫海珍

（河南科技學院食品學院，河南新鄉453003）

食源性病原菌的檢測技術對維持我國的食品安全至關重要，目前所使用的檢測技術主要包括傳統的培養鑒定方法和以免疫學和分子生物學為主的快速檢測方法。對以上方法的技術特點和應用情況進行綜述，同時對食源性病原菌檢測技術發展面臨的困難和研究方法進行分析。

食源性病原菌；檢測技術；免疫學；分子生物學

隨著食品產業的快速發展和消費者的消費習慣的改變，對于食品衛生和食品安全的要求越來越高。而受到環境、氣候等影響，食源性病原菌污染食品造成疾病的幾率越來越高。世界衛生組織（World Health Organization，WHO）指出食源性病原菌是主要的食品安全風險隱患，可造成食源性疾病和食物中毒爆發[1]。統計數據表明，全世界每年發生的食源性腹瀉病例超過2億次，其中65%以上的病例食用過被食源性病原菌污染的食品[2]。國內的研究資料顯示，在發生的食源性疾病中，由于污染病原菌導致疾病發生的比例達到71.28%[3]。由此可知，食源性病原菌污染導致的疾病，廣泛存在于發達國家和發展中國家。從概念上講，食源性疾病是指生物性病原體等有毒有害物質通過食用方式進入人體并引起的疾病，包括中毒性和感染性發作，包括最為常見的化學性有毒有害物質中毒、人畜共患傳染病和腸道傳染病等[4]。目前，最常見的食源性病原微生物主要包括黃曲霉菌、產氣莢膜梭菌、大腸桿菌、肉毒梭菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌等[5]。本文對食品中食源性病原菌的檢測技術發展現狀進行綜述，為我國食品中病原菌的檢測、監督和控制提供借鑒。

1 食源性病原菌傳統檢測技術應用情況

病原菌的傳統鑒定方法主要是指先培養后觀察的方法，具有較高的鑒定效率，但存在培養時間過長的缺點。目前主要的傳統鑒定方法，主要包括以下幾類。

1.1 培養鑒定法

培養鑒定方法基于生物化學的原理，對不同病原菌在生長代謝過程中產生的酶類進行特異性鑒定，檢測的酶類包括磷酸酶、蛋白酶、DNA酶、脂酶、酯酶和糖苷酶。具體的操作方法是：在特定培養基中加入指示劑和反應底物，保證細菌在培養基上的生長過程中產生一定顏色或發出熒光，實驗人員通過觀察菌落顏色、數量和形態進行鑒定。這種方法具有直觀性的特點，要求檢查條件不高，非常適合基層地區開展，也是當前微生物檢測技術的主要方法[6]。

1.2 載體培養法

在培養鑒定法的基礎上，發展處載體培養法鑒定方法。載體培養費又稱干片法，其原理是采用安全無毒的高分子材料為載體，分別將顯色物質和培養基附著其上，之后通過培養，對病原菌的顯色反應和生長特征進行鑒定。這種方法操作簡單并且直觀準確，可以將食物采樣和細菌接種同時進行，并保留培養鑒定法的優點，基本符合定量檢測的需求。特別是在乳品檢測中，載體培養法的升級版本-濾膜法已經廣泛應用于奶油、巴氏殺菌乳和生乳的食品生產中[6]。

2 快速檢測技術應用情況

快速檢測技術是在傳統的鑒定方法基礎上開發出來的，具有節省時間、操作簡便和準確率較高的優點，主要包括以下幾種。

2.1 自動化微生物快速培養與鑒定系統

自動化微生物快速培養與鑒定系統是在傳統的鑒定培養方法基礎上，使用計算機和儀器組合完成病原菌檢測的自動化和集成化，在專業分析軟件的幫助下，達到靈敏、準確、快速和簡便的目的。該系統主要由病原菌培養系統和病原菌鑒定系統組成，培養系統可以在較短的時間內，完成增菌實驗；鑒定系統通過計算機形態學和生化分析軟件對病原菌的形態和代謝特征進行分析，最終達到鑒定的目的。目前，自動化微生物快速培養與鑒定系統已經廣泛應用于多種食品安全檢測機構，檢測結果認可較高[7]。

2.2 免疫學檢測方法

免疫學檢測方法主要根據抗原抗體的特異性反應對病原菌進行鑒定，這類方法的發展前提是獲得特異性的病原菌抗體，根據檢測手段的不同，目前主要包括：酶聯免疫分析法、免疫磁珠分離技術、雙功能抗體檢測技術和膠體金檢測技術。

2.2.1 酶聯免疫分析法

酶聯免疫檢測技術（ELISA）是目前發展較為成熟的免疫學檢測方法，只需要獲得特異性的抗原抗體就可以設計研發。對于食源性病原菌的檢測通過采用雙抗夾心ELISA的方法，可以提高檢測的特異性和準確性。國內外多個公司開發出大量的ELISA檢測試劑盒，可以檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌、阪崎腸桿菌、志賀氏菌、乙型溶血鏈球菌、空腸彎曲桿菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7等多種食源性病原菌[6]。

2.2.2 免疫磁珠分離技術

免疫磁珠分離技術是一種基于免疫學原理的以抗原抗體特異性反應為基礎的分離鑒定技術，目前已經廣泛應用于病原菌的富集與分離。其基本原理是將病原菌特異性抗體制備成超順反子磁性顆粒，將這種顆粒混合在食品樣本中，可以與病原菌發生特異性結合，然后通過磁場作用實現病原菌的分離與富集。免疫磁珠分離技術由于具有富集和分離雙重屬性，因此其兼容性非常好，可以與流式細胞儀、電化學技術、免疫學技術、分子生物學技術和形態學鑒定技術有限結合，真正實現食源性病原菌的的快速檢測。以此為基礎開展的快速檢測已經應用到實際監管中，如免疫磁珠分離技術和PCR技術聯用組建的食源性病原菌快速檢測設備已經應用于實際監管中[8]。但是由于食品樣本成分復雜，基質組成較多，導致免疫磁珠分離技術在應用上受到限制，因此在未來的發展中，制備免疫磁珠富集體系環境、選擇適合的增菌培養基和制備高性能的免疫磁珠是將來主要的發展方向。

2.2.3 雙功能抗體檢測技術

免疫學檢測技術主要依靠于抗體的特異性，開發一種新型抗體同時識別兩個不同的抗原，必然可以提高檢測的效率。在這種設想下，雙功能抗體檢測技術在2014年被應用于單核細胞增生李斯特菌的檢測，該方法不需要進行培養，并且檢測靈敏度可以達到102cfu/mL～103cfu/mL[9]。以可以檢測李斯特菌的雙功能抗體為例，簡單介紹其設計原理，研究者首先需要分別制備識別單核增生李斯特菌和紅細胞的特異性抗體，之后進行均勻混合，利用氧化作用，是兩種抗體間形成可連接的二硫鍵，然后再通過還原反應提高混合抗體的二硫鍵組合效率，最終得到一種同時可以識別單核細胞增生李斯特菌和紅細胞的雙功能抗體。這種雙功能抗體在應用過程中與普通抗體一樣，可以直接加入待測樣本中，20 min～30 min后既可以引起血紅細胞發生聚集，形成經典的血凝現象，可直接食用肉眼觀察[9]。然而這種方法在使用上仍然存在諸多限制，而且在制備上效率仍然過低，但是由于這種方法不需要特定的檢測儀器，使用上具有靈活準確的優點，仍有值得我們期待。

2.2.4 膠體金檢測技術

膠體金檢測技術是在ELISA檢測技術之后，已經成型的一種免疫學快速檢測技術，這種技術根據抗原抗體翻譯，采用層析膜為反應載體、膠體金為顯示信號，以檢測卡或檢測試紙條的形式保存。由于膠體金試紙條可以10 min獲得檢測結果，因此已經成為主要的食品安全現場快速檢測方法。目前商品化的膠體金試紙條可以檢測結腸彎曲桿菌、李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7、蠟樣芽孢桿菌、軍團菌等多種食源性病原菌[10]。

2.3 分子生物學檢測方法

分子生物學檢測方法是目前生物醫學領域檢測病原體主要的快速檢測手段，目前應用于食源性病原菌的檢測方法包括：PCR檢測技術，環介導等溫技術，基因探針技術和生物芯片技術。

2.3.1 PCR檢測方法

聚合酶鏈式反應簡稱為PCR，是最常用的分子生物學檢測手段，其與免疫學方法的特異性不同，PCR檢測的是食源性病原的特定基因片段。在實際工作中，PCR技術可以在2 h內完成食源性病原菌的檢測，并且不需要進行前期的增菌培養。但是在反應體系中存在腐殖質、金屬離子、高脂肪或高蛋白是，將會抑制PCR檢測的效率，因此常規檢測中，仍然需要通過增菌實驗（小于3 h），提供檢測的靈敏性。

2.3.2 環介導等溫技術

環介導等溫技術（LAMP）是由日本榮研株式會社研發的一種基因擴增技術。它依賴于一種特殊的DNA聚合酶，可以識別靶基因上的6個特定區域并進行擴增，因此LAMP技術具有恒溫擴增和特異性高的特點。通過加熱熒光染料（Eva Green、GelRed、溴化乙錠和SYBER Green），僅需在紫外燈下就能進行結果觀察，不需要任何儀器。從2008年開始，研究者開始使用LAMP方法對食源性病原菌進行檢測，建立了高于PCR方法20倍靈敏度的檢測方法。在2013年，我國研究者通過大規模的篩選工作，建立一種多重LAMP檢測技術，可以同時實現單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的同時檢測。LAMP檢測技術要求設備簡單，操作簡單，非常適合我國國情，可以廣泛應用在基層研究中，出于這一目的我國已經建立多項LAMP技術的檢測標準[9]。根據國家的標準，目前已經有基于LAMP檢測技術的實驗設備上市，可以對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等多種病原菌進行檢測。

2.3.3 基因探針技術

基因探針是一段被特殊標記的小段核酸，根據堿基互補原則，基因探針可以與目的基因發展特異性雜交，由于其被特殊標記過，因此可以實現檢測目的基因的目的。對于基因探針的標記方式發展快速，經標記過的探針表現出安全、準確和直觀的特點。在實際工作中，基因探針對于食源性病原菌的rRNA序列特異性識別，并進行高復制量擴增，因此可以保持較高的靈敏度。

2.3.4 生物芯片技術

生物芯片技術是基于基因探針技術發展而來的快速檢測方法，其原理是將特異性的基因探針固定在芯片上，對原始或富集后的樣本進行雜交，最后通過信號接收的方式對檢測結果進行判斷。從原理上講，生物芯片技術具有基因探針和PCR技術的優點，但是在操作性和高通量上又優于這兩種方法，因此一直是我國食品行業標準研究的熱點，如肉及肉制品中常見致病微生物檢測方法-生物芯片法（SN/T 2651-2010《肉及肉制品中常見致病菌檢測方法基因芯片法》）、食源性致病菌基因芯片鑒定方法（SN/T 1543-2005《食源性致病菌基因芯片鑒定方法》）很早被引入行業標準中[10]。目前適用于檢測的生物芯片共包括兩類，一種是基因芯片，另一種是基于熒光微球懸浮液相芯片。液相芯片通常被稱為懸浮芯片，是由于其所有反應都是在懸浮液相中的微球表面進行的。與基因芯片不同，懸浮芯片可以結合蛋白質等多種生物分子，再通過生物親和反應進行吸附，克服傳統基因芯片的固相雜交缺點，顯著提高檢測效率。在食源性病原菌的檢測領域，已經有針對沙門氏菌的檢測試劑盒上市銷售，利用懸浮芯片進行檢測已經受到重視并開始研究。

3 食源性病原菌檢測面臨的挑戰與發展方向

3.1 食源性病原菌檢測面臨的困難

應用于食品安全監督領域的食源性病原菌檢測均屬于快速檢測，因此所面臨的困難遠高于臨床病原菌檢測，具體是由于食品組成復雜，部分病原菌增菌技術費時和檢測方法的局限性造成的。

3.1.1 食品組成復雜

食品的種類多樣，其組成基質復雜，包括碳水化合物、脂肪、蛋白質等多種化學物質，并以不同的物理形態存在，因此其中污染的細菌分布情況不規則。而且部分發酵食品，如酸奶等，自身含有正常微生物，雖然不影響健康，但是會干擾病原菌的檢測工作。

3.1.2 部分病原菌增菌技術費時

雖然檢測方法多樣，可以顯著的縮短檢測時間，但是大部分方法仍然需要進行增菌培養，以提高檢測的準確率。但是目前的局面是，采用的增菌技術通常不“快”，具有較高的依賴性。因此將來的研究將重點集中在增菌培養實驗上，一方面增加待檢測菌量，一方面去除食品中的干擾物質。

3.1.3 檢測方法的局限性

快速檢測方法雖然較傳統檢測方法，節省了檢測時間，并提高了檢測效率，但是仍然存在一定的局限性。首先，一些死亡的病原菌在食品中不可繁殖，但是通過免疫學或者分子生物學檢測技術仍然可以檢測到；其次，一部分病原菌通過分泌毒素發揮毒力，而通過檢測細菌數量的方法無法判斷污染這種細菌對食品安全的影響；最后，如果病原菌出現基因突變或基因缺失現象，導致檢測抗原或基因無法識別，最終導致檢測失敗。

3.2 食源性病原菌檢測技術發展方向

雖然食源性病原菌檢測技術的發展困難較多，但是為保障人類的食品安全，將來仍然需要加大食源性病原菌的研發力度，開發出更快速、準確和高效的檢測方法。

3.2.1 細菌的分離與富集方向

要克服檢測過程中發生的干擾顯著，提高病原菌的分離和富集效率是迫切需要的。如免疫磁珠技術的發展，可以對食品中分布的少量病原菌進行聚集，不同增菌實驗，就可以實現檢測。最近提出的膜過濾法，較免疫磁珠法更為經濟，也可以到達富集待測病原菌和去除干擾物質的作用，并且操作更為簡單，部分檢測已經可以直接在膜上進行。

3.2.2 多重檢測技術方向

食品可以被多種病原菌同時污染，而目前可進行多重檢測的技術在實際工作中效果仍然難以令人滿意。對于大多數的食源性病原菌檢測方法來說，一次檢測只能針對一種病原菌，如果檢測對象較多，將會形成大量的重復工作。目前僅懸浮芯片可以實現這一目的，相對于傳統檢測技術，懸浮芯片檢測方式更靈活，但在實際應用中仍然有較多問題需要完善。

3.2.3 定量檢測和快速檢測的認證與評估

目前對于快速檢測技術實現定量檢測仍然有一定難度，僅能保證檢測結果為半定量或相對定量。然而實現食源性病原菌快速定量檢測對食品中病原菌的限量標準和風險評估具有重要意義，因此將來的工作需要提高快速定量檢測的研發。

4 總結

對于食源性病原菌的研究，應重點建設完善的病原菌類型以及毒力因子監督和溯源機制，并根據食源性病原菌的發展、流行和傳播模式，努力尋找更高效的食源性病原菌控制技術，為我國食品安全監督事業提供準確的理論和技術支持。

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Advances in Detection of Foodborne Pathogens in Food

ZHOU Wei，HU Liang-bin，LI Hong-bo，ZHANG Hao，MO Hai-zhen
（Food College，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，Henan，China）

The detection technology of foodborne pathogens was very important to maintain the food safety of our country.The current detection technology mainly included traditional culture and identification methods and rapid detection methods was based on immunology and molecular biology.In this paper，the technical characteristics and application of the above methods were reviewed，and the difficulties and research methods of foodborne pathogen detection technology were analyzed.

foodborne pathogens；detection technology；immunology；molecular biology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.048

2017-02-17

河南科技學院教育教學改革研究項目（2016ZD15）；河南科技學院研究生教育教學改革研究項目（YJG2014YB03）

周威（1981—），男（漢），講師，碩士生導師，博士，研究方向：食源性病原微生物的控制。