腈水合酶制備關鍵技術研究

腈水合酶是一類可以催化腈類物質轉化相應的酰胺類化合物的金屬酶，工業上利用其催化丙烯腈轉化為丙烯酰胺。該生物法制備丙烯酰胺工藝在1985年被開發，是生物法替代化學法的典型案例。

隨著丙烯酰胺的需求不斷擴大，國內外研究機構及學者對腈水合酶產生菌的分離選育、菌株特性研究、酶的形成條件、酶的結構和性質、生物合成機制、翻譯后的成熟機制等進行了深入研究。如中國專利CN201710456875.6公開了一種改造腈水合酶及其應用，該發明改造腈水合酶的抗逆性、耐熱性和產物耐受性都有顯著提升，并且沒有導致腈水合酶活性的降低。改造腈水合酶可催化獲得高濃度丙烯酰胺產物，且可以多批次回用。CN201610035437.8為一種球化酶技術固定化腈水合酶的方法，該方法包括以下步驟：（1）向腈水合酶溶液中加入保護劑PLL，混合均勻作為水相；另向正己烷中加入表面活性劑span-80，混合均勻作為油相；再把水相和油相混合攪拌制成粗乳液；（2）將上步得到的粗乳液在5～30 kPa的跨膜壓力下通過SPG膜乳化器，待粗乳液完全通過SPG膜后，即得到W/O型（油包水）乳液，然后向該乳液中滴加交聯劑戊二醛，交聯0.5～4 h，離心洗滌，即可得到球形腈水合酶粒子。該發明的制備工藝簡單，條件溫和，酶活回收率在50%以上。重復使用10次后，酶活還可達到初始酶活的45%左右。同游離酶相比，儲藏穩定性也更好。CN201510244547.0公開了一種高效表達高分子量型腈水合酶的基因工程菌及其應用，該發明所述的高分子量型腈水合酶基因nhhB(rbs)A(rbs)G是基于R.rhodochrous J1來源的腈水合酶基因bag，經密碼子優化及表達元件改造之后化學合成得到，該基因全長1 645 bp，編碼533個氨基酸，能夠在大腸桿菌中成功表達。該方法高效安全，在24℃誘導16 h即可獲得96.7 U/mL可溶性腈水合酶，純化后比酶活高達234 U/mg。該方法有利于生產過程中腈水合酶的提取純化以及酰胺類物質的高效酶法合成。CN201510226690.7公開了一種比酶活和穩定性提高的融合型腈水合酶，其將來源于惡臭假單胞菌的腈水合酶在大腸桿菌中高效表達并采用亞基融合策略提高穩定性及產物耐受性。該發明方法簡單高效安全，能夠在較短的表達周期里獲得穩定性高，產物耐受性強的大量可溶性腈水合酶，有利于在簡單條件下進行大規模工業生產，以及進一步對融合型腈水合酶成熟機制的理論研究。CN201410843384.3公開了一種耐熱重組腈水合酶基因、編碼酶、載體、工程菌及其在催化腈化合物生成酰胺和生物降解除草劑敵草腈中的應用，該發明實現了源自慢生型大豆根瘤菌USDA 110中假定腈水合酶基因的功能表達，證明了一種腈水合酶的活化元件在表達過程中的關鍵作用。同時，該發明提供了一種在大腸桿菌內構建腈水合酶基因工程菌的方法，在腈水合酶基因在活化元件的參與下獲得具有高表達量和高活性的腈水合酶。CN201410758150.9公開了一種腈水合酶及其應用，該腈水合酶由α亞基和β亞基組成。該發明從博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM 12804)中克隆到腈水合酶基因，該基因表達后成功獲得具有高表達量和高活性而且底物譜廣、具手性選擇性的腈水合酶。CN201280028338.7提供催化活性提高了的改良型腈水合酶，并且提供編碼該改良型腈水合酶的DNA、包含該DNA的重組載體、包含該重組載體的轉化體、從該轉化體的培養物中提取的腈水合酶及其制造方法。CN201110384089.2公開了一種克隆表達腈水合酶調控蛋白的方法，是采用在腈水合酶調控蛋白基因序列N端加His-tag，與腈水合酶成熟酶基因串聯，在大腸桿菌BL21中共表達。

在現今微生物法生產丙烯酰胺的流程中，仍然普遍存在菌種的酶活穩定性差、對底物和產物的耐受性不高以及產物丙烯酰胺會向副產物丙烯酸進一步轉化等問題。為此，利用基因工程手段研究腈水合酶在氨基酸序列、折疊方式和活性位點等方面的特性，并通過代謝工程優化水合反應的代謝過程，將成為今后微生物法生產丙烯酰胺的研究熱點之一。

（江南大學圖書館 張群）