克羅諾桿菌分型技術研究進展

費 鵬，楊同香，姜亦超，陳俊亮，羅 磊，任廣躍，康懷彬,*，Stephen James FORSYTHE*

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.長白山食品藥品檢驗檢測中心，吉林 白山 134500；3.諾丁漢特倫特大學病原體研究中心，英國 諾丁漢 NG11 8NS）

克羅諾桿菌分型技術研究進展

費 鵬1，楊同香1，姜亦超2，陳俊亮1，羅 磊1，任廣躍1，康懷彬1,*，Stephen James FORSYTHE3,*

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.長白山食品藥品檢驗檢測中心，吉林 白山 134500；3.諾丁漢特倫特大學病原體研究中心，英國 諾丁漢 NG11 8NS）

克羅諾桿菌原名阪崎腸桿菌，是嬰兒配方乳粉中主要的致病菌之一，能感染新生兒，并導致嚴重的壞死性小腸結腸炎、菌血癥和腦膜炎等疾病，致死率高達40%～80%。本文綜述了克羅諾桿菌常見的表型分型和分子分型方法，包括生化分型、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜分型、血清型分型、脈沖場凝膠電泳分型、多位點序列分型、隨機多態性擴增DNA基因分型、核糖體分型、特殊基因分型和全基因組分型，以期增加人們對克羅諾桿菌分型方法的認識，為全面揭示克羅諾桿菌的表型特征和遺傳多樣性提供方法和依據。

克羅諾桿菌；表型分型；分子分型；分型技術

克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）屬于腸桿科，由阪崎克羅諾桿菌（C. sakazakii）、丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌（C. malonaticus）、穆汀斯克羅諾桿菌（C. muytjensii）、蘇黎世克羅諾桿菌（C. turicensis）、都柏林克羅諾桿菌（C. dublinensis）、傳奇克羅諾桿菌（C. universalis）和調味品克羅諾桿菌（C. condimenti）7 個種組成，具有高度的遺傳多樣性[1-3]。更重要的是，克羅諾桿菌屬于嬰兒配方乳粉中的A類致病菌，新生兒尤其是體質量較輕的早產兒攝入被克羅諾桿菌污染的嬰兒配方乳粉后，會發生嚴重的壞死性小腸結腸炎、菌血癥和腦膜炎等疾病，死亡率為40%～80%[4-5]。2014年XU Xiaoke等[6]從530 份市售的嬰兒配方乳粉中共檢測到23 株克羅諾桿菌，污染率高達4.3%。然而并不是所有的克羅諾桿菌都具有致病性，且不同的克羅諾桿菌的致病能力也不相同。據報道，阪崎克羅諾桿菌、丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌和蘇黎世克羅諾桿菌具有致病性，且克羅諾桿菌毒素毒性的強弱與其分型的種類有密切聯系[7-8]。

克羅諾桿菌的分型方法包括表型分型和分子分型，其中表型分型包括生化分型和蛋白分型，分型的結果不僅能反映出克羅諾桿菌的形態特征、蛋白結構、血清型等表型特征，也可以對克羅諾桿菌進行鑒定，具有較高的靈敏度，但可能產生一定的假陽性[9]。克羅諾桿菌分子分型的方法多種多樣，如脈沖場凝膠電泳分型、多位點序列分型、隨機多態性擴增DNA基因分型、核糖體分型、全基因組分型等，可以從基因層面揭示克羅諾桿菌之間相似程度及系統發育關系，并能達到對嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌進行溯源的目的。本文對克羅諾桿菌的分型方法進行了綜述，以期為克羅諾桿菌表型和遺傳多樣性的研究提供理論依據。

1 克羅諾桿菌的表型分型

1.1 生化分型

克羅諾桿菌的生化分型，早期是依據克羅諾桿菌的不同生理生化反應結果進行，主要的生理生化反應有：福格斯-普里斯考爾實驗、甲基紅反應、吲哚反應、鳥氨酸脫羧酶反應、乳糖產酸反應、硝酸鹽（亞硝酸鹽）的減少反應、D-葡萄糖的產氣反應、丙二酸利用等[10]。目前最常見的生化分型方法是利用API20E生化鑒定系統，通過20 個不同的生理生化反應來確定克羅諾桿菌的生化表型。李磊等[11]利用API20E對分離自嬰兒配方乳粉的野生克羅諾桿菌進行了生化分型，23 株克羅諾桿菌被分為了7 個生化型。LU Yan等[12]則利用API20E對75 株克羅諾桿菌進行了生化鑒定，并將其分成了8 個生化型。雖然API20E有一定的生化分型能力，但是辨識度很低。此外，API20E對克羅諾桿菌也具有一定鑒定能力，但是與基于16S rRNA的分子鑒定方法相比，API20E的鑒定方法可能導致假陽性的情況發生。

1.2 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜分型

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是一種用于鑒定食源性致病微生物的新興技術，MS儀的高靈敏度及準確度使其非常適合應用于微生物化學分類的研究。它的原理在于通過電離待檢微生物的表面蛋白質，得到電離離子的質核比（m/z），以離子的m/z為橫坐標，離子峰強度為縱坐標形成質譜圖，并將質譜圖中的數據與數據庫中的數據進行比對，確定最終的檢測結果[13]。2014年，趙貴明等[14]建立了克羅諾桿菌MALDI-TOF MS數據庫，并對135 株克羅諾桿菌進行MALDI-TOF MS分型，進而分析這些菌株與其來源的關系。LU Yan等[12]利用MALDI-TOF MS技術對分離自嬰兒配方乳粉的克羅諾桿菌進行了蛋白分型，將被檢的75 株克羅諾桿菌分為了36 個MALDI-TOF MS型，且全部鑒定為克羅諾桿菌。上述研究表明MALDI-TOF MS分型已經廣泛地應用到了克羅諾桿菌的分型中，且具有較高的辨識度，此外MALDI-TOF MS分型對樣品的純度要求不高，且具有自動化程度高、快速高效等特點。

1.3 血清型分型

克羅諾桿菌的血清型分型是其表型分型的重要組成部分，克羅諾桿菌具有致病性，而脂多糖與克羅諾桿菌的毒素和特異性抗原有關，因此對克羅諾桿菌進行基于脂多糖和O-抗原的血清型分型顯得尤為重要[15]。2011年，Jarvis等[16]利用限制性內切酶片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術對克羅諾桿菌進行了基于脂多糖的血清型分型，即檢測目的DNA在限制性內切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，根據RFLP圖譜之間的相似性對克羅諾桿菌進行血清型分型。2011年，SUN Yamin等[17]建立了基于O-抗原的血清型分型方法，即通過設計代表不同血型的特異性引物，利用多重擴增，根據擴增產物基因條帶分子質量的大小確定克羅諾桿菌的血清型。2013年，Andrea等[18]利用多重擴增的方法對分離自瑞士嬰兒配方乳粉廠的克羅諾桿菌進行了血清型分型，發現主要的血清型為阪崎克羅諾桿菌血清型O1和O2。相比RFLP技術，多重擴增的方法簡便快捷、耗時短，但不能對未知的血清型進行分型[19]。

2 克羅諾桿菌的分子分型

2.1 脈沖場凝膠電泳分型

脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）是傳統的細菌分型方法之一，被稱為細菌分型的金標準[20]。PFGE分型通常選用1～2 種限制性能內切酶（Xba Ⅰ和Sep Ⅰ）對克羅諾桿菌進行酶切，在交替變換的電場中對克羅諾桿菌的DNA片段進行分離，得到PFGE指紋圖譜，最后通過聚類分析對克羅諾桿菌進行分型[21]。由于PFGE分型技術具有高度的辨識度，因此一直被作為重要的分型方法應用于克羅諾桿菌分型之中[22]。2014年，柴云雷等[23]利用PFGE技術對分離自嬰兒配方乳粉的克羅諾桿菌進行了分型，將12 株克羅諾桿菌（包含2 株參考菌株）分為了11 個脈沖場型，可見PFGE分型技術的辨識度之高。同時，利用PFGE分型結果的相似性，可以對克羅諾桿菌進行溯源分析，即根據菌株的來源信息和圖譜中條帶分布的相似性，尋找該致病菌可能的來源，從而達到溯源的目的[12]。但PFGE分型也具有一定的局限性，并不是所有的克羅諾桿菌都能進行PFGE分型，如果基因組上不存在Xba Ⅰ或Sep Ⅰ的限制性內切酶位點，則不能進行PFGE分型[24-25]。此外，它雖然屬于分子分型，但并不能反映克羅諾桿菌之間的系統發育關系，也不能起到鑒定的作用[26]。

2.2 多位點序列分型

多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是一種基于DNA序列的分子分型方法，它選擇能反映全基因組系統發育關系的看家基因，對其進行特異性的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），并對擴增的產物進行基因測序，將得到的序列信息在數據庫中進行比對，得到其序列型，完成微生物的分子分型，并能利用生物學信息軟件進行系統發育分析。在克羅諾桿菌MLST方案中，7 個看家基因被選取，分別為：atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和ppsA[10]。克羅諾桿菌的MLST已經成為最為有效和普遍的分型方法之一，目前已經建立了克羅諾桿菌MLST數據庫（http://www.pubmlst.org/cronobacter），其中包含1 000多株不同來源的克羅諾桿菌，并被分為400多個序列型，所有的研究者都可以通過克羅諾桿菌MLST數據庫分享研究結果，并和其他研究者的研究結果進行比較[27]。

由于克羅諾桿菌MLST技術操作簡便、辨識度較高，且具有高度的共享性，越來越多的研究者采用此項技術對克羅諾桿菌進行分型研究。由于MLST技術的優越性，自2009年此法建立之后，克羅諾桿菌分型的大量研究都采用此法。2012年，Joseph等[7]對美國50 年間的325 株克羅諾桿菌進行了遺傳多樣性分析，發現阪崎克羅諾桿菌序列型（sequence type，ST）4是主要的ST，且與新生兒腦膜炎的引發有關。2013年Andrea等[18]利用MLST技術對分離自瑞士嬰兒配方乳粉廠的克羅諾桿菌進行分型研究，發現其主要的序列型為ST4和ST83，結合血清型分型的結果發現ST4和O-抗原血清型O2、ST83和O7有關。2014年，CUI Jinghua等[28]對我國境內分離自臨床、嬰兒食品和飲用水等的克羅諾桿菌進行分型研究，將105 株克羅諾桿菌分為71 個序列型。2015年，FEI Peng等[25]對分離自我國嬰兒配方乳粉的克羅諾桿菌進行了MLST分型，將70 株克羅諾桿菌分為19 個序列型，并發現中國地區嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的優勢序列型為ST4、ST1和ST64。可見，MLST已經廣泛應用到了克羅諾桿菌的分型中，并被充分地認可。此外，由于MLST是基于核酸序列的分型，因此能夠通過系統發育樹的建立分析克羅諾桿菌間的遺傳進化關系[27]。

2.3 隨機多態性擴增DNA基因分型

隨機多態性擴增DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）基因分型技術是在聚合酶的催化下，先利用隨機引物對細菌基因組DNA擴增，再利用電泳對PCR產物片段分離，最后根據電泳圖譜中每個泳帶中DNA片段的濃度大小和位置等反映細菌的多態性[29]。2010年，研究者利用RAPD技術對克羅諾桿菌進行了分子分型研究，如果將閾值設為80%，則22 株供試克羅諾桿菌能被分為18 個RAPD型[30]。此外，有研究者利用RAPD技術對克羅諾桿菌進行了分子分型，篩選出了用于區分不同種的克羅諾桿菌的特異性引物，并在之后食品中克羅諾桿菌的研究中發現該方法的辨識度為99.9%。在50%閾值的情況下，通過生物信息學軟件的分析將38 株克羅諾桿菌分為8 個簇[31]。RAPD方法具有較高的辨識度，但不能像MLST分型技術一樣實現全球信息共享，也不能精確到每個堿基，而且引物的設計和反應條件會直接影響實驗的結果，不利于實驗結果的重復性[29]。

2.4 核糖體分型

核糖體分型方法可以用于大多數食源性致病菌的分型，但是非自動的核糖體分型操作復雜，重復性和穩定性較差，并且缺少標準化的方法、統一的命名和數據庫，很難達到數據的共享[32]。因此RiboprinterTM基因指紋圖譜分析技術應運而生，該技術以EcoRⅠ和PvuⅡ為標準內切酶，將細菌的細胞溶解并對DNA進行酶切，通過凝膠電泳將DNA酶切結果顯示出來，最后對其圖譜進行分析，由于這些步驟都是利用機器自動化操作，所有的標準都均一，因此可以排除其他外界因素的干擾，并可以利用BioNumefics數據庫軟件對圖譜進行處理和分析，從而建立細菌的指紋圖譜數據庫[33]。裴曉燕等[34]利用核糖體分型對分離自食品的克羅諾桿菌進行了核糖體分型，30 株克羅諾桿菌被分為了26 個核糖體型，不同供試菌株之間的相似度在31.58%以上。RiboprinterTM基因指紋圖譜分析的優點在于重復性和穩定性高，且可以建立數據，方便信息在實驗室之間的共享，具有易操作、耗時短、結果易比較、人為誤差少等優點，可以廣泛應用于公共衛生事件的相似性查詢和初步溯源等[35]。但是，此種方法對克羅諾桿菌的辨識度沒有PFGE和MLST分型高。

2.5 特殊基因分型

一些特殊的基因也可以用于克羅諾桿菌的分型中，比如16S rRNA、內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）、rpoB、外膜蛋白A（outer membrane proteins，OmpA）基因ompA等。利用16S rRNA對克羅諾桿菌進行分析，既可以對其進行鑒定，也可以起到分型的作用[36]。ITS序列是操縱子上16S rDNA與23S rDNA間的一段間隔序列，可用于對克羅諾桿菌的分類鑒定[37]。上述兩個基因不但能夠用于克羅諾桿菌的鑒定，還能夠在一定程度上用于對該致病菌進行分型，但是由于兩個基因所攜帶的遺傳信息不多，因此基于上述基因的分型方法辨識度并不高。rpoB基因是細菌RNA聚合酶β亞基的編碼基因，大量的研究表明可以利用此基因對克羅諾桿菌進行鑒定和分型[38-39]。在病原體黏附和侵入宿主的過程中，OmpA起至關重要的作用，可通過胞移作用使克羅諾桿菌穿過腸上皮細胞[40-41]，因此對克羅諾桿菌進行ompA基因的分型可以為其致病能力及致病機理的研究提供理論基礎。FEI Peng等[25]利用rpoB和ompA兩個基因對克羅諾桿菌進行了分型研究，結果證明了利用這兩類基因對克羅諾桿菌進行分型的可行性。綜上，利用特殊基因可以對克羅諾桿菌進行分型，并可結合特殊基因的功能性挖掘更多的信息，但是這種方法的辨識度不高，不能用于進行溯源研究。

2.6 全基因組分型

全基因組測序是對未知基因組序列的物種進行個體的基因組測序。目前，最為成熟的全基因組測序技術是二代測序即高通量測序技術。與一代測序相比，二代測序不僅能夠保證測序結果具有較高的準確性，而且測序成本也明顯低于一代測序[42]。一些研究學者已經利用二代測序技術對克羅諾桿菌的分離株或模式株進行了測序。YAN Qiongqiong等[43]利用二代測序技術對持續出現在嬰兒配方乳粉工廠設備環境中的一株阪崎克羅諾桿菌（C. sakazakii SP291）進行了全基因組測序分析，得到了該株致病菌基因組的生物信息學數據，為增加對新生兒克羅諾桿菌感染的理解和洞察與環境持久性相關的功能基因提供了幫助。Grim等[44]利用二代測序技術對克羅諾桿菌屬進行了pan基因和核心基因分析，揭示了該屬不同種之間清晰的系統發育關系，并闡明了克羅諾桿菌與分離植物的環境相關性。CAI Liping等[45]則利用二代測序技術揭示了阪崎克羅諾桿菌酰基轉移酶的基因編碼序列。全基因組測序技術是最為理想的分子分型方法，它以細菌的整個基因組為研究對象，對基因組中的全部基因進行測序，測定其DNA的堿基序列，從而獲得更為豐富的生物學信息。全基因組測序是研究克羅諾桿菌分型最有效的方法，并可以對該致病菌進行精確的溯源，但這項技術耗時長、成本高，較難普及[29]。

3 結 語

對克羅諾桿菌進行分型研究可以增加對克羅諾桿菌的了解，并能為克羅諾桿菌的深層研究提供理論基礎。上述的幾種分型方法是近些年來常見的分型手段，其中生化分型、MALDI-TOF MS分型和血清型分型屬于克羅諾桿菌的表型分型。相比API20E和血清型分型，MALDI-TOF MS分型具有較高的辨識度，其中API20E和MALDI-TOF MS均具有較高的鑒定能力，但是血清型分型不能達到鑒定的效果。克羅諾桿菌分子分型的方法較多，其中PFGE分型應用最為廣泛，主要用于克羅諾桿菌等食源性致病菌的分型、溯源及臨床研究[16]。雖然PFGE具有較高的分型辨識度，但不能反映克羅諾桿菌間的系統發育關系，也無法起到鑒定的作用，因此需要其他的方法進行輔助。MLST分型不僅有較高的辨識度，而且能夠用于進行系統發育關系的研究，并且在7 個看家基因中，可以利用fusA基因對克羅諾桿菌進行鑒定[5]。一些特殊基因的分型可以幫助我們對克羅諾桿菌一些功能性基因進行了解，從而為相關研究提供理論基礎。此外，克羅諾桿菌的全基因組分析從整個基因組的層面對克羅諾桿菌進行生物信息挖掘，得到更多的生物學信息，可以更全面地解決克羅諾桿菌的遺傳進化問題，但資金花費較大。綜上所述，一些辨識度較高的分型方法，如MALDI-TOF MS分型、PFGE分型、MLST分型和全基因組分型等方法可以用于克羅諾桿菌的溯源研究，并具有較高的穩定性，可以幫助我們找到克羅諾桿菌的污染源，減少克羅諾桿菌對嬰兒配方乳粉及其他嬰兒食品的污染，從而及時對克羅諾桿菌能引起的疾病進行防控。

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Progress in Typing Methods for Cronobacter spp.

FEI Peng1, YANG Tongxiang1, JIANG Yichao2, CHEN Junliang1, LUO Lei1, REN Guangyue1, KANG Huaibin1,*, Stephen James FORSYTHE3,*

(1. College of Food and Biological Engineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China;2. Changbai Mountain Food and Drug Inspection Testing Center, Baishan 134500, China;3. Pathogen Research Centre, Nottingham Trent University, Nottingham NG11 8NS, United Kingdom)

Cronobacter spp., which was formerly defined as Enterobacter sakazakii, is one of the main pathogenic bacteria that easily contaminates powdered infant formula (PIF) and can infect newborns and cause severe necrotizing enterocolitis,bacteremia and meningitis, with a high mortality rate of 40%-80%. This article reviews the commonly used methods for the phenotypic and molecular typing of Cronobacter spp. including biotyping, matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, serological typing, pulsed field gel electrophoresis, multilocus sequence typing, random amplification of polymorphic DNA, ribotyping, special genotyping and whole-genome typing with the aim of providing a better understanding of these methods, which will offer a basis for revealing the phenotypic characteristics and genetic diversity of Cronobacter spp..

Cronobacter spp.; phenotyping; molecular typing; typing methods

10.7506/spkx1002-6630-201721048

TS252.1

A

1002-6630（2017）21-0308-05

費鵬, 楊同香, 姜亦超, 等. 克羅諾桿菌分型技術研究進展[J]. 食品科學, 2017, 38(21): 308-312.

10.7506/spkx1002-6630-201721048. http://www.spkx.net.cn

FEI Peng, YANG Tongxiang, JIANG Yichao, et al. Progress in typing methods for Cronobacter spp.[J]. Food Science, 2017,38(21): 308-312. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721048. http://www.spkx.net.cn

2016-08-16

河南科技大學博士科研啟動基金項目（13480066）；河南科技大學青年科學基金項目（2015QN038）

費鵬（1986—），女，講師，博士，研究方向為乳品科學。E-mail：736422337@qq.com

*通信作者：康懷彬（1963—），男，教授，碩士，研究方向為畜產品加工。E-mail：khbin001@163.com Stephen James Forsythe（1958—），男，教授，博士，研究方向為致病菌微生物及遺傳多樣性。E-mail：stephen.forsythe@ntu.ac.uk