肉制品致病菌多重PCR快速檢測(cè)技術(shù)研究

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肉制品致病菌多重PCR快速檢測(cè)技術(shù)研究

肉類(lèi)工業(yè)是我國(guó)第一大食品產(chǎn)業(yè)，關(guān)系國(guó)計(jì)民生。肉制品營(yíng)養(yǎng)豐富，在加工、包裝、儲(chǔ)藏等過(guò)程中極易受致病性微生物的污染，從而引發(fā)肉品安全問(wèn)題。沙門(mén)氏菌、小腸耶爾森氏菌和大腸桿菌O157：H7是常見(jiàn)的引起肉制品污染的重要致病菌。近年來(lái)興起的PCR技術(shù)以其特異性強(qiáng)、敏感性好，方便、快速等優(yōu)點(diǎn)逐漸應(yīng)用于食品檢驗(yàn)領(lǐng)域。但PCR方法每次試驗(yàn)只能特異性的檢測(cè)一種病原菌，而實(shí)際樣品中往往存在種類(lèi)繁多的病原細(xì)菌，涉及不同種和型別。多重PCR是在普通PCR基礎(chǔ)上針對(duì)這一不足改進(jìn)并發(fā)展起來(lái)的，在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)完成多個(gè)基因擴(kuò)增的一種快捷檢測(cè)方法。

中國(guó)專(zhuān)利CN201310191453.2公開(kāi)了一種豬肉中5種主要致病菌五重PCR快速檢測(cè)方法。該方法是先提取待測(cè)肉樣中總細(xì)菌DNA，然后合成SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.12所示引物；進(jìn)行五重PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖進(jìn)行電泳分析，根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行判斷。用該發(fā)明方法檢測(cè)豬肉中種食源性致病菌(沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和大腸桿菌O157:H7)的最低檢測(cè)限分別為142、51、9、33 cfu/mL和670 cfu/mL，適合食品行業(yè)對(duì)大批量豬肉及豬肉產(chǎn)品在銷(xiāo)售過(guò)程中致病菌的日常安全監(jiān)測(cè)。CN201410532170.4公開(kāi)了一種牛肉中3種主要致病菌多重PCR檢測(cè)方法，該方法包括：沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157：H7的菌株培養(yǎng)；不同增菌液對(duì)3種致病菌的增菌效果對(duì)比；選擇引物；多重PCR擴(kuò)增體系；提取待測(cè)牛肉樣品中細(xì)菌的DNA；建立多重PCR反應(yīng)體系參數(shù)。該發(fā)明的3種主要致病菌多重PCR檢測(cè)方法，不僅保留了常規(guī)PCR的高特異性、敏感性，又減少了操作步驟，實(shí)現(xiàn)了一次擴(kuò)增可同時(shí)檢測(cè)多種微生物的目的，大大節(jié)省了時(shí)間，節(jié)約了經(jīng)費(fèi)開(kāi)支。CN201210130290.2公開(kāi)了同時(shí)檢測(cè)多種水產(chǎn)品致病菌的熒光定量PCR引物和探針及檢測(cè)方法。所述的熒光定量PCR引物和探針共有5組，可以分別檢測(cè)沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、福氏志賀氏菌和非O1群霍亂弧菌，除單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌基因2組的引物和探針不能同時(shí)使用外，其他任意2組或2組以上組合，均可以同時(shí)檢測(cè)相應(yīng)引物和探針對(duì)應(yīng)能檢測(cè)出的致病菌。該發(fā)明同時(shí)公開(kāi)了一種利用上述各引物對(duì)和探針建立的多重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增體系，可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出待檢樣品中是否有相應(yīng)致病菌，操作方便快捷，且特異性高，不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，可以做成試劑盒等，在農(nóng)副產(chǎn)品致病菌檢測(cè)中非常適用。李新福等（2017）針對(duì)低溫肉制品中較易污染的沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌等有害微生物，利用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(m-PCR)的方法，對(duì)3種菌同時(shí)快速檢測(cè)，從而達(dá)到節(jié)省時(shí)間，提高效率的目的。使用沙門(mén)氏菌的invA基因、金黃色葡萄球菌的Prf4基因和單增李斯特菌nuc基因設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，在確定特異性引物的基礎(chǔ)上，將3種菌進(jìn)行培養(yǎng)增菌后接種于低溫肉制品中，過(guò)夜富集后收集并進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系并應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。結(jié)果表明：多重PCR方法在同時(shí)檢測(cè)這3種有害微生物時(shí),m-PCR最佳反應(yīng)條件如下:25 μL反應(yīng)體系、10×PCR緩沖液2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、2.5 U/μL 的 DNA 聚合酶 0.5 μL 及上、下游引物各 0.5 μL、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的模板 1.0 μL、沙門(mén)氏菌的模板2.0 μL,加ddH2O補(bǔ)足至25 μL,最佳退火溫度為64℃。胡瑞麗等（2015）根據(jù)單核增生李斯特菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7的特異性序列分別設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，建立了一種快速檢測(cè)上述4種常見(jiàn)食源性致病菌的多重PCR方法，并對(duì)反應(yīng)體系中的模板、引物、rTaq酶、MgSO4添加量以及退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示：4對(duì)引物序列的特異性均較好，利用單重PCR對(duì)4種致病菌的靈敏度進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)限均達(dá)到103copies/mL。多重 PCR同時(shí)檢測(cè)4種致病菌的靈敏度為103copies/mL，對(duì)人工污染豬肉中的4種致病菌的靈敏度檢測(cè)為103cfu/mL。該檢測(cè)方法不與其他菌產(chǎn)生交叉反應(yīng)，與傳統(tǒng)方法相比大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，并提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

食源性致病菌導(dǎo)致的疾病和食品污染已成為世界衛(wèi)生問(wèn)題。研究建立高效、精確、特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于食品安全和人體健康具有重要的作用，具有很好的實(shí)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景，可在食品檢測(cè)領(lǐng)域大力推廣。

（江南大學(xué)圖書(shū)館 張群）