對乙酰氨基酚通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α信號通路影響HepaRG細胞線粒體新生

張廷芬，郭家彬，彭 輝，張 麗，袁海濤，殷 健，崔 嵐，趙 君，彭雙清

（軍事醫學科學院疾病預防控制所毒理學評價研究中心，北京 100071）

對乙酰氨基酚通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α信號通路影響HepaRG細胞線粒體新生

張廷芬，郭家彬，彭 輝，張 麗，袁海濤，殷 健，崔 嵐，趙 君，彭雙清

（軍事醫學科學院疾病預防控制所毒理學評價研究中心，北京 100071）

目的 探討對乙酰氨基酚（APAP）對HepaRG細胞過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（PGC-1α）信號通路介導的線粒體新生的影響。方法 接種HepaRG細胞并給予生長培養基，待細胞長滿后，替換為分化培養基進行誘導分化，每天觀察細胞形態并拍照。APAP（0.125，0.25，0.5，1，2，4，8和12 mmol·L-1）處理誘導分化后的HepaRG細胞24和48 h，MTT法測定細胞存活率。Western蛋白印跡法檢測細胞線粒體新生相關蛋白PGC-1α、核呼吸因子2（NRF-2）和線粒體轉錄因子A（TFAM），以及線粒體構成蛋白NADH脫氫酶亞基1（ND-1）的表達。結果 誘導分化后顯微鏡下可見肝細胞樣和膽管細胞樣2種形態的細胞。與正常對照組相比，APAP作用24和48 h后，隨APAP濃度的增加，細胞存活率不斷降低，其IC50分別5.64和2.65 mmol·L-1。與正常對照組相比，APAP作用24 h，0.5，1，2和4 mmol·L-1組PGC-1α表達水平顯著增加（P＜0.01），8 mmol·L-1組顯著降低（P＜0.01）；0.5 mmol·L-1組NRF-2表達水平顯著增加（P＜0.05），2，4和8 mmol·L-1組顯著降低（P＜0.01）；1 mmol·L-1組TFAM表達水平顯著增加（P＜0.05），4和8 mmol·L-1組顯著降低（P＜0.01）；0.5，1，2和4 mmol·L-1組ND-1表達水平顯著增加（P＜0.01），8 mmol·L-1組顯著降低（P＜0.01）。結論 APAP可誘導或抑制HepaRG細胞的線粒體新生，其機制可能與PGC-1α通路蛋白表達有關。

對乙酰氨基酚；線粒體；HepaRG細胞；過氧化物酶體增殖物激活受體γ；共激活因子1α；肝毒性

對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是一種在臨床上廣泛使用的解熱鎮痛非甾體抗炎藥。在治療劑量時較為安全，但過量使用，則有可能引起急性肝功能衰竭（acute liver injury，AILD），甚至死亡［1］。目前的研究顯示，線粒體是APAP引起肝毒性的重要靶標之一，其毒性機制是APAP經細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶代謝產生有毒的中間代謝產物N-乙酰-對苯醌亞胺（N-acetyl-p-benzoquinone imine，NAPQI）。正常情況下，NAPQI可被谷胱甘肽（glutathione，GSH）脫毒，但當NAPQI過量GSH被消耗殆盡后，NAPQI將與細胞的蛋白質結合，包括多種線粒體蛋白，從而擾亂線粒體功能，引起細胞毒性［2］。

線粒體新生，又稱線粒體生物合成，過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator 1α，PGC-1α）是該過程的主要調節因子，可與下游核呼吸因子1/2（nuclear respiratory factor-1/2，NRF-1/ 2）結合，然后共激活線粒體轉錄因子A（mitochon?drial transcription factor A，TFAM），從而介導線粒體新生［3］。PGC-1α主要分布在能量需求大的組織或器官。正常生理狀態下，生理性地調控線粒體的數量或形態；而在外界刺激下，線粒體新生可能會被激發，對線粒體損傷進行修復，或對線粒體丟失（例如線粒體自噬）進行數量補充，從而減輕外界因素引起的線粒體功能障礙［4］。PGC-1α介導的線粒體新生在骨骼肌、心和肝組織均有報道［5-6］。

HepaRG細胞是從肝癌患者的非瘤肝組織分離而得的細胞株。誘導分化后的HepaRG細胞，具有成熟肝細胞的表型，含有豐富的CYP450酶系，包括CYP1A2，CYP2B6，CPY2C，CPY2D6，CYP3A4和二相代謝酶以及肝細胞的特異性蛋白，這些特征都類似原代肝細胞［7--8］。因此，具有原代人肝細胞特征的HepaRG細胞是目前極受關注的肝細胞模型之一。

有研究顯示，高劑量APAP會引起線粒體功能損傷，線粒體自噬雖然可清除受損的線粒體，但是會導致線粒體數量減少，整體的線粒體功能損耗［9］。因此，我們推測PGC-1α介導的線粒體新生可能在此過程中發揮作用，彌補丟失的線粒體數量以及喪失的線粒體功能。Pesce等［10］研究發現，乙酰基肉毒堿可能通過PGC-1α調控線粒體新生，清除因老齡化引起的大鼠肝細胞內功能障礙的線粒體，另外還能降低氧化應激反應，表明線粒體新生在肝細胞中是可以被介導的。因此，本研究以Hep?aRG細胞為模型觀察不同濃度的APAP作用下，線粒體新生信號通路和線粒體呼吸鏈蛋白的表達水平，進而分析APAP對PGC-1α信號通路和線粒體新生的影響，探討PGC-1α在APAP引起的肝細胞線粒體毒性中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

HepaRG細胞及基礎培養液（MIL700）、生長添加劑（ADD710）和分化添加劑（ADD720）（法國Biopredic公司）。MTT（美國Sigma-Aldrich）。一抗包括PGC-1α（1∶200）和NRF-2（美國Santa Cruz，1：250），β肌動蛋白（英國Abcam，1∶3000），TFAM（1∶3000），NADH脫氫酶亞基1（NADH de?hydrogenase subunit 1，ND-1）（美國Proteintech Group，1∶1000），HRP標記的二抗羊抗兔或羊抗小鼠（Abcam，1∶5000）。RIPA細胞裂解液、蛋白酶抑制劑cocktail、蛋白質定量試劑盒、超敏發光液（北京普利萊有限公司）。配制蛋白電泳緩沖液和轉移緩沖液的試劑（國藥集團化學試劑有限公司和Sigma公司），配制各種液體所用的水均為純水儀（美國Milipore，MilliQ）過濾的超純水。電泳儀（美國Bio-Rad），化學發光成像系統（上海天能科技有限公司，Tanon-5200），5417R臺式冷凍離心機（德國Ep?pendorf），CR3i高速冷凍離心機（美國Thermo），CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus），JJT-1300超凈工作臺（北京亞泰科隆儀器技術有限公司），MCO-18AIC細胞培養箱（日本Sanyo），MK3多功能酶標儀（美國Thermo）。

1.2 HepaRG細胞的誘導分化

根據Biopredic公司提供的細胞培養手冊，在基礎培養基中分別加入ADD710和ADD720配制成生長培養基和分化培養基。按手冊建議以5×108L-1密度接種于75 cm2培養瓶進行傳代HepaRG細胞，培養于生長培養基中，2～3 d換液1次，2周后待細胞長滿培養瓶底時，將生長培養基更換為生長培養基與分化培養基按比例1∶1混合的培養基進行過渡性培養3 d，之后更換為分化培養基，2～3 d換液1次，繼續培養2周，細胞可完成分化。分化后的細胞包含2種形態，直接傳代使用，不進行分離。HepaRG細胞接種后，在倒置顯微鏡下每天觀察1次，并進行拍照。

1.3 MTT法檢測HepaRG細胞存活率

將分化后的HepaRG細胞以2×107L-1的密度接種于96孔板內，培養至細胞融合度達70%～80%，棄舊培養液，分別加入不同濃度的APAP（0.125，0.25，0.5，1，2，4，8和12 mmol·L-1），每孔加入0.2 mL，同時設空白對照組（不接種細胞，只加等體積培養基）和細胞對照組（接種細胞不加APAP），每組設3個復孔，分別作用24和48 h后，吸出APAP染毒液，每孔加入0.1 mL含15%MTT（5 g·L-1）的培養液，作用3 h后吸出培養基，每孔加入0.15 mL DMSO，酶標儀檢測492 nm處每孔吸光度（A），重復3次。細胞存活率（%）=（藥物組A492nm-空白對照組A492nm）/（細胞對照組A492nm-空白對照組A492nm）×100%。用SPSS 17.0軟件“Probit regression”法計算半數抑制濃度值（IC50）。

1.4 Western蛋白印跡法檢測蛋白PGC-1α，NRF-2，TFAM和ND-1表達

將分化后的細胞接種于25 cm2培養瓶，貼壁24 h后暴露于不同濃度的APAP作用24 h。收集細胞，加入RIPA裂解液，并按1∶50加入蛋白酶抑制劑cocktail，收集上清，BCA法測定蛋白濃度。取蛋白樣品30 μg經SDS-PAGE電泳、轉印和封閉后，加入不同抗體后置于4℃過夜反應，洗膜后，與二抗在室溫下反應1 h，再次洗膜后，滴超敏發光液并置于Tanan化學發光成像系統檢測并采集圖像。利用Image J 6.0軟件分析各條帶積分吸光度值（integrated absorbance，IA），以β肌動蛋白條帶IA作參照，進行半定量分析。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 HepaRG細胞的誘導分化

HepaRG細胞增殖周期比一般細胞系長，經歷特定的生長期和分化期后，細胞形態發生顯著變化。第2天鏡下觀察細胞呈細長梭形，約7 d后細胞長滿瓶底，細胞形態逐漸變得飽滿，仍呈梭形，第11天細胞長得十分擁擠，細胞形態呈多樣性。接種14 d后開始誘導分化，分化后第2天，細胞形態并無明顯變化，分化后第6天視野下出現2種形態的細胞，一種體積較小呈圓形為肝細胞樣細胞，一種體積較大呈梭形為膽管樣細胞，分化后第11天，圓形細胞數量增多（圖1）。

Fig.1 Cell morphology of proliferation stage（A）and differentiation stage（B）of HepaRG at different time points（200×）.Cell morphology changed significanthy and finally the bottom became confluent（A）.Cells became more crowded and differentiated into two types of cells：hepatocyte-like（? ）and biliary-like（ → ）cells（B）.

2.2 APAP對HepaRG細胞存活率的影響

APAP（0.125，0.25，0.5，1，2，4，8和12 mmol·L-1）作用于HepaRG細胞24 h后，隨著濃度的升高，細胞存活率從1 mmol·L-1開始出現降低，并呈濃度依賴性降低（r=0.9717，P＜0.05，P＜0.01），IC50為5.64 mmol·L-1；作用48 h后，細胞存活率從0.25 mmol·L-1開始出現降低，并呈濃度依賴性降低（r=0.9512，P＜0.01），IC50為2.65 mmol·L-1（圖2）。

Fig.2 Effect of acetaminophen（APAP）on viability of HepaRG cells by MTT assay.，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding control（0 mmol·L-1）group.

2.3 APAP對HepaRG細胞PGC-1α，NRF-2和TFAM蛋白表達的影響

與正常對照組相比，APAP作用24 h后，0.5，1，2和4 mmol·L-1組PGC-1α的蛋白表達均顯著增加（P＜0.01），8 mmol·L-1組顯著降低（P＜0.01）。0.5 mmol·L-1組NRF-2的蛋白表達顯著升高（P＜0.05），2，4和8 mmol·L-1組顯著降低（P＜0.01）。1 mmol·L-1組TFAM的蛋白表達顯著升高（P＜0.05），4和8 mmol·L-1組顯著降低（P＜0.01）。APAP作用下，PGC-1α信號通路3個蛋白的表達變化總體趨勢一致，在相對低濃度時蛋白表達升高，在相對高濃度時蛋白表達降低。結果提示，APAP能誘導或抑制PGC-1α信號通路蛋白的表達（圖3）。

Fig.3 Effect of APAP on protein expression of peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator 1α（PGC-1α），nuclear respiratory factor 2（NRF-2）and mitochondrial transcription factor A（TFAM）by Western blotting.HepaRG cells were exposed to APAP for 24 h.B was the semi-quantitative result of A.IA：integrated absorbance.，n=3.＊P＜0.01＊＊P＜0.01，compared with corresponding control（0 mmol·L-1）group.

2.4 APAP對HepaRG細胞ND-1蛋白表達的影響

與正常對照組相比，APAP 0.5，1，2和4 mmol·L-1組ND-1蛋白表達均顯著升高（P＜0.01），并隨APAP濃度的升高ND-1蛋白表達的增加逐漸減少，8 mmol·L-1組ND-1蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。提示相對低濃度APAP可促進ND-1蛋白的表達，有助于線粒體呼吸功能的加強；而相對高濃度APAP對ND-1的表達有明顯的抑制作用，對線粒體呼吸作用有抑制作用（圖4）。

Fig.4 Effect of APAP on NADH dehydrogenase sub?unit-1（ND-1）protein expression in HepaRG cells by Western blotting.Cells were exposed to APAP for 24 h. B was the semi-quantitative result of A.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control（0 mmol·L-1）group.

3 討論

本研究結果顯示，HepaRG細胞自然生長時的最初形態呈細長梭形，隨著密度的增長，細胞形態逐漸變圓，仍然保持梭形。當細胞完全長滿培養瓶底后，細胞形態因擠壓呈現多樣性。細胞完全融合7 d后，加入誘導劑分化，在分化后的第6天即可清晰出現2種不同形態的細胞，且有立體感，說明分化成功，而且隨著分化時間的延長，2種細胞的數量逐步達到平衡。與常用的HepG2細胞和Fa2N-4細胞相比［7］，分化后的HepaRG細胞保持了許多原代人肝細胞的重要特征，在化合物代謝、毒性評價很多方面都顯示了突出的優點。由于APAP在CYP450酶的作用下才能代謝成為有毒代謝產物NAPQI，進而與細胞或線粒體蛋白結合，干擾細胞功能，產生毒性作用。本研究選擇誘導分化后的HepaRG細胞作為細胞模型，發現相對低濃度的APAP對Hep?aRG細胞的存活率并沒有顯著影響，而相對高濃度APAP則可引起HepaRG細胞死亡，與臨床上過量APAP引起急性肝細胞壞死相似。

PGC-1α是目前公認的介導線粒體新生的一個關鍵的核轉錄共激活因子，可與NRF-1/2結合，并一同激活TFAM，促進mtDNA的復制和轉錄，調控線粒體的新生。在相對低濃度APAP作用下該通路3種的蛋白表達均升高，提示有線粒體新生的發生。在NRF-2和TFAM出現顯著降低時PGC-1α蛋白表達仍顯著升高，這可能是因為PGC-1α轉錄共激活的下游靶標不僅僅是NRF-2，還有其他核蛋白。在此，PGC-1α不僅參與調控線粒體新生，可能還參與調解其他的應激反應。有文獻報道，PGC-1α可能與NRF2結合，參與調控氧化還原反應，控制APAP引起的氧化應激［11］。NRF-1/2是核呼吸因子，又是轉錄因子，能作用于核基因，負責轉錄線粒體呼吸鏈或是mtDNA復制和翻譯需要的蛋白［12］，例如細胞色素c亞單位和ATP合酶γ亞單位、ATP合酶β亞單位。本研究結果顯示，NRF-2對APAP的毒性作用最為敏感，在1 mmol·L-1時，其蛋白表達便開始下降，但是TFAM的蛋白表達是從2 mmol·L-1開始下降的，可能是因為這個過程中PGC-1α和NRF-1/2共激活TFAM，而本研究僅檢測了NRF-2，TFAM的蛋白表達可能更多受NRF-1調控。

ND-1是呼吸鏈復合物I（NADH脫氫酶）11個亞單位之一，是由mtDNA編碼的蛋白，呼吸鏈復合物I主要是負責催化酶和呼吸鏈質子泵酶的活性［13］。本研究結果顯示，在相對低濃度時，ND-1蛋白表達升高，提示APAP對線粒體呼吸功能有影響，ND-1蛋白表達量變化間接反映了線粒體新生的發生，而ND-1蛋白水平變化趨勢與PGC-1α信號通路的蛋白水平變化趨勢一致，從側面進一步證明了PGC-1α確實參與了線粒體新生。

本研究結果顯示，在相對低濃度APAP作用下線粒體新生被激發，呈適應性反應，通過線粒體的新生為細胞提供更多能量，從而防御APAP可能產生的線粒體毒性作用，而不是我們推測的線粒體新生可能會發生在過量APAP引起線粒體損傷后發揮修復作用，通過線粒體新生補充線粒體數量從而減輕APAP的毒性作用。與我們的假設不一致，在相對高濃度時線粒體新生是被抑制的，猜測線粒體可能通過其他方式維持線粒體功能，如線粒體分裂，但需要進一步證明。

本研究成功地完成了對新引入的HepaRG細胞的培養、傳代和分化。APAP能誘導或抑制Hep?aRG細胞的線粒體新生，PGC-1α信號通路在此過程中發揮了關鍵的調控作用，可能成為干預APAP所致肝細胞線粒體毒性的一個潛在作用靶點。

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Effect of acetaminophen on mitochondrial biogenesis via PGC-1α pathway in HepaRG cells

ZHANG Ting-fen,GUO Jia-bin,PENG Hui,ZHANG Li,YUAN Hai-tao,YIN Jian, CUI Lan,ZHAO Jun,PENG Shuang-qing
(Evaluation and Research Center for Toxicology,Institute of Disease Prevention and Control, Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071,China)

OBJECTIVE To observe the effect of acetaminophen(APAP)on mitochondrial biogenesis regulated by peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator 1α(PGC-1α)pathway in HepaRGcells.METHODS HepaRG cells were seeded and cultured with growth medium,which was replaced by differential medium after confluence.The morphology of cells was daily observed and photographed. Cell viability was tested using MTT method after cells were exposed to APAP 0.125,0.25,0.5,1,2,4,8 and 12 mmol·L-1for 24 and 48 h,respectively.Protein expression of PGC-1α,nuclear respiratory factor-2 (NRF-2),mitochondrial transcription factor A(TFAM)pathway and subunit NADH dehydrogenase subunit1(ND-1)of mitochondrial respiratory chain complexⅠwas detected by Western blotting after exposure at different concentrations for 24 h.RESULTS Two types of cells,hepatocyte-like and biliarylike cells,were observed by microscopy.Compared with normal control,cell viability at 24 h and 48 h was inhibited in a concentration-dependent manner.IC50was 5.64 and 2.65 mmol·L-1,respectively.After 24 h exposure,protein expression of PGC-1α increased significantly(P＜0.01)in APAP 0.5,1,2 and 4 mmol·L-1groups,but decreased significantly(P＜0.01)in 8 mmol·L-1group.Protein expression of NRF-2 increased significantly(P＜0.05)in 0.5 mmol·L-1groups but decreased significantly(P＜0.01)in 2,4 and 8 mmol·L-1groups.Protein expression of TFAM increased significantly(P＜0.05)in 1 mmol·L-1group,but decreased significantly(P＜0.01)in 4 and 8 mmol·L-1groups.Protein expression of ND-1 increased significantly(P＜0.01)in 0.5,1,2 and 4 mmol·L-1groups but decreased significantly(P＜0.01) in 8 mmol·L-1group.CONCLUSION APAP can induce or inhibit mitochondrial biogenesis,which is possibly regulated by PGC-1α pathway in successfully differentiated HepaRG cells.

acetaminophen;mitochondrial;HepaRG cells;peroxisome proliferator activated recep?tor-γ;coactivator 1α;hepatotoxicity

PENG Shuang-qing,E-mail:pengsq@hotmail.com,Tel:(010)66948462

R966

A

1000-3002-（2017）02-0145-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.02.04

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(81302864);and Unilever International Collaborative Support(CH-2011-1318)

2016-03-03 接受日期：2017-01-16）

（本文編輯：沈海南 喬 虹）

國家自然科學基金青年科學基金（81302864）；聯合利華國際合作項目（CH-2011-1318）

張廷芬，女，碩士，助理研究員，從事藥物毒理與安全性評價；彭雙清，男，博士，研究員，博士生導師，主要從事食品與藥品的安全性評價。

彭雙清，E-mail：pengsq@hotmail.com，Tel：（010）66948462