白介素18在顳下頜關節炎中的作用研究

黃 芳，胡雅琳，姜程今，劉婧芳，何韶衡，李志剛

·論著·

白介素18在顳下頜關節炎中的作用研究

黃 芳1，胡雅琳1，姜程今1，劉婧芳1，何韶衡2*，李志剛3*

目的 探究白介素(IL)-18在顳下頜關節炎中的作用。方法 2015年11月—2016年4月，30只SPF級雄性BALB/c小鼠適應性喂養1周后，采用隨機數字表法分為A、B、C、D、E組，每組6只。B組～E組在第1、21天時分別注射Ⅱ型膠原酶；從第1天開始，A組僅注射0.9%氯化鈉溶液，B組注射0.9%氯化鈉溶液，C組注射IL-18，D組注射IL-18結合蛋白(IL-18BP)，E組注射IL-18、IL-18BP。第25天，采集各組小鼠外周血、組織灌洗液，采用流式細胞術檢測外周血單核細胞/顳下頜關節組織灌洗液巨噬細胞中白介素18受體(IL-18R)陽性表達率，ELISA法檢測外周血血漿/顳下頜關節組織灌洗液上清液中腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β水平。結果 B組、C組小鼠外周血單核細胞中IL-18R陽性表達率大于A組(P<0.05)；C組小鼠外周血單核細胞中IL-18R陽性表達率大于B組、D組、E組(P<0.05)。B組～E組小鼠顳下頜關節組織灌洗液巨噬細胞中IL-18R陽性表達率大于A組(P<0.05)；C組小鼠顳下頜關節組織灌洗液巨噬細胞中IL-18R陽性表達率大于B組、D組、E組(P<0.05)。B組～E組小鼠外周血血漿中TNF-α、IL-1β水平高于A組(P<0.05)；C組小鼠外周血血漿中TNF-α、IL-1β水平高于B組、D組、E組(P<0.05)。B組～E組小鼠顳下頜關節組織灌洗液上清液中TNF-α、IL-1β水平高于A組(P<0.05)；C組小鼠顳下頜關節組織灌洗液上清液中TNF-α、IL-1β水平高于B組、D組、E組(P<0.05)；D組小鼠顳下頜關節組織灌洗液上清液中TNF-α水平低于B組(P<0.05)；E組小鼠顳下頜關節組織灌洗液上清液中TNF-α水平高于D組(P<0.05)。結論 IL-18能通過其受體IL-18R刺激單核細胞/巨噬細胞產生TNF-α與IL-1β等炎性因子，從而參與顳下頜關節炎的發生發展，推測IL-18R可能成為顳下頜關節炎的治療靶點。

顳下頜關節障礙；關節炎；白細胞介素18

黃芳,胡雅琳,姜程今,等.白介素18在顳下頜關節炎中的作用研究[J].中國全科醫學，2017，20(12)：1457-1462.[www.chinagp.net]

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1.JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121000,China

2.AllergyandClinicalImmunologyResearchCentre,theFirstAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121000,China

3.DepartmentofProsthodontics,theSecondAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121000,China

*Correspondingauthor:HEShao-heng,Professor;E-mail:shoahenghe@126.com

LIZhi-gang,Professor;E-mail:ZGLi700103@163.com

骨關節炎是臨床常見病，其能導致各個關節(包括顳下頜關節)劇痛和功能障礙。顳下頜關節炎是顳下頜關節紊亂綜合征的主要亞型之一，多發于20～30歲青壯年，93%的青少年自發性關節炎的早期癥狀可見于顳下頜關節[1]。研究發現，顳下頜關節炎與功能性運動綜合征如張口受限、顳下頜關節移動彈響和下頜非對稱移動存在著某種聯系[2-5]。因此早期診斷和及時治療顳下頜關節炎是至關重要的。

白介素(IL)-18是IL-1超因子家族的一員，是一種促炎性細胞因子，可由巨噬細胞、上皮細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、自然殺傷(NK)細胞和B淋巴細胞分泌，而單核細胞和巨噬細胞為其主要來源細胞[6-8]。IL-18在炎癥發生和免疫應答中有促進作用[6-7]。研究表明，IL-18與多種炎性疾病，包括缺血性再灌注損傷、移植抑制和自體免疫性疾病等有關[9-11]。WANNER等[12]對90例肩部關節炎患者進行研究發現，IL-18水平在骨關節炎的早晚期均升高；李勇等[13]對30例膝關節炎患者的研究發現，IL-18水平的升高促進了炎性因子前列腺素E2(PGE2)水平的升高，參與了骨關節炎的發生發展；GOUDA等[14]提取44例類風濕關節炎患者滑膜液檢測到IL-18在患者體內大量表達并促進干擾素-γ(IFN-γ)的產生。通過以上研究可推測出IL-18與關節炎有密切聯系，但關于IL-18在顳下頜關節炎中的作用目前鮮有研究。白介素18受體(IL-18R)屬于IL-1受體/Toll樣受體(IL-1R/TLR)家族，是由IL-18Rα亞基和IL-18Rβ亞基組成的異質二聚體，其中IL-18Rα亞基直接與IL-18特異性結合。IL-18結合蛋白(IL-18BP)可由單核細胞與巨噬細胞等細胞產生[15]，其通過與IL-18功能性結合，阻斷IL-18與IL-18R的相互作用進而發揮抑制IL-18生理功能的作用[16]。因此，本實驗通過檢測IL-18對單核細胞/巨噬細胞中IL-18R陽性表達率及促炎性細胞因子水平的影響來探究其在顳下頜關節炎中的作用，以期為顳下頜關節炎的臨床治療提供借鑒及新靶點。

Selvester QRS積分系統在評估心肌梗死后心肌瘢痕負荷及預測遠期預后方面具有較高的臨床價值。本研究結果表明，Selvester QRS積分在評估急性STEMI患者再灌注治療后3個月內時，前壁心梗組的積分是逐步下降的，而下壁心梗組的積分則較為穩定，因此，為了得到更準確的評估結果，對于急性前壁心肌梗死患者，可在再灌注治療后3個月后實施，而對下壁心肌梗死的積分評估時間則無明確的限制。由于本研究為單中心研究，入選樣本量相對較小，且多為男性患者，因此研究結果可能存在偏倚，尚有待多中心或大樣本的臨床研究進一步證實。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性BALB/c小鼠30只，8周齡，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，批號：11400700056942。

1.2 實驗藥物 Ⅱ型膠原酶(北京索萊寶科技有限公司，批號：17101-015)；IL-18(R&D Systems，批號：B004-5)；IL-18BP(R&D Systems，批號：122-BP-100)。實驗前稱取Ⅱ型膠原酶1 g，完全溶于500 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制出濃度為2 g/ml的Ⅱ型膠原酶；稱取IL-18、IL-18BP各1 μg，分別溶于1 ml PBS中，得到1 ml(1 μg/ml)原液，分別抽取1 μl原液加入99 μl PBS中，得到100 μl濃度為10 ng/ml的IL-18、IL-18BP，隨用隨配。

1.3 實驗試劑 BV421-CD11b、APC/Cy7-Ly-6c、PE-F4-80、APC/Cy7-CD11c表面抗體(BioLegend)，APC-IL-18R細胞內抗體(R&D Systems)，腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β ELISA試劑盒(北京達科為生物技術有限公司)，TNF-α抗體(Rockland公司)，IL-1β抗體(美國PeproTech公司)。

1.4 實驗儀器 酶標儀、普通臺式離心機、全自動洗板機、-80 ℃冰箱(美國Thermo公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.5 研究方法

1.5.1 小鼠分組及處理 2015年11月—2016年4月，將30只小鼠置于室內溫度為23～28 ℃、相對濕度為60%～75%的環境中，自由攝取標準嚙齒動物的食物和水，適應性喂養1周后，采用隨機數字表法將其分為A、B、C、D、E組，各6只。B組～E組在第1、21天時分別注射Ⅱ型膠原酶100 μl；從第1天開始，A組僅注射0.9%氯化鈉溶液100 μl，B組注射0.9%氯化鈉溶液100 μl，C組注射IL-18 100 μl，D組注射IL-18BP 100 μl，E組注射IL-18、IL-18BP各100 μl；每3 d注射1次。具體操作如下：用2%異氟烷短暫麻醉后，修剪小鼠雙側顳下頜關節區域周圍毛發，注射器針尖透過皮膚向前直達顴弓，然后逐漸向前插入顴弓后下邊緣的下方，最終進入關節腔，注入不同刺激劑，注射速度約為2 μl/s[17]。第25天，B組～E組小鼠表現為明顯的刮擦頭面部及縮頭反應，提示炎癥出現，造模成功[18]。

1.5.2 標本采集

1.5.2.2 組織灌洗液采集 第25天采集小鼠顳下頜關節組織灌洗液200 μl，提取顳下頜關節組織灌洗液上清液，-80 ℃保存備用。

1.5.2.3 流式細胞術(flow cytometry，FCM)檢測外周血單核細胞/顳下頜關節組織灌洗液巨噬細胞中IL-18R陽性表達率 取外周血/顳下頜關節組織灌洗液200 μl，加入BV421-CD11b、APC/Cy7-Ly-6c、PE-F4-80、APC/Cy7-CD11c表面抗體，室溫避光孵育15 min，加入1.5 ml紅細胞裂解液裂解紅細胞，室溫避光孵育12 min，1 200 r/min離心6 min(離心半徑5 cm)，棄上清液；加入1 ml 1×PBS洗掉被裂解過的破碎紅細胞，1 200 r/min離心6 min(離心半徑5 cm)，棄上清液；加入250 μl透膜固定液重懸細胞，4 ℃避光孵育20 min，加入洗液500 μl，洗掉透膜固定液，1 200 r/min離心6 min(離心半徑5 cm)，棄上清液；加入100 μl洗液重懸細胞，加入APC-IL-18R細胞內抗體，4 ℃避光孵育30 min，加入洗液500 μl，1 200 r/min離心6 min(離心半徑5 cm)，棄上清液；加入300 μl 1×PBS重懸細胞沉淀，使細胞混勻，采用流式細胞儀檢測單核細胞/巨噬細胞中IL-18R陽性表達率。實驗獨立重復6次。

1.5.2.4 ELISA法檢測外周血血漿/顳下頜關節組織灌洗液上清液中TNF-α、IL-1β水平 設置標準孔、樣本孔和空白孔(標準孔和空白孔均設1個復孔)，加入100 μl提前稀釋好的標準液與樣本到各對應孔中，輕輕混勻，封板，室溫孵育90 min；洗板3次，加入TNF-α、IL-1β一抗，輕輕混勻，封板，室溫孵育60 min；洗板3次，每孔加入鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶結合一抗抗體，輕輕混勻，封板，室溫孵育30 min；洗板3次，各孔加入顯色液，室溫避光15 min，加入終止液，采用酶標儀檢測450 nm處吸光度。實驗獨立重復6次。

2 結果

2.1 各組小鼠外周血單核細胞中IL-18R陽性表達率比較 5組小鼠外周血單核細胞中IL-18R陽性表達率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。其中B組、C組小鼠外周血單核細胞中IL-18R陽性表達率均大于A組，差異有統計學意義(P<0.05)；C組小鼠外周血單核細胞中IL-18R陽性表達率大于B組、D組、E組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

Table 1 Comparison of positive expression rate of IL-18R in peripheral monocytes of mice among the five groups

組別IL-18R陽性表達率A組0.30±0.06B組4.76±1.39aC組19.14±6.13abD組2.44±0.97cE組2.65±0.80cF值42.01P值<0.001

注：IL-18R=白介素18受體；與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

2.2 各組小鼠顳下頜關節組織灌洗液巨噬細胞中IL-18R陽性表達率比較 5組小鼠顳下頜關節組織灌洗液巨噬細胞中IL-18R陽性表達率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。其中B組～E組小鼠顳下頜關節組織灌洗液巨噬細胞中IL-18R陽性表達率大于A組，差異有統計學意義(P<0.05)；C組小鼠顳下頜關節組織灌洗液巨噬細胞中IL-18R陽性表達率大于B組、D組、E組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

Table 2 Comparison of positive expression rate of IL-18R in macrophages in temporomandibular joint lavage fluid of mice among the five groups

組別IL-18R陽性表達率A組0.19±0.04B組5.00±0.95aC組15.69±1.76abD組4.44±0.68acE組4.78±0.64acF值204.27P值<0.001

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

2.3 各組小鼠外周血血漿中TNF-α、IL-1β水平比較 5組小鼠外周血血漿中TNF-α、IL-1β水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。其中B組～E組小鼠外周血血漿中TNF-α、IL-1β水平高于A組，差異有統計學意義(P<0.05)；C組小鼠外周血血漿中TNF-α、IL-1β水平高于B組、D組、E組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

Table 3 Comparison of levels of TNF-α and IL-1β in peripheral plasma of mice among the five groups

組別TNF-αIL-1βA組26.0±2.84.3±2.5B組71.7±8.0a11.2±2.2aC組141.4±7.6ab23.6±4.9abD組69.3±8.5ac11.8±2.2acE組69.7±3.5ac12.4±1.8acF值239.7733.28P值<0.001<0.001

注：TNF=腫瘤壞死因子，IL=白介素；與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

2.4 各組小鼠顳下頜關節組織灌洗液上清液中TNF-α、IL-1β水平比較 5組小鼠顳下頜關節組織灌洗液上清液中TNF-α、IL-1β水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。其中B組～E組小鼠顳下頜關節組織灌洗液上清液中TNF-α、IL-1β水平高于A組，差異有統計學意義(P<0.05)；C組小鼠顳下頜關節組織灌洗液上清液中TNF-α、IL-1β水平高于B組、D組、E組，差異有統計學意義(P<0.05)；D組小鼠顳下頜關節組織灌洗液上清液中TNF-α水平低于B組，差異有統計學意義(P<0.05)；E組小鼠顳下頜關節組織灌洗液上清液中TNF-α水平高于D組，差異有統計學意義(P<0.05，見表4)。

Table 4 Comparison of levels of TNF-α and IL-1β in liquid supernatant of temporomandibular joint lavage fluid of mice among the five groups

組別TNF-αIL-1βA組25.9±2.54.3±2.4B組138.2±2.5a24.2±3.6aC組250.1±7.0ab68.3±7.8abD組132.1±4.6abc24.2±3.4acE組139.1±2.4acd24.4±3.6acF值2101.76161.03P值<0.001<0.001

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05；與D組比較，dP<0.05

3 討論

近年來越來越多研究顯示，IL-18在炎癥中有重要作用，在骨關節炎如肩關節炎[12]、膝關節炎[13]、類風濕關節炎[14]等中有重要作用。KANEYAMA等[19-20]、SUZUKI等[21]發現，顳下頜關節炎患者的顳下頜關節組織灌洗液中TNF水平升高。BRENNAN等[22]、WATKINS等[23]、DUFF[24]發現，在關節滑膜組織中，TNF可通過破壞軟骨和骨組織、感受器致敏等途徑來促進關節炎的發生發展。NORDAHL等[25-26]、NORTH等[27]發現，與檢測不到IL-1β的慢性關節炎患者相比，可檢測到IL-1β的慢性關節炎患者在X線片上的關節組織改變程度更大。KONTZIAS等[28]發現，IL-18對促炎性細胞因子的產生起到了至關重要的作用。

本研究結果顯示，B組、C組小鼠外周血單核細胞和B組～E組小鼠顳下頜關節組織灌洗液巨噬細胞中IL-18R陽性表達率大于A組，表示Ⅱ型膠原酶可以引起小鼠顳下頜關節炎，造模成功。C組小鼠外周血單核細胞、顳下頜關節組織灌洗液巨噬細胞中IL-18R陽性表達率大于B組、D組、E組，表示IL-18在顳下頜關節炎中起到促進炎癥的作用；E組小鼠外周血單核細胞、顳下頜關節組織灌洗液巨噬細胞中IL-18R陽性表達率與D組無明顯差異，表示IL-18BP預處理小鼠后，即使再有IL-18的刺激也不會使IL-18R表達水平增高。B組、C組小鼠外周血血漿、顳下頜關節組織灌洗液上清液中TNF-α、IL-1β水平高于A組，C組小鼠外周血血漿、顳下頜關節組織灌洗液上清液中TNF-α、IL-1β水平高于B組、D組、E組，提示IL-18在炎癥中起到激活單核細胞、巨噬細胞產生炎癥因子的作用；B組、E組小鼠顳下頜關節組織灌洗液上清液中TNF-α水平高于D組，推測炎癥產生后，即使加入IL-18BP，IL-18BP也未能競爭性結合IL-18，從而使IL-18在炎癥中仍舊起到激活單核細胞/巨噬細胞產生炎性因子的作用。以上結果表示，IL-18不僅是促炎性細胞因子，更通過單核細胞/巨噬細胞上其相應的受體IL-18R激活單核細胞/巨噬細胞，從而產生TNF-α與IL-1β等炎性因子，促進并加快顳下頜關節炎的形成。

顳下頜關節炎是臨床較常見的口腔疾病之一，其總體預后較差。有報道以不同的診斷方法對顳下頜關節炎進行評估發現，顳下頜關節炎在青少年中尤為普遍，而且17%～87%的人群有不同的亞型與分類[29-30]。顳下頜關節炎的治療方法多種多樣，如物理療法、社會心理支持療法、藥物治療、外科手術等。藥物治療包括非甾體抗炎藥(NSAIDs)、皮質類固醇、抗風濕藥物(DMARDs)等，均有療效，但各有不足，如NSAIDs主要對少數嚴重關節炎有效[31]；皮質類固醇的使用目前僅在兔身上做過實驗，還未曾在人及其他動物身上獲取可靠結果[32]；DMARDs也不常應用于顳下頜關節炎的治療。此外，還有地塞米松電離子透入療法(IP)，但會出現短暫性紅斑等不良反應；TNF-α抑制劑可緩解顳下頜關節炎的疼痛，改善口腔功能[33]，但如何根治還鮮有報道。也有醫生采用手術或利用關節刺穿術治療顳下頜關節炎，但手術治療造成的失誤[34]和關節炎晚期[35]使其均不能成為最佳治療方法。本研究結果提示，可以通過特異性抑制或阻斷IL-18，防止其與IL-18R結合，抑制單核細胞/巨噬細胞的激活，下調IL-18等促炎性細胞因子的水平，從而降低炎癥發生率，推測IL-18可作為顳下頜關節炎的治療新靶點。

綜上所述，IL-18能通過其受體IL-18R刺激單核細胞/巨噬細胞產生TNF-α與IL-1β等炎性因子，從而參與顳下頜關節炎的發生發展，推測IL-18R可能成為顳下頜關節炎的治療靶點。本研究為動物實驗，今后應進一步行人體試驗對本研究結果進行驗證與探究；且IL-18是否能通過其他形式刺激炎癥的產生，有待進一步研究。

作者貢獻：黃芳、何韶衡、李志剛進行文章的構思與設計；黃芳進行研究的施行、數據整理、統計學處理、撰寫論文；何韶衡、李志剛進行可行性分析；胡雅琳、姜程今、劉婧芳進行數據收集；何韶衡、李志剛對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。

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(修回日期：崔麗紅)

Role for IL-18 in Temporomandibular Joint Arthritis

HUANGFang1,HUYa-lin1,JIANGCheng-jin1,LIUJing-fang1,HEShao-heng2*,LIZhi-gang3*

Objective To explore the role of interleukin-18 (IL-18) in temporomandibular joint arthritis.Methods This study was conducted from November 2015 to April 2016.After being adaptively fed for 1 week,30 male BALB/c mice (SPF grade) were randomized into 5 groups (group A,group B,group C,group D and group E) with 6 mice in each.Group B,group C,group D and group E were injected collagenase Ⅱ on the 1st and 21st days of intervention,respectively.From the 1st to the 24th days of intervention,group A and group B were injected 0.9% sodium chloride solution,group C,group D and group E were injected IL-18,IL-18 binding protein (IL-18BP),IL-18 and IL-18BP,respectively.On the 25th day of intervention,peripheral blood and temporomandibular joint lavage fluid of mice were collected.The positive expression rates of the interleukin-18 receptor (IL-18R) in monocytes in peripheral blood and macrophages in temporomandibular joint lavage fluid were detected by flow cytometry (FCM).The levels of TNF-α and IL-1β in peripheral plasma/liquid supernatant of temporomandibular joint lavage fluid were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results The positive expression rate of IL-18R in peripheral blood monocytes in group B and group C was significantly higher than that in group A (P<0.05);the positive expression rate of IL-18R in peripheral blood monocytes in group C was significantly higher than that in group B,group D and group E (P<0.05).The positive expression rate of IL-18R in macrophages in temporomandibular joint lavage fluid in group B,group C,group D and group E was higher than that in group A (P<0.05);the positive expression rate of IL-18R in macrophages in temporomandibular joint lavage fluid in group C was higher than that in group B,group D and group E (P<0.05).The levels of TNF-α and IL-1β in peripheral plasma in group B,group C,group D and group E were higher than those in group A (P<0.05);the levels of TNF-α and IL-1β in peripheral plasma in group C were higher than those in group B,group D and group E (P<0.05).The levels of TNF-α and IL-1β in liquid supernatant of temporomandibular joint lavage fluid in group B,group C,group D and group E were higher than those in group A (P<0.05);the levels of TNF-α and IL-1β in liquid supernatant of temporomandibular joint lavage fluid in group C were higher than those in group B,group D and group E (P<0.05);the level of TNF-α in liquid supernatant of temporomandibular joint lavage fluid in group D was lower than that in group B (P<0.05);the level of TNF-α in liquid supernatant of temporomandibular joint lavage fluid in group E was higher than that in group D (P<0.05).Conclusion IL-18 can produce pro-inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-1β which may play an important role in the occurrence and development of temporomandibular joint arthritis through IL-18R stimulating monocytes/macrophages.IL-18R may be a novel therapy target for temporomandibular joint arthritis.

Temporomandibular joint disorders;Arthritis;Interleukin-18

國家自然科學基金資助項目(81471592)

R 782.6

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.12.010

2016-09-12；

2016-12-30)

1.121000 遼寧省錦州市，錦州醫科大學

2.121000 遼寧省錦州市，錦州醫科大學附屬第一醫院變態反應與臨床免疫研究中心

3.121000 遼寧省錦州市，錦州醫科大學附屬第二醫院修復科

*通信作者：何韶衡，教授；E-mail： shoahenghe@126.com

李志剛，教授；E-mail：ZGLi700103@163.com