甘氨酸-氟硼熒近紅外熒光分子探針的合成及性能測試

董　雪，張　杰，王坤朋，方　碩，劉　洋，孟舒獻(xiàn)*，馮亞青

(1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072； 2.天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072；3.天津力生制藥股份有限公司，天津 300111； 4.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院PET中心，杭州 310009)

惡性腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康的多發(fā)疾病，已經(jīng)成為人類死亡的主要原因之一。早期的腫瘤顯像有助于減少無益的有創(chuàng)手術(shù)和治療方案的確定，而早期的腫瘤顯像的實現(xiàn)主要歸功于分子影像學(xué)的發(fā)展。分子影像學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)是分子探針的制備和應(yīng)用。其中以近紅外(near-infrared, NIR)熒光探針為主的光學(xué)分子探針發(fā)展尤為迅速[1]。其具有非離子低能量輻射、高通量成像、不同光譜特征、可連續(xù)實時監(jiān)測、無創(chuàng)性或微創(chuàng)性、設(shè)備價格相對廉價等優(yōu)勢。

設(shè)計和合成近紅外熒光染料是熒光探針的核心內(nèi)容。而氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川類化合物氟硼熒(Boradiazaindacenes difluoro-bora-dipyrro-methenes, 簡稱BODIPY)類化合物因其母體結(jié)構(gòu)是共軛平面結(jié)構(gòu)，具有良好的光穩(wěn)定性、較高的摩爾消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率，能廣泛應(yīng)用于金屬離子的檢測[2-10]、pH值測試[11-13]、敏化染料太陽能電池[14-17]等諸多領(lǐng)域。同時由于其具有結(jié)構(gòu)易于修飾、發(fā)射波長可調(diào)變到近紅外光譜范圍(大于700 nm)，不易受環(huán)境影響等獨特的性能在分子影像學(xué)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[18-19]。

本研究首先以氟硼二吡咯烷(BOD)為起始原料，通過縮合反應(yīng)以反式的雙鍵作為連接橋，將兩個N-苯基亞胺基二芐引入到氟硼熒中的吡咯環(huán)中，得到了熒光發(fā)射光譜處于近紅外區(qū)域的熒光染料——IDB-BDP，接著用N-羥基琥珀酰亞胺為活化試劑，將具有羧基的IDB-BDP染料與甘氨酸甲酯反應(yīng)連接在一起，得到了具有腫瘤細(xì)胞親和性的近紅外熒光分子探針——IDB-gan。最后，將得到IDB-2和IDB-gan進(jìn)行光學(xué)性能和生物學(xué)性能測試，并將試驗結(jié)果進(jìn)行了比較分析。實驗結(jié)果顯示：含有甘氨酸甲酯基團(tuán)的氟硼熒化合物IDB-gan與肺癌細(xì)胞具有較好親和力，數(shù)值達(dá)到23.65。

1　實驗部分

1.1　試劑與儀器

實驗所用試劑：二氯二氰基苯醌(DDQ)、三氟乙酸、三乙胺、三氟化硼乙醚、冰醋酸、氫氧化鈉、對醛基苯甲酸甲酯來自天津光復(fù)試劑有限公司，均為分析純；2,4-二甲基吡咯來自浙江清泉化工廠為化學(xué)純；哌啶、苯、無水甲醇、無水乙醇來自天津杰爾正公司，均為分析純。

實驗所用儀器：Bruker AVANCE III 400M核磁共振儀；基質(zhì)輔助激光解吸附-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(Bruker Autoflex tof/tof III)；Shimadzu UV-1800紫外-可見分光光度計；Varian Cary Eclipse型熒光分光光度計；倒置熒光顯微鏡；流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)。

1.2　氟硼吡咯化合物的合成與表征

原料8-對甲氧羰基苯基-1,3,5,7-四甲基二吡咯烯氟硼化合物(BOD)按照本實驗室方法[20]合成。

1.2.13,5-二(4-二苯基亞胺基苯乙烯基)-8-對甲氧羰基苯基-1,7-二甲基二吡咯烯氟硼化合物IDB-BDP的合成

將20.0 mg (52.4 μmol) BOD和39.1 mg (157.0 μmol, 2.5 eq.) IDB-CHO溶于10 mL苯，向溶液中加入0.1 mL(1.0 mmol)哌啶和0.1 mL(1.7 mmol)冰醋酸。磁力攪拌下，在90 ℃油浴中進(jìn)行回流反應(yīng)，TLC分析，直至原料反應(yīng)完，柱層析分離得到IDB-BDP。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ8.15 (d,J=8.3 Hz, 2H), 7.54～7.32 (m, 12H), 7.30～7.27 (m, 6H), 7.13 (d,J=16.2 Hz, 2H), 6.63～6.53 (m, 6H), 3.97 (s, 3H), 3.01 (s, 8H), 1.38 (s, 6H)。MALDI Tof:m/z；理論值C63H51BF2N4O2944.41，實驗值944.81。

1.2.23,5-二(4-二苯基亞胺基苯乙烯基)-8-對羧基苯基-1,7-二甲基二吡咯烯氟硼化合物IDB-2的合成

向25 mL圓底燒瓶中加入10.0 mg (10.6 μmol) IDB-BDP、12.7 mg (317.8 μmol, 30 eq.)氫氧化鈉、12 mL無水乙醇和2 mL水。磁力攪拌下，在80 ℃油浴中進(jìn)行回流反應(yīng)，TLC分析監(jiān)測，直至原料點消失。稀鹽酸水洗反應(yīng)液，氯仿萃取，進(jìn)行柱層析分離，得到IDB-2。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ8.20 (d,J=8.3 Hz, 2H), 7.57～7.32 (m, 13H), 7.28 (dd,J=9.3, 4.0 Hz, 7H), 7.14 (d,J=16.1 Hz, 2H), 6.65～6.53 (m, 6H), 3.01 (s, 8H), 1.39 (s, 6H)。MALDI Tof:m/z；理論值 C62H49BF2N4O2930.39，實驗值 930.79。

1.2.33,5-二(4-二苯基亞胺基苯乙烯基)-8-對(氮-甲氧羰基乙基)氨基甲酰基苯基-1,7-二甲基二吡咯烯氟硼化合物IDB-gan的合成

向25 mL圓底燒瓶中加入10.0 mg IDB-2、2.0 mg (1.5 eq)氮-羥基琥珀酰亞胺，2.8 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、3 mL DMF，常溫攪拌12 h，水洗、二氯甲烷萃取，柱層析分離。稱取5 mg上述產(chǎn)物于10 mL圓底燒瓶中，加入1.7 mg (4 eq.)甘氨酸甲酯，0.1 mL三乙胺，2 mL DMF，室溫攪拌12 h。經(jīng)水洗、二氯甲烷萃取。柱層析分離，得到IDB-gan。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.94 (d,J=8.1 Hz, 2H), 7.43 (m, 12H), 7.31～7.27 (m, 6H), 7.13 (d,J=16.3 Hz, 2H), 6.63～ 6.51 (m, 6H), 4.29 (d,J=4.9 Hz, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.01(s, 8H)，1.38 (s, 6H)。C65H54BF2N5O3理論值1 001.43，實驗值1 003.75。

圖1　化合物IDB-2、IDB-gan的合成路線Fig.1　Synthesis of IDB-2 and IDB-gan

1.3　光學(xué)性能測試

1.3.1紫外-可見吸收光譜(UV-Vis)測試

所有待測樣品均以二氯甲烷為溶劑，配制成濃度為3.0×10-6mol/L的溶液，用紫外-可見分光光度儀測試樣品的紫外-可見吸收光譜，掃描的波長范圍設(shè)定為300～800 nm，間隔為0.2 nm。

1.3.2穩(wěn)態(tài)熒光光譜測試

所有待測樣品均以二氯甲烷為溶劑，配制成濃度為3.0×10-6mol/L的溶液，用熒光分光光度計測試樣品的熒光光譜。

1.3.3熒光量子產(chǎn)率的測試

所有待測樣品均以二氯甲烷為溶劑，配制5種不同濃度(0，3.0×10-7，6.0×10-7，9.0×10-7，1.2×10-6mol/L)的溶液，用紫外-可見分光光度儀測試樣品的紫外-可見吸收光譜，用熒光分光光度計測試樣品的穩(wěn)態(tài)熒光光譜并計算其積分面積。以紫外吸收強度為橫坐標(biāo)，以熒光積分面積為縱坐標(biāo)作圖，計算其斜率，按公式(1)[21]計算。

(1)

式(1)中，下標(biāo)s代表標(biāo)準(zhǔn)樣品，x代表待測樣品。φ代表量子產(chǎn)率，η代表溶劑折射率，Grad代表用紫外吸收強度-熒光積分面積作圖的斜率。

1.3.4熒光壽命的測試

熒光壽命是在瞬態(tài)熒光測試系統(tǒng)測試的。測試用的為液體樣品。溶劑為二氯甲烷，濃度為3×10-6mol/L。

1.4　生物學(xué)性能測試

1.4.1細(xì)胞的培養(yǎng)

本研究中使用的細(xì)胞為肺癌細(xì)胞GLC-82。肺癌細(xì)胞GLC-82的培養(yǎng)液(45 mL RPMI-1640+5 mLNBS血清+0.5 mL雙抗)。

細(xì)胞培養(yǎng)箱條件：飽和濕度，二氧化碳濃度為5%，溫度為 37 ℃。

1.4.2熒光顯微鏡實驗

將加入探針的細(xì)胞進(jìn)行熒光顯微鏡實驗考察探針的特異性。

分別使用IDB-2、IDB-gan對GLC-82細(xì)胞進(jìn)行染色后熒光顯微鏡成像。步驟如下：取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，加入1 mL經(jīng)37 ℃水浴槽預(yù)熱的胰蛋白酶溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中2～3 min消化細(xì)胞。然后加入2～3 mL培養(yǎng)基，中止胰酶的消化作用，吹打成單細(xì)胞懸液，分別使用IDB-2、IDB-gan(濃度10-6mol/L)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞1 h，然后用PBS緩沖溶液沖洗3次，目的是為了洗掉殘存的探針。然后在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行成像。

1.4.3流式細(xì)胞實驗

將探針培養(yǎng)過的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞實驗可以考察探針的親和力大小。

取生長旺盛的GLC-82細(xì)胞(對數(shù)生長期)，吸棄培養(yǎng)液，用3 mL PBS洗滌后吸棄PBS，加入1 mL經(jīng)37 ℃水浴槽預(yù)熱的胰蛋白酶溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中2～3 min消化細(xì)胞。然后加入2～3 mL培養(yǎng)基，中止胰酶的消化作用，吹打分散細(xì)胞，移入離心管中，800 r/min離心3 min，吸棄上清液。加2～4 mL RPMI-1640，吹打懸浮液均勻分散細(xì)胞，取10 μL細(xì)胞液，用細(xì)胞計數(shù)板計取細(xì)胞數(shù)并計算細(xì)胞總數(shù)。轉(zhuǎn)移細(xì)胞至10 mL離心管中，每管細(xì)胞數(shù)為0.2×106個。然后用探針培養(yǎng)細(xì)胞1 h。然后800 r/min離心5 min，吸棄上清液。然后再用PBS緩沖溶液吹打懸浮液均勻分散細(xì)胞，800 r/min離心5 min。重復(fù)此過程3次。每個離心管中加入0.5 mL PBS緩沖溶液分散均勻細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀逐個檢測。流式細(xì)胞儀器的記錄數(shù)據(jù)用BD FACSDiva軟件分析。

1.4.4iRGD多肽影響實驗

1.4.4.1考察加入iRGD多肽后對熒光顯微鏡成像的影響

步驟同1.4.2，只是在加入IDB-2(或IDB-gan)前先加iRGD(濃度10-4mol/L)1 mL培養(yǎng)1 h。

1.4.4.2考察加入iRGD多肽后對流式細(xì)胞實驗的影響

步驟同1.4.3，只是在加入IDB-2(或IDB-gan)前先加iRGD(濃度10-4mol/L)1 mL培養(yǎng)1 h。

2　結(jié)果與討論

2.1　光學(xué)測試結(jié)果分析

2.1.1紫外-可見吸收光譜(UV-Vis)和穩(wěn)態(tài)熒光光譜測試結(jié)果

圖2和圖3分別為 IDB-2、IDB-gan的紫外-可見吸收光譜和穩(wěn)態(tài)熒光光譜。

圖2　IDB-2、IDB-gan的紫外-可見吸收光譜(3×10-6 mol/L)Fig.2　Absorption spectra of IDB-2 and IDB-gan in CH2Cl2 solution (3×10-6 mol/L)

圖3　IDB-2、IDB-gan的穩(wěn)態(tài)熒光光譜(3×10-6 mol/L)Fig.3　Fluorescence spectra of IDB-2 and IDB-gan in CH2Cl2 solution ((3×10-6 mol/L))

通過圖2可以發(fā)現(xiàn)，化合物IDB-2、IDB-gan最大吸收峰分別為703和702 nm二者沒有明顯的區(qū)別。圖3為氟硼二吡咯化合物IDB-2、IDB-gan的熒光發(fā)射光譜。其發(fā)射波長分別為728和730 nm。這2個化合物結(jié)構(gòu)不同之 處僅在于IDB-gan是在IDB-2的基礎(chǔ)上引入1個甘氨酸，這個氨基酸的結(jié)構(gòu)簡單不足以影響整個分子電子排布情況，所以這2個分子的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜沒有很大區(qū)別。但二者的熒光發(fā)射光譜均超過了700 nm，可有效的避開生物組織中內(nèi)源性物質(zhì)(有氧、無氧血紅蛋白、黑色素、水和膽紅素等)的吸收、散射等對光學(xué)造成的影響(一般在600～650 nm附近)。而在近紅外區(qū)域(700～900 nm)，組織的吸收、散射和自發(fā)熒光背景都比較低，能在動物組織內(nèi)達(dá)到最大穿透深度，并能進(jìn)行深層組織成像，因此IDB-gan具有良好的近紅外光學(xué)性能。

2.1.2熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命的測試結(jié)果

熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命的計算結(jié)果列在表1中。

表1　IDB-2、IDB-gan的熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命的計算結(jié)果

a激發(fā)波長/nm: IDB-2 703, IDB-gan 702。

b以在CH2Cl2溶劑中 5,10,15,20-tetraphenylporphyrin (TPP)為標(biāo)準(zhǔn)(φf=0.11)。

結(jié)果顯示引入氨基酸以后量子產(chǎn)率有所增加，從0.024到0.038。熒光量子產(chǎn)率的數(shù)值越大則化合物的熒光越強，這就表示引入氨基酸增加了IDB-2的熒光強度。而熒光壽命有所降低，從2.62 ns降低到2.48 ns。熒光壽命表示粒子在單線激發(fā)態(tài)下存在的平均時間。熒光壽命越短表示熒光衰減更快一些。因此IDB-gan熒光衰減較快，熒光壽命有所降低。

2.2　生物學(xué)性能測試結(jié)果

2.2.1熒光顯微鏡測試結(jié)果

圖4為IDB-2、IDB-gan的可見光和熒光圖像。

圖4　IDB-2、IDB-gan的可見光和熒光圖像Fig.4　Bright-Field and inverted fluorescence images of IDB-2 and IDB-gan

如圖4所示，A1-A3白色背景的是可見光圖像也就是白光圖像。 B1-B3深色背景的是熒光圖像。相同背景的圖像處理時都采用了相同的比例尺(scale bar)設(shè)定。A1-B1：是單純肺癌細(xì)胞GLC-82的成像結(jié)果；A2-B2：是GLC-82采用IDB-2熒光分子培養(yǎng)后的成像結(jié)果；A3-B3：是GLC-82采用IDB-gan熒光分子培養(yǎng)后的成像結(jié)果。通過對熒光顯微鏡譜圖(圖4)分析可得：加入IDB-2和IDB-gan后，腫瘤細(xì)胞的熒光強度顯著提高，與未添加的肺癌細(xì)胞相比，無論是亮度還是清晰度均明顯改善。而IDB-2和IDB-gan在熒光強度上沒有明顯區(qū)別，說明甘氨酸的引入對于熒光強度沒有顯著影響。

2.2.2流式細(xì)胞結(jié)果

流式細(xì)胞儀是用來檢測探針與肺癌細(xì)胞GLC-82的親和力大小。如圖5所示，Data001是陰性對照，即單純細(xì)胞的流式細(xì)胞圖，Data005是IDB-2培養(yǎng)細(xì)胞后的流式細(xì)胞圖，Data006是IDB-gan培養(yǎng)細(xì)胞后的流式細(xì)胞圖。

圖5　IDB-2、IDB-gan的流式細(xì)胞測試結(jié)果Fig.5　Flow cytometric analysis of IDB-2 and IDB-gan

通過分析流式細(xì)胞數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，引入甘氨酸后探針與肺癌細(xì)胞的親和力增大比較明顯，從4.05增大至23.65。說明引入親和基團(tuán)甘氨酸后，顯著提高了探針與腫瘤細(xì)胞的親和力。

2.2.3iRGD多肽對生物學(xué)的影響

iRGD多肽c(CRGDKGPDC)[22-24]，是一種新型的環(huán)狀多肽，其結(jié)構(gòu)為含有9個氨基酸即半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-賴氨酸-甘氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸組成的環(huán)狀多肽。可以和腫瘤細(xì)胞上特有的整合素和神經(jīng)纖毛蛋白質(zhì)作用，提高細(xì)胞膜的通透性，有利于將藥物或探針引入到細(xì)胞或組織內(nèi)部，提高藥物作用效果或提高探針的成像靈敏度[22]。

2.2.3.1加入iRGD后IDB-2、IDB-gan的熒光顯微鏡成像結(jié)果

加入iRGD后 IDB-2、IDB-gan的可見光和熒光圖像見圖6。

如圖6所示，A1-A3白色背景的是可見光圖像也就是白光圖像。 B1-B3深色背景是熒光圖像。相同背景的圖像處理時都采用了相同的比例尺(scale bar)設(shè)定。A1-B1：是iRGD培養(yǎng)肺癌細(xì)胞GLC-82的成像結(jié)果；A2-B2：是GLC-82先用iRGD培養(yǎng)1 h再用IDB-2熒光分子培養(yǎng)后的成像結(jié)果；A3-B3：是GLC-82先用iRGD培養(yǎng)1 h再用IDB-gan熒光分子培養(yǎng)后的成像結(jié)果。通過對熒光顯微鏡譜圖(圖5)分析可得，加入IDB-2、IDB-gan后腫瘤細(xì)胞與未添加熒光分子的腫瘤細(xì)胞相比都呈現(xiàn)了清晰地的熒光圖像。與2.2.1結(jié)果相同。

圖6　加入iRGD后 IDB-2、IDB-gan的可見光和熒光圖像Fig.6　Bright-Field and inverted fluorescence images of IDB-2 and IDB-gan with iRGD

2.2.3.2加入iRGD后IDB-2、IDB-gan的流式細(xì)胞測試結(jié)果

加入iRGD后IDB-2、IDB-gan的流式細(xì)胞測試結(jié)果如圖7所示。Data009是陰性對照，即經(jīng)過iRGD培養(yǎng)后細(xì)胞的流式細(xì)胞圖，Data013是先經(jīng)過iRGD培養(yǎng)再用IDB-2培養(yǎng)細(xì)胞后的流式細(xì)胞圖，Data014是先經(jīng)過iRGD培養(yǎng)再用IDB-gan培養(yǎng)細(xì)胞后的流式細(xì)胞圖。

圖7　加入iRGD后IDB-2、IDB-gan的流式細(xì)胞測試結(jié)果Fig.7　Flow cytometric analysis of IDB-2 and IDB-gan with iRGD

通過分析流式細(xì)胞數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，IDB-gan與肺癌細(xì)胞的親和力優(yōu)于IDB-2，從1.01增大至2.03。說明引入親和基團(tuán)甘氨酸后，提高了探針與腫瘤細(xì)胞的親和力與2.2.2的趨勢一致。但是可以發(fā)現(xiàn)添加iRGD后，不但沒有明顯提高探針與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合力，反而有所降低。這可能是因為先加入iRGD后，而iRGD易于與腫瘤細(xì)胞膜進(jìn)行特異性結(jié)合，占據(jù)了細(xì)胞膜上的一部分受體，導(dǎo)致后續(xù)加入的探針I(yè)DB-2和IDB-gan沒有足夠多的受體相結(jié)合，說明IDB-2和IDB-gan只是結(jié)合在腫瘤細(xì)胞膜表面，沒有進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部。

因此引入iRGD多肽后，不僅沒有發(fā)揮其穿膜肽的作用，反而與探針發(fā)生競爭作用，阻礙了探針與腫瘤細(xì)胞受體的結(jié)合。但是IDB-2和IDB-gan與肺癌細(xì)胞結(jié)合力大小順序沒有發(fā)生變化，還是具有親和基團(tuán)的IDB-gan親和力明顯大于IDB-2。

3　結(jié)論

首先以氟硼二吡咯烷(BOD)為原料，通過縮合反應(yīng)，將具有強供電子作用的N-苯基亞氨基二芐引入到氟硼熒中，得到了熒光光譜處于近紅外區(qū)的甘氨酸-氟硼熒化合物，其次用N-羥基琥珀酰亞胺為活化劑，將具有生物相容性的甘氨酸甲酯引入到熒光基團(tuán)-氟硼熒(BDDIPY)，最終得到具有生物親和性的甘氨酸-氟硼熒分子熒光探針——IDB-gan。通過光學(xué)測試說明IDB-2和IDB-gan的熒光發(fā)射光譜均超過了700 nm，避免了生物組織中內(nèi)源性物質(zhì)對于光學(xué)的影響。通過生物學(xué)測試尤其是流式細(xì)胞實驗說明IDB-2和IDB-gan均與腫瘤細(xì)胞具有一定親和力，且引入親和基團(tuán)甘氨酸后，顯著提高了探針與腫瘤細(xì)胞的親和力，從4.05提高到23.65。說明IDB-gan與肺癌細(xì)胞具有更好親和力。最后通過添加iRGD多肽試驗說明IDB-2和IDB-gan兩種物質(zhì)結(jié)合到腫瘤細(xì)胞的表面，沒有滲透到細(xì)胞內(nèi)部。通過以上實驗顯示了IDB-gan是一種具有良好應(yīng)用前景的近紅外熒光分子探針。

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