谷胱甘肽高產酵母融合子的制備及發酵工藝

錢衛東, 吳啟航, 劉昱辰, 王 婷, 毛培宏

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 2.西北大學 生命科學學院， 陜西 西安 710069； 3.新疆大學 物理科學學院， 新疆 烏魯木齊 830046)

谷胱甘肽高產酵母融合子的制備及發酵工藝

錢衛東1, 吳啟航1, 劉昱辰1, 王 婷2, 毛培宏3

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 2.西北大學 生命科學學院， 陜西 西安 710069； 3.新疆大學 物理科學學院， 新疆 烏魯木齊 830046)

為構建谷胱甘肽(glutathione，GSH)高產酵母菌株，本實驗利用原生質體融合方法制備多形漢遜酵母和粟酒裂殖酵母融合子，結合自主設計的耐高溫、鉬酸鈉和乙醇耐受性培養基方法高通量篩選酵母融合子，進而利用DTNB法定量測定GSH高產酵母融合子，并分析GSH高產酵母融合子的遺傳穩定性，最后對其發酵工藝進行研究.結果表明，本實驗利用原生質融合方法成功構建一株GSH產量高、遺傳穩定的GSH高產酵母融合子，為低成本、高效生產GSH提供了新途徑.

多形漢遜酵母菌； 粟酒裂殖酵母菌； 原生質體融合； 融合子

0 引言

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的活性三肽，幾乎存在于生物體的所有細胞中，由于半胱氨酸上所具有的活性基團巰基可與重金屬、碘乙酸等毒素相結合，使其具有整合解毒作用，即GSH具有廣譜解毒作用[1]；此外，GSH還具有抗氧化作用，達到延緩機體衰老的功效.因此，GSH在醫藥、保健食品和化妝品等行業有著廣泛的應用[2].

目前，國內GSH的市場需求量日益增多，但我國GSH幾乎完全依賴進口.GSH的生產方法有化學合成法、萃取法、酶法和發酵法[3].其中，發酵生產GSH法因其產量高、生產成本低、易分離、無污染等優點，日益備受國內外學者關注.目前，國外在利用微生物發酵生產GSH的研究水平較高，而國內發酵生產GSH的整體水平與國外相比仍有差距，這歸因于缺乏高質量的菌株發酵生產菌株，因此開發性能優良的GSH高產菌株意義明顯.目前，用于發酵GSH最常用的菌株主要為酵母菌，其中GSH含量較高的為多形漢遜酵母屬、裂殖酵母屬、釀酒酵母屬和假絲酵母屬[4-6].

作為食品級的多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)DL-1因其具有安全性高、培養成本低、耐高溫、生長速度快及易高密度發酵等優點，近年來備受關注.加上遺傳背景清晰、遺傳操作簡單的粟酒裂殖酵母也具備優良的GSH生產能力.因此，如何充分整合兩株酵母GSH生產性能，進而結合兩者清晰的遺傳操作背景開展定向分子改良，將為高效生產GSH提供新思路.為此，本實驗以多形漢遜酵母菌株DL-1和粟酒裂殖酵母為出發菌株，利用細胞融合技術整合兩種酵母優良性能，并結合自主設計的高通量篩選方法，構建GSH高產酵母融合子[7,8].

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha，H.polymorpha)DL-1，源于中國工業微生物保藏中心，保藏號為ATCC No.26012；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe，S.promb)(S.promb2.1794)，購自中國科學院微生物研究所.

1.1.2 試劑及儀器

(1)主要試劑： 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和GSH標準品，來源于Sigma公司；其余試劑均來源于天津市天力化學試劑有限公司；

(2)主要儀器：高速冷凍離心機(sigma)、電熱恒溫培養箱(上海普度實驗設備有限公司)、超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設備公司)、高壓蒸汽滅菌鍋(上海賽默生物科技發展有限公司)、紫外可見分光光度計(上海光譜儀器廠).

1.2 方法

1.2.1 酵母融合子的制備

(1)原生質體的制備

分別取多形漢遜酵母和粟酒裂殖酵母種子液200μL，轉接于10 mLYPD培養基(1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，pH7.2)中，37 ℃和28 ℃，140 r/min，培養16～18 h.取新鮮發酵液1 mL，離心后棄上清液，PBS緩沖液洗滌3次，再加入1 mL預處理液(0.05 mol/L EDTA水溶液0.02 mL、β-巰基乙醇0.02 mL溶于PB緩沖液，定容于20 mL)，搖勻，30 ℃水浴10 min后，離心后棄上清液，PBS緩沖液洗滌3次，再加入1 mL 2.5%的蝸牛酶溶液，搖勻，35 ℃水浴1 h，離心后棄上清液，PBS緩沖液洗滌3次，最后加入1 mL高滲緩沖液(5.2 g KCl溶于PB緩沖液，定容至100 mL)中得原生質體懸液.

(2)原生質體的融合

取兩種原生質體1 mL，紫外滅活3 min，黑暗中保存20 min，將二者混合，2 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入1 mL PEG-CaCl2促融劑(PEG6000 8 g、CaCl20.9 g、β-巰基乙醇0.04 mL溶于PB緩沖液，定容至20 mL)，震蕩搖勻，30 ℃水浴20 min，立即用高滲緩沖液稀釋菌體[9].

(3)融合子的篩選

①生長性能篩選：取融合子懸液0.5 mL，涂布于固體蔗糖高滲培養基(1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，15%蔗糖，2%瓊脂粉，pH7.2)上，37 ℃恒溫培養24 h，隨機挑選生長較快、長勢較好的菌株，37 ℃恒溫培養48 h.

②耐高溫篩選：將基于生長性能篩選獲得的初篩菌株，連同作為陽性對照和陰性對照的多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌，接種于固體蔗糖高滲培養基上，在48 ℃恒溫培養48 h，篩選能耐高溫的菌株，該實驗步驟可達到排除粟酒裂殖酵母，得到酵母融合子和多形漢遜酵母的目的.

③鉬酸鈉和乙醇耐受性篩選：將生長性能良好、耐高溫的融合子，連同作為陰性對照和陽性對照的多形漢遜酵母菌株和粟酒裂殖酵母菌株，將經梯度稀釋后的菌液接種于乙醇(4%)選擇固體培養基中，37 ℃恒溫培養48 h后，轉接在鉬酸鈉(2.5 mmol/L)選擇固體培養基中，37 ℃恒溫培養48 h，可獲得具有鉬酸鈉和乙醇耐受性的融合子，該實驗步驟可實現排除多形漢遜酵母，得到酵母融合子的效果[10,11].

(4)融合子遺傳穩定性

將性能優良的GSH高產融合子，接種到液體YPD培養基中，37 ℃，130 r/min，恒溫培養，每48 h傳一代，連續傳8代，依次對每一代進行GSH含量的檢測[12].

1.2.2 DTNB方法檢測GSH產量

按照參考文獻[13]的方法進行操作，分別取融合子、多形漢遜酵母和粟酒裂殖酵母的新鮮發酵液5 mL，離心得上清液和細胞沉淀.上清液用于測定胞外GSH的含量，細胞用于測定胞內GSH的含量，GSH的總含量為二者之和.

細胞干重測定方法為將發酵液離心后，蒸餾水洗滌2～3次，在85 ℃烘干至恒重，稱重.在新鮮發酵液離心得到的上清液和菌體細胞經破壁處理后得到的上清液中，分別加入1.5 mL 0.06% NaOH和0.5 mL 0.03%甲醛，搖勻，靜止2 min，再加入2.5 mL DTNB分析液(1 mL 0.01 mol/L DTNB溶液與99 ml 0.25 mol/L Tris-Hcl緩沖液混合，pH8.0)，搖勻，25 ℃水浴5 min，測412 nm吸光值.再根據吸光度與GSH濃度的關系計算出樣品中GSH的含量[14].

1.2.3 酵母融合子的發酵工藝

將酵母融合子接種至YPD培養基中，37 ℃，180 r/min培養18h.取對數增長期的酵母液進行GSH含量測定.

(1)發酵條件的優化

在單因素試驗的基礎上，設置正交試驗，確定最佳組合方式.運用極差分析法對試驗數據進行分析處理，確定最佳發酵工藝.選定發酵時間、接種量、碳源(葡萄糖)添加量和氮源(酵母浸粉)添加量為4個考察因素，每個因素分為3個水平，以GSH產量為考察指標，因素水平見表1所示[15].

表1 正交試驗因素水平表

(2)培養溫度

①恒溫發酵試驗:溫度對微生物的生長及其代謝產物合成有明顯影響，本實驗設置不同溫度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、49 ℃)條件下恒溫發酵48 h，每隔6 h取樣一次，測定細胞干重(DCW)及GSH產量.

②變溫發酵試驗:由于高溫條件對菌體具有一定的脅迫作用，可根據恒溫發酵試驗結果，設計變溫條件，以提高GSH產量.

2 結果與討論

2.1 培養溫度酵母融合子的制備

2.1.1 培養溫度高溫篩選

由于裂殖酵母的最高耐受溫度為46 ℃，而漢遜酵母的最高耐受溫度為50 ℃，所以在48 ℃下恒溫培養48 h，可去除粟酒裂殖酵母.如圖1所示，在48 ℃恒溫培養條件下，多形漢遜酵母菌可順利生長且長勢較好，粟酒裂殖酵母菌無法生長，初篩得到的融合子在48 ℃恒溫培養條件下能正常生長.

(a)多形漢遜酵母 (b)粟酒裂殖酵母 (c)初篩得到的融合子圖1 菌體在48 ℃恒溫培養條件下的生長情況

2.1.2 鉬酸鈉和乙醇抗性篩選

如圖2所示，在乙醇和鉬酸鈉選擇固體培養基中，多形漢遜酵母菌和酵母融合子長勢均較好，而粟酒裂殖酵母菌均無法生長，可篩出具有乙醇和鉬酸鈉耐受性的菌株，即可以進一步去除多形漢遜酵母，得到目標GSH高產酵母融合子.

(a)乙醇選擇固體培養基 (b)鉬酸鈉選擇固體培養基圖2 酵母融合子在選擇培養基上的生長情況

2.1.3 DTNB法檢測GSH的含量

由表2可知，DTNB法測得35#和67#酵母融合子的GSH產量均高于多形漢遜酵母出發菌株和粟酒裂殖酵母出發菌株.

表2 融合子的GSH產量

2.1.4 融合子穩定性分析

從以35# GSH高產融合子為發酵菌株，連續傳8代，對每一代進行GSH含量的檢測.由圖3可知，35#菌株的GSH產量下降大致在10%之內，表明該高產菌株遺傳穩定.

圖3 GSH高產融合子遺傳性

2.2 酵母融合子的發酵工藝研究

2.2.1 正交試驗結果

由表3可知，各因素極差順序為RB>RD>RC>RA，影響因子先后順序為接種量>酵母浸粉>葡萄糖>接種時間，各因素最佳組合為A2B2C2D3，即接種時間為18 h，接種量為4%，葡萄糖為30 g/L，酵母浸粉為15 g/L.

表3 L9(34)正交試驗結果

2.2.2 驗證試驗

為了驗證所得試驗結果的準確性，將最佳發酵條件組合A2B2C2D3(接種時間為18 h，接種量為4%，葡萄糖為20 g/L，酵母浸粉為20 g/L)與正交試驗中A1B2C2D2(接種時間為17 h，接種量為4%，葡萄糖為20 g/L，酵母浸粉為15 g/L)進行對比驗證試驗.如表4所示，2種方案對比驗證后發現，在最優發酵條件下所得的GSH產量高于正交試驗中的2號組合，說明經過正交試驗篩選得出的條件組合可信.

表4 對比驗證試驗結果

2.2.3 培養溫度對GSH產量的影響

(1)恒溫發酵試驗

如圖4～5所示，溫度對DCW和GSH產量有著一定的影響.由圖4可見，當培養溫度為30 ℃時，DCW高達到6.2 g/L；從圖5可見，當培養溫度為37 ℃時，GSH產量高達489.6 mg/L.37 ℃時GSH產量相比于30 ℃時提高了3.69倍，但是，其DCW卻下降了56.4%.由此可見，GSH高產酵母融合子的最適生長溫度與發酵生產GSH的溫度不同，表明可通過變溫發酵試驗來提高酵母融合子生物合成GSH的能力.

圖4 溫度對菌體生物量的影響

圖5 溫度對GSH產量的影響

(2)變溫發酵試驗

由于細胞在高溫條件下可受到脅迫作用，且該酵母融合子屬于一種耐高滲酵母，當溫度升高時，細胞脫水形成高滲環境，這為酵母發酵生產應激產物GSH提供了動力.所以，本實驗設計變溫發酵試驗，將酵母融合子在最適生長溫度30 ℃恒溫培養24 h，再升溫至最適發酵溫度37 ℃繼續恒溫培養24 h.此外，將酵母融合子在最適生長溫度30 ℃恒溫培養24 h后，再升溫至脅迫溫度49 ℃恒溫培養18 h，再降溫至最適發酵溫度37 ℃繼續恒溫培養24 h.如表5所示，結果表明兩者變溫發酵策略都可以提高GSH產量.

表5 變溫發酵后的DCW和GSH的產量

3 結論

該融合子是來源于多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌，兩個親本在生理生化方面有著一定的差異，但融合子整合了兩個親本的生長性能.

GSH高產酵母融合子的篩選方法主要為耐高溫篩選和乙醇、鉬酸鈉耐受性篩選.在耐高溫篩選實驗中，由于多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌的最高耐受溫度分別為50 ℃和46 ℃，所以在48 ℃培養時，多形漢遜酵母菌和酵母融合子長勢均較好，而粟酒裂殖酵母菌均無法生長.可排除粟酒裂殖酵母菌的存在，說明在耐高溫特性上，融合子表現出多形漢遜酵母菌特點，而在乙醇和鉬酸鈉耐受性篩選實驗中，粟酒裂殖酵母可順利生長，多形漢遜酵母菌無法生長，從而可排除多形漢遜酵母菌的存在，表明在鉬酸鈉和乙醇耐受性篩選實驗中，融合子表現出粟酒裂殖酵母菌生長特性.

從以上的實驗結果可以看出，35#和67# 融合子是由多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌融合得到的.這表明PEG法融合多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌是行之有效的方法.融合子在生長方面具有多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌的特性，其遺傳物質也來自于兩親本.本實驗結果表明利用原生質體融合方法構建的融合子生產GSH的能

力均強于兩個親本，加上其遺傳背景清晰、遺傳操作簡單的特性，這為后續分子定向改良GSH生產性能提供了實踐依據.

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【責任編輯：蔣亞儒】

Preparation and fermentation process of GSH high-yield yeast fusant

QIAN Wei-dong1， WU Qi-hang1， LIU Yu-chen1, WANG Ting2， MAO Pei-hong3

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi Unversity of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.College of Life Sciences, Northwest University, Xi′an 710069, China; 3.School of Physics and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

To construct glutathione (GSH) high-yield yeast fusant,the fusants were derived from protoplast fusion betweenHansenulapolymorphaandSchizosaccharomycespombeby polyethylene glycol(PEG) fusion method.Based on-high temperature screening was adopted in prescreening,and ethanol and Sodium molybdate culture medium were utilized in second screening.Then GSH content was determined by 5,5′-Dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)(DTNB).Finally,the genetic stability of the glutathione (GSH) high-yield yeast fusants was analyzed.One GSH yeast fusant strain high-yield and genetic stability was constructed.Therefore,a breeding strategy based on the protoplast fusion method would be a valuable alternative to improve glutathione production.

Hansenulapolymorpha；Schizosaccharomycespombe； protoplast fusion； fusant

2016-12-11 基金項目：國家自然科學基金項目(11575149); 陜西省科技廳自然科學基礎研究計劃項目(2016JM3020); 陜西省教育廳專項科研計劃項目(15JK1088)

錢衛東(1980-)，男，安徽蕪湖人，副教授，博士，研究方向：高附加功能性有效成分開發

1000-5811(2017)02-0126-05

R284.1

A