夏枯草多糖及凝膠抗單純皰疹病毒的藥效學研究＊

蔡雙璠，楊揚，吳蓉，楊以阜＊，譚紅勝＊

（1.上海中醫藥大學中藥學院上海201203；2.中藥創新藥物研發上海高校工程研究中心上海201203；3.上海中醫藥大學科技實驗中心上海201203）

夏枯草多糖及凝膠抗單純皰疹病毒的藥效學研究＊

蔡雙璠1，2＊＊，楊揚3＊＊，吳蓉1，2，楊以阜3＊＊＊，譚紅勝1，2＊＊＊

（1.上海中醫藥大學中藥學院上海201203；2.中藥創新藥物研發上海高校工程研究中心上海201203；3.上海中醫藥大學科技實驗中心上海201203）

目的：探究夏枯草多糖及凝膠在體外和體內條件下的抗單純皰疹病毒作用，為抗皰疹病毒新藥研究提供科學依據。方法：本研究采用空斑減數法檢測夏枯草多糖的體外抗單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus，HSV）活性；同時，建立HSV-1（皮膚）和HSV-2（外陰部）病毒感染豚鼠模型，以病灶病變情況、丘皰疹數、典型病變評分結果以及病灶組織中HSV-1和HSV-2病毒的DNA拷貝數等為指標，對夏枯草多糖凝膠的體內抗HSV活性進行評價。結果：夏枯草多糖在體外實驗中能夠抑制HSV-1和HSV-2的活性；夏枯草多糖凝膠能夠削弱HSV-1和HSV-2病毒感染豚鼠的病灶病變，發揮抗單純皰疹病毒活性。結論：夏枯草多糖及凝膠在體外和體內實驗中均具有抗單純皰疹病毒的活性，具有開發成為抗單純皰疹病毒藥物的潛在價值。

夏枯草抗單純皰疹病毒多糖凝膠

夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，因“夏至后即枯”而得名，具有清肝瀉火、明目、散結消腫等功效，用于治療目赤腫痛、目珠夜痛、頭痛眩暈、瘰疬、癭瘤、乳癰、乳癖、乳房脹痛等，民間飲用的歷史已有1 000多年。現代藥理及化學成分研究證明，夏枯草主要含有三萜、黃酮、苯丙素、甾體、有機酸、揮發油及多糖類等成分[1]，具有降血壓、降血糖、抗菌、抗病毒、調節免疫力等生物活性。從夏枯草中分離得到的多糖類成分具有抗Ⅰ型單純性皰疹病毒（HSV-1）和Ⅱ型單純性皰疹病毒（HSV-2）的作用，其作用機制不同于目前臨床藥物阿昔洛韋（Acyclovir，ACV），這些成分可能不是直接作用于病毒的復制環節，而是阻止病毒吸附和穿入宿主細胞，發揮促進淋巴細胞轉化增殖和誘生干擾素等免疫調節作用，因此對標準病毒株和臨床耐藥株均有效，且不易產生耐藥性[2-6]。

本研究采用空斑減數法檢測夏枯草多糖的體外抗HSV活性；同時，建立HSV-1（皮膚）和HSV-2（外陰部）病毒感染豚鼠模型，以病灶病變情況、丘皰疹數、典型病變評分結果以及病灶組織中HSV-1和HSV-2病毒的DNA拷貝數為等指標，對夏枯草多糖凝膠的體內抗HSV活性進行評價，為后續將夏枯草多糖開發成為抗單純皰疹病毒的新藥提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與試藥

細胞培養箱（美國Thermo公司）；CPA2250電子分析天平（德國賽多利斯公司）；Alpha 2-4 LD plus型冷凍干燥機（德國ChRTST公司）；Pellicon XLFILTER超濾盒（美國Millipore公司）。

DMSO、甲醛（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；結晶紫、MTT、臺盼藍（上海生工生物有限公司）；PBS磷酸鹽緩沖鹽（福建邁新試劑生物技術開發有限公司）；DMEM培養基、FBS（美國Invitrogen公司）；青霉素-鏈霉素（杭州吉諾生物有限公司）；阿昔洛韋粉末（中國藥品生物制品檢定所）；阿昔洛韋乳膏（福建太平洋制藥有限公司）；DNA抽提試劑盒、HSV-1和HSV-2核酸擴增（PCR）熒光定量測定試劑盒（中山大學達安基因股份有限公司）；采用超濾技術制備的夏枯草多糖來自上海中醫藥大學中藥創新藥物研發上海高校工程研究中心[7]。

1.2 實驗藥材

夏枯草藥材購于上海康橋中藥飲片有限公司，經上海中醫藥大學中藥學院生藥教研室張紅梅副教授鑒定為唇形科植物夏枯草Prunella Vulgaris L.的干燥果穗。

1.3 細胞株和病毒株

非洲綠猴腎細胞（Vero細胞，美國ATCC公司）；HSV-1 KOS病毒，HSV-2G病毒（美國ATCC公司）。

1.4 實驗動物

白豚鼠，雌性，260-280 g，購自中國科學院上海實驗動物中心，飼養于上海中醫藥大學SPF級動物房（溫度22±1℃，濕度55%±5%，12 h光暗循環；消毒后的飼料和水均由動物自由攝取）。所有動物均嚴格按照國家和上海中醫藥大學動物中心動物實用管理條例進行實驗設計和實施。

2 實驗方法

2.1 夏枯草多糖凝膠的制備

稱取卡波姆940 15 g，分次撒入500mL水中，攪拌，靜置過夜，使其充分溶脹均勻。取夏枯草超濾多糖30 g，加水200 mL，60℃水浴加熱使其溶解，放冷。另取尼泊金乙酯1 g，加入丙二醇80 g，超聲使其溶解后，加至夏枯草多糖水溶液中，再加入甘油100 g，三乙醇胺25 g，攪拌均勻，加至溶脹后的卡波姆中，加純水至1 000 g，攪拌均勻，即得每克含3%多糖的凝膠。

2.2 細胞毒性實驗（MTT法）

將Vero細胞計數后，以2×104/孔接種于96孔板，培養過夜。棄培養液，加入含不同濃度夏枯草超濾多糖（200、100、50、25μg·mL-1）和阿昔洛韋（50、100、200、400μM）的培養液，每濃度3個復孔，每孔200μL，同時設空白對照、未處理細胞對照和溶劑對照（0.1% DMSO）。培養72 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態，吸去培養液，加入MTT，孵育4 h，加入DMSO，在570/ 650 nm波長下測定吸光度（A）。吸光度和細胞毒性率的計算公式如下：

用MicrosoftExcel的預測函數計算每個樣品的半數毒性濃度（Concentrationof50%CellularCytotoxicity，CC50）。

2.3 體外抗皰疹病毒活性測定（空斑減數法）

將Vero細胞計數后，以3×105/孔接種于12孔板，培養過夜。棄培養液，每孔接種病毒原液（HSV-1/ HSV-2）104倍稀釋液0.4mL（約含100 pfu），于37°C吸附1 h，棄病毒液，再加入含不同濃度夏枯草超濾多糖和甲基纖維素的培養液（終濃度200、100、50、25μg·mL-1）。每濃度2個復孔，每孔1mL，同時設正常細胞對照組、病毒對照組、陽性藥物阿昔洛韋對照組（ACV濃度分別是：4、2、1、0.5μM）及DMSO溶劑對照組。培養72 h后，加入3.7%甲醛固定，1%結晶紫染色后，肉眼觀察并數出各孔內的空斑數量，一個透明白點即為一個空斑，計算抑制率，公式如下：

通過SPSS軟件計算夏枯草超濾多糖對HSV-1和HSV-2抑制作用的IC50。一般來說，治療指數（SI）越大，抗病毒活性越好，其計算公式如下：

2.4 HSV-1病毒感染動物模型

將豚鼠隨機分為6組，即正常對照組、溶劑（輔料）對照組、多糖凝膠低劑量組、多糖凝膠中劑量組、多糖凝膠高劑量組和陽性對照（阿昔洛韋乳膏）組，每組12只。

各組豚鼠進行背部脊柱兩側皮膚脫毛處理，暴露背部15 cm2左右的皮膚。用75%乙醇擦洗脫毛部位皮膚去除殘余脫毛劑，待乙醇揮發再用純水擦洗。然后用醫用七星針在皮膚表面叩擊約50次，待皮膚微微滲血，（除正常對照組外）各組每只豚鼠背部涂抹100μL（2×107pfu·mL-1）HSV-1病毒液。夏枯草低、中、高劑量組每天每只給予相應濃度的1鑰匙體積（約500mg）凝膠外涂于豚鼠造模部位，溶劑對照組給予等體積輔料外涂，陽性藥對照組給予等體積阿昔洛韋乳膏外涂，連續給藥7天。

從HSV-1病毒感染次日起開始觀察病灶皮膚炎癥、水腫、浸潤、丘皰疹、糜面及結痂等情況，并對皮膚炎癥、水腫、結痂的嚴重程度及丘皰疹數量進行評價。在發病高峰期（HSV-1病毒感染后第5天）對其嚴重程度進行評價，0分（-）為正常；1分（+）為輕度；2分（++）為中度；3分（+++）為重度；4分（++++）為極重度。

連續給藥7天后，處死各組實驗動物，取病灶皮膚組織。組織與生理鹽水按1∶9混合，對各組織樣本進行勻漿處理，分離勻漿上清液。先將勻漿上清進行總蛋白定量，根據蛋白定量結果，將所有樣本調至同樣總蛋白濃度。用試劑盒提供的DNA提取液抽提樣本中的DNA成分，通過實時定量PCR方法檢測各樣本中HSV-1的拷貝數量。

2.5 HSV-2病毒感染動物模型

將豚鼠隨機分為6組，即正常對照組、溶劑（輔料）對照組、多糖凝膠低劑量組、多糖凝膠中劑量組、多糖凝膠高劑量組和陽性對照（阿昔洛韋乳膏）組，每組12只。

用75%乙醇與純水清洗各組豚鼠外陰部。然后用粗糙細玻棒摩擦陰道粘膜數次；醫用七星針在外陰表面叩擊約20次。待皮膚微微滲血，（除正常對照組外）用灌胃針頭伸入陰道內3 cm注射病毒液（1×107pfu，100μL），邊注射邊涂抹使病毒液完全滲入外陰粘膜組織。

夏枯草低、中、高劑量組每天每只給予相應濃度的1鑰匙（小）體積（約200mg）凝膠外涂于豚鼠造模部位，溶劑對照組豚鼠給予等體積輔料外涂，陽性藥對照組給予等體積阿昔洛韋乳膏外涂，連續給藥10天。

從豚鼠接種病毒后天開始分別觀察每只豚鼠外陰皮損，積分方法參用Kern's方法，具體評分標準為：0分為無癥狀，0.5分為僅輕微紅腫；1.0分為紅腫明顯，無皰癥；1.5分為單個小皰癥（直徑≤2mm）；2.0分為單個大皰癥（直徑＞2mm）；2.5分為多個小皰癥和/或陰道潰瘍（出血）；3.0分為多個大皰癥；3.5分為嚴重外陰腫脹；4.0分為多個小/大皰癥融合；4.5分為后肢癱瘓；5.0分為外陰潰瘍，后肢癱瘓。

連續給藥10天后，處死各組實驗動物，取病灶外陰部組織。組織與生理鹽水按1∶9混合，對各組織樣本進行勻漿處理，分離勻漿上清液。先將勻漿上清進行總蛋白定量，根據蛋白定量結果，將所有樣本調至同樣總蛋白濃度。用試劑盒提供的DNA提取液抽提樣本中的DNA成分，通過實時定量PCR方法檢測各樣本中HSV-2的拷貝數量。

2.6 數據統計

表1 夏枯草超濾多糖和阿昔洛韋對Vero細胞的CC50值及對HSV-1和HSV-2的IC50值

3 實驗結果與分析

3.1 體外抗皰疹病毒活性測定結果

利用MTT法檢測夏枯草超濾多糖對Vero細胞的毒性作用，結果顯示夏枯草超濾多糖在1 600μg·mL-1濃度以下均無毒性。空斑減數實驗結果表明，夏枯草超濾多糖能夠在體外實驗中抑制HSV-1和HSV-2的活性，并且其抑制作用呈劑量依賴性（表1、圖1）。

3.2 夏枯草多糖凝膠的體內抗HSV-1作用

3.2.1 觀察病灶皮膚

從HSV-1病毒感染小鼠次日起開始觀察病灶皮膚，在病毒感染后第3天病灶皮膚開始出現丘皰疹，并伴有明顯的炎癥、水腫、大量分泌物和糜面的發生。在第5天達到發病高峰，隨后進入自限階段，病灶處炎癥與水腫開始消退，丘皰疹發生部分結痂，分泌物減少糜面漸趨干燥。夏枯草多糖凝膠能夠緩解皰疹發病程度，改善各種病理體征，且呈濃度依賴關系，高劑量夏枯草多糖凝膠與陽性對照藥物阿昔洛韋乳膏基本等效（圖2）。

圖1 夏枯草超濾多糖抗HSV-1和HSV-2的空斑效果圖

圖2 HSV-1感染小鼠的病灶皮膚觀察結果（感染后第5天）

3.2.2 丘皰疹數統計結果

在HSV-1病毒感染后第3、5、7天對各組豚鼠病灶皮膚處發生的直徑大于2mm的丘皰疹進行計數與統計。統計結果顯示，夏枯草多糖凝膠能夠緩解感染模型豚鼠丘皰疹的發生，并促進丘皰疹的消退，且具有明顯的量效關系。隨著給藥時間的延長，其藥效逐漸顯現，在第3天高劑量組與溶劑對照組相比已具有顯著差異，在第5天中劑量組顯現差異，到第7天低劑量組開始表現出顯著療效，且在整個病程中高劑量組的療效接近于陽性對照藥物阿昔洛韋乳膏（圖3）。

3.2.3 對病變情況的評價

通過對病灶皮膚發生典型炎癥反應、水腫和結痂的程度進行計分評價，發現夏枯草多糖凝膠能夠明顯緩解感染豚鼠皮膚的炎癥反應與水腫，且具有量效關系。由于高劑量夏枯草多糖凝膠對丘皰疹發生的抑制，以及促進丘皰疹消退的作用，其結痂程度也明顯減少。比較在炎癥反應、水腫和結痂方面的療效，夏枯草多糖凝膠高劑量組的療效近于陽性對照藥物阿昔洛韋乳膏（圖4）。

圖3 HSV-1病毒感染豚鼠病灶皮膚處的丘皰疹數

圖4 對HSV-1感染豚鼠病灶皮膚典型病變情況的評分結果

3.2.4 對病灶組織中HSV-1病毒的定量分析

為獲得可觀的量化評價，在HSV-1病毒感染后第7天對實驗豚鼠進行安樂死后，取病灶皮膚組織。通過實時定量PCR方法檢測單位組織中HSV-1的DNA拷貝數，從而評價HSV-1病毒在各組豚鼠病灶皮膚組織中的含量。實驗結果顯示，夏枯草多糖凝膠能夠明顯降低感染豚鼠皮膚組織HSV-1的DNA拷貝數，且具有量效關系。高劑量夏枯草多糖凝膠與溶劑對照組比較具有統計學差異，其減少病灶組織中HSV-1的效應與陽性藥物阿昔洛韋乳膏相當（圖5）。

3.3 夏枯草多糖凝膠的體內抗HSV-2作用

3.3.1 觀察外陰部病變情況

HSV-2病毒感染次日起開始觀察豚鼠外陰部病灶，在病毒感染后第2天開始外陰部出現紅腫、皰疹，并伴隨分泌物增加和外陰部皮膚潰破。在第6天達到發病高峰，隨后進入自限階段，病灶處紅腫開始消退，皰疹發生部分結痂，分泌物減少，糜面漸趨干燥。夏枯草多糖凝膠能夠緩解皰疹發病程度，改善各種病理體征，且呈濃度依賴關系，高劑量夏枯草多糖凝膠與陽性對照藥物阿昔洛韋乳膏基本等效（圖6）。

圖5 HSV-1病毒感染豚鼠病灶組織中HSV-1的DNA拷貝數

圖6 HSV-2病毒感染小鼠病灶外陰部觀察結果（感染后第6天）

3.3.2 對發病情況的評價

HSV-2病毒感染后第2天開始外陰部出現皮膚紅腫、皰癥、陰道潰瘍等典型評分指征，在第6天達到發病高峰。在第2、4、6、8、10天用Kern's方法進行評價。實驗結果顯示，夏枯草多糖凝膠能夠明顯緩解感染豚鼠HSV-2病毒引起的各種病變現象，且具有量效關系。其中，夏枯草多糖凝膠高劑量組的療效接近于陽性對照藥物阿昔洛韋乳膏（圖7）。

3.3.3 對病灶組織中HSV-2病毒的定量分析

為獲得可觀的量化評價，在HSV-2病毒感染后第10天對實驗豚鼠進行安樂死后，取病灶組織。通過實時定量PCR方法檢測單位組織中HSV-2的DNA拷貝數，從而評價HSV-2病毒在各組豚鼠病灶組織中的含量。實驗結果顯示，夏枯草多糖凝膠能夠明顯降低感染豚鼠皮膚組織HSV-2的DNA拷貝數。其中，中劑量與高劑量夏枯草多糖凝膠與溶劑對照組比較具有統計學差異，其減少病灶組織中HSV-2的效果與陽性藥物阿昔洛韋乳膏相當（圖8）。

圖7 HSV-2病毒感染小鼠病灶外陰部典型病變情況的Kern's評分結果

圖8 HSV-2病毒感染豚鼠病灶外陰部組織中HSV-2的DNA拷貝數

4 討論

在進行藥物體外抗病毒的研究過程中，最為常用的方法是細胞病變效應（Cytopathic Effect，CPE）法，即CPE法。在藥物的無毒范圍內，細胞病變隨著藥物濃度的提高逐漸減輕，從而可以粗略的估計藥物有效范圍。但此法主觀性強，且不能進行精確的定量分析。MTT分析法是使用MTT[(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四唑溴化物]對細胞進行染色，通過檢測其光密度值（Optical Density，OD）的改變可判斷細胞的活性，從而進行藥效的定量分析。但MTT法必須與CPE法相結合，通過在光鏡下觀察細胞的CPE，決定進行MTT測定的最適時間，以保證結果的準確性。空斑試驗是病毒學研究中的經典實驗技術，可精確測定病毒的感染程度。它比MTT法更敏感、精確，藥物有效范圍更大，檢查結果直觀，而且不受CPE類型的限制，但應用空斑減數法對操作技術要求較高，方法較繁瑣[8]。本課題組前期研究已利用MTT結合CPE的方法對夏枯草多糖提取物的抗單純皰疹病毒活性進行了篩選[7]，本研究利用空斑減數法再次驗證了夏枯草超濾多糖的體外抗HSV-1和HSV-2活性。

進一步建立HSV-1（皮膚感染）和HSV-2（外陰部感染）病毒感染豚鼠模型，以病灶病變情況、丘皰疹數、典型病變評分結果以及病灶組織中HSV-1和HSV-2病毒的DNA拷貝數等為指標，對夏枯草多糖凝膠的體內抗單純皰疹病毒活性進行評價。結果顯示，對于HSV-1病毒感染的豚鼠模型中，夏枯草多糖凝膠能夠降低感染豚鼠皮膚的皰疹發病程度，改善各種病理體征，減少丘皰疹的發生并促進其消退，緩解感染豚鼠皮膚的炎癥反應與水腫，降低感染豚鼠皮膚組織HSV-1的DNA拷貝數；對于HSV-2病毒感染的豚鼠模型中，夏枯草多糖凝膠能夠緩解感染豚鼠外陰部的皰疹發病程度，減少外陰部皮膚紅腫、皰癥和陰道潰瘍，明顯降低感染豚鼠皮膚組織HSV-2的DNA拷貝數。此外，對感染豚鼠病變指標的評價結果顯示，高劑量夏枯草多糖凝膠與陽性對照藥物阿昔洛韋乳膏基本等效。因此，夏枯草多糖及其凝膠制劑具有開發成為抗單純皰疹病毒藥物的潛在價值，本研究結果將為后續將夏枯草多糖開發成為抗單純皰疹病毒的新藥提供科學依據。

1蓋春艷,孔德云,王曙光,等.夏枯草化學成分研究.中國醫藥工業雜志,2010,41(8)：580-582.

2 Xu H X,Lee SH S,Lee SF,etal.Isolation and characterization of an anti-HSV polysaccharide from Prunella vulgaris.AntiviralRes,1999,44 (1)：43-54.

3 Zhang YW,But P PH,Ooi VEC,et al.Chemical properties,mode of action,and in vivo anti-herpes activities of a lignin-carbohydrate complex from Prunella vulgaris.AntiviralRes,2007,75(3)：242-249.

4 Cheng C L,Ng K Y,Xu H X.Recentadvances in the discovery ofnovel anti-herpetic agents from Chinese herbal medicines.Cur Org Chem, 2010,14(16)：1714-1726.

5姜玲海,馮怡,徐德生,等.夏枯草多糖抗單純性皰疹病毒及相關免疫學活性初步研究.時珍國醫國藥,2007,18(11)：2622-2623.

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7孔思遠,吳蓉,蔡雙璠,等.夏枯草抗皰疹病毒多糖的提取及純化工藝研究.世界中醫藥,2016,11(7)：1145-1149.

8劉媛媛,楊占秋,何靜,等.MTT分析法、空斑減數法及CPE觀察法評估藥物體外抗病毒效果的比較與分析.武漢大學學報(醫學版), 2005,26(2)：199-202.

A Pharm acodynam ic Study on the Anti-Herpes Sim p lex Virus(HSV)Activity of the Polysaccharidesand Gels from Prunella vulgaris L.

CaiShuangfan1,2,Yang Yang3,Wu Rong1,2,Yang Yifu3,Tan Hongsheng1,2
(1.SchoolofPharmacy,ShanghaiUniversity ofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 2.Engineering Research CenterofShanghaiCollegesforTCM New Drug Discovery,Shanghai201203,China; 3.The ExperimentCenterofScienceand Technology,ShanghaiUniversity ofTraditionalChineseMedicine, Shanghai201203,China)

The aim of this study is to explore the anti-HSV activity of P.vulgaris polysaccharides and gels in vitro and in vivo with the provision of scientific evidence for the further research of anti-HSV new drugs.Plaque reduction assay was adopted to determine the IC50value of P.vulgaris polysaccharideson HSV-1 and HSV-2 in vitro.In addition,HSV-1(skin)and HSV-2(vulva)infected guinea-pigmodelswere established for assessing the anti-HSV activity ofpolysaccharides and gels in vivo,and infected lesion degree,number of papulovesicle,typical lesion score and the DNA copy numbersofHSV-1 and HSV-2 viruses in the lesion tissuewere taken as the indexes.Itwas found that the activitiesofHSV-1 and HSV-2 viruseswas inhibited by P.vulgaris polysaccharides in vitro,while HSV induced skin lesions in the guineapigswere ameliorated by P.vulgaris gel,exerting an anti-HSV action.In conclusion,itwas demonstrated that P.vulgaris polysaccharidesand gelsperformed an anti-HSV action both in vitro and in vivo with the hidden value ofdevelopinganti-HSV agents.

Prunella vulgaris L.,anti-herpessimplex virus,polysaccharides,gel

10.11842/wst.2017.02.010

R285.5

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2017-02-21

修回日期：2017-02-21

＊科學技術部“重大新藥創制”科技重大專項“十二五”計劃（2013ZX09103002-020）：夏枯草多糖抗皰疹病毒候選藥物研究，負責人：徐宏喜。

＊＊蔡雙璠、楊揚為共同第一作者。

＊＊＊通訊作者：楊以阜，研究員，主要研究方向：免疫藥理學評價及作用機制研究；譚紅勝，副研究員，主要研究方向：中藥活性成分研究及中藥新藥研發。