高速逆流色譜快速分離山竹子素的制備方法實驗研究＊

張寶軍，房慶偉，譚紅勝，鄭昌武，付文衛＊＊

（1.上海中醫藥大學中藥學院上海201203；2.中藥創新藥物研發上海高校工程研究中心上海201203）

高速逆流色譜快速分離山竹子素的制備方法實驗研究＊

張寶軍1，2，房慶偉1,2，譚紅勝1，2，鄭昌武1，2，付文衛1，2＊＊

（1.上海中醫藥大學中藥學院上海201203；2.中藥創新藥物研發上海高校工程研究中心上海201203）

目的：制備山竹子素（garcinol）化學對照品。方法：采用高速逆流色譜法，從多花山竹子、山木瓜、大葉藤黃三種藤黃屬植物粗提物中快速分離化合物garcinol，溶劑系統為正己烷-乙酸乙酯-95%乙醇-水（8：8：12：4，體積比），上相做固定相，下相做流動相，儀器轉速850 rpm，溫度25℃，檢測波長254 nm，目標化合物餾分經Sephadex LH-20凝膠柱柱色譜純化，所得樣品由高效液相色譜法檢測純度。結果：可從104.765 g多花山竹子枝、105.270 g山木瓜枝、102.318 g大葉藤黃果實中分離得到garcinol的量分別為45mg、281mg、4080mg，純度分別為98.72%、98.36%、98.42%。結論：通過對比三種植物樣品處理方法，結果以大葉藤黃果實作為原料時，正己烷-乙酸乙酯-95%乙醇-水（5：5：5：5，體積比）萃取的上相浸膏，經高速逆流色譜法結合凝膠柱柱色譜法，可快速高效、大量制備化合物garcinol。實驗表明該方法效率高，可操作性強，制備量大。

高速逆流色譜大葉藤黃山竹子素制備方法

山竹子素（garcinol）是從藤黃科（Guttiferae）植物山木瓜Garcinia esculenta Y.H.Li枝、怒江藤黃Garcinia nujiangensis C.Y.Wu et Y.H.Li枝或葉、大葉藤黃Garcinia xanthochymus Hook.f.ex T.Anders.果實、印度藤黃果實等中提取分離的一種氧雜蒽酮衍生物類活性成分[1-3]。現代藥理研究表明，garcinol具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗衰老、抗氧化等作用，能夠抑制前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤的生長[4-6]，具有增加腫瘤細胞放射增敏性的潛能和抑制腫瘤增殖的作用[7]。目前，garcinol的主要提取方法有冷浸法、滲漉法、回流法，主要的分離方法是反復硅膠柱柱色譜法、重結晶法、高效液相制備法[1,7,8]。采用傳統經典柱色譜法分離制備，過程繁瑣，耗時長且伴隨著樣品的損失，效率低。目前，還沒有快速分離純化garcinol較好方法。因此，研究garcinol（結構見圖1）的高效分離制備方法具有重要意義。

高速逆流色譜技術（High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC）作為一種連續高效的液-液分配分離技術，由于無需固態支持物，因此可避免固態基質或載體不可逆吸附造成的樣品吸附、損失、失活變性等問題，特別適合于天然生物活性成分的分離。與傳統經典柱色譜法相比，HSCCC具有操作簡單、溶劑消耗少、快速高效、制備量大、高純度、應用范圍廣、適用性好等優點，已廣泛應用于酚類、黃酮類、香豆素類、生物堿類、皂苷類、萜類、多肽、蛋白等多種物質的制備分離[9-14]。

本研究選取了多花山竹子、山木瓜、大葉藤黃3種藤黃屬植物，經樣品前處理后，結合分配系數測定法及參考相關文獻，考察并優化了一系列不同配比的溶劑體系，從中篩選出了一種適合于garcinol分離的溶劑體系，并成功用于garcinol的高效制備性分離。

圖1 garcinol結構式

1 實驗材料

1.1 儀器與試藥

高速逆流色譜儀（HSCCC）：主機（TEB-300C，上海同田生化科技有限公司），紫外檢測器（UV2000D，上海三為科學儀器有限公司），低溫恒溫槽（DC-0506，上海同田生化科技有限公司）。Waters e2695高效液相色譜儀（美國，包括輸液泵、脫氣裝置、自動進樣裝置、PDA檢測器），Aglient ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。SephadexTMLH-20凝膠柱（GEHealthcareBio-Sciences）。

garcinol對照品（上海中醫藥大學中藥創新研發上海工程中心提供，純度≥98%）；95%乙醇、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷等溶劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；液相色譜分析用的乙腈為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司），水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.2 實驗樣品

多花山竹子枝（廣西桂林），山木瓜枝（云南怒江），大葉藤黃果實（云南德宏），經上海中醫藥大學中藥學院張紅梅副研究員鑒定為藤黃屬植物多花山竹子的干燥枝、藤黃屬植物山木瓜的干燥枝、藤黃屬植物大葉藤黃的干燥成熟果實，植物標本存放于上海中醫藥大學中藥創新藥物研發上海高校工程研究中心。

2 實驗方法

2.1 樣品的制備

稱取104.765 g多花山竹子枝粉末、105.270 g山木瓜枝粉末、102.318 g大葉藤黃果實粉末分別置于冷凝回流裝置中，以7倍量95%乙醇加熱回流提取3次，每次1h，趁熱過濾，合并濾液，50℃下減壓濃縮至粘稠狀，真空干燥，得到25.144 g多花山竹子枝乙醇粗提物（A）、3.447 g山木瓜枝乙醇粗提物（B）、56.130 g大葉藤黃果實乙醇粗提物（C）；分別以正己烷-乙酸乙酯-95%乙醇-水（5：5：5：5，體積比）作為溶劑系統，進行萃取，收集上相有機相減壓濃縮至無溶劑味，依次得7.542 g浸膏（A1），1.729 g浸膏（B1），13.247 g浸膏（C1），置干燥器中保存，備用。

取7.542 g多花山竹子枝浸膏（A1）經硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷、二氯甲烷：甲醇（30：1）混合溶液作為洗脫劑洗脫，經薄層色譜法收集合并含有目標化合物的餾分（A2）；再經Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，甲醇作為洗脫劑洗脫，經薄層色譜法收集合并含有目標成分的餾分，減壓濃縮干燥，得到406.96mg浸膏（A3），置干燥器中保存，備用。

2.2 HSCCC溶劑系統的選擇

第一，擾亂社會市場。道德與利益的沖突時有發生，因為市場永遠都是追求利益最大化的地方，部分企業為了支撐業績、吸引投資，通過舞弊、造假來粉飾報表，舞弊案件層出不窮。若是這種現象泛濫，資本市場將充斥著“虛假”，這給市場經濟的健康發展帶來非常不利的影響，市場經濟是信用經濟，誠信缺失必將危及市場經濟根基。

兩相溶劑系統的選擇是依據目標化合物在兩相溶劑中分配系數來確定，一般理想的分配系數（K）在0.5-2.5之間，可通過高效液相色譜法來計算K值。具體步驟如下：取一定量的提取物于1.5mLEP管中，加入預先平衡好的兩相溶劑上相、下相各500μL，劇烈震搖使其充分溶解混合，靜置分層后，取等體積上相、下相各200μL，揮干溶劑，殘渣用500μL甲醇溶解，分別取10μL通過HPLC分析。待分離物質在上相的峰面積響應值記作AU，在下相的峰面積響應值記作AL，根據公式K=AU/AL計算其在不同體系下的分配系數。

2.3 兩相溶劑體系及樣品溶液的配制

本實驗選用正己烷-乙酸乙酯-95%乙醇-水（8：8：12：4，體積比）作為溶劑系統，將各溶劑按照比例加入分液漏斗中，充分振搖，溶劑系統以無乳化，分層時間在20-30 s為宜，靜置分層后，將上下相分開，超聲脫氣20min，脫氣后靜置至室溫，備用。

分別稱取浸膏（A3）201 mg、（B1）500 mg、（C1）500mg，加入一定體積的上相溶液（Vm≤20mL），振蕩混勻使其完全溶解，進樣前配制。

2.4 樣品的分離

HSCCC的色譜條件：正己烷-乙酸乙酯-95%乙醇-水（8：8：12：4，體積比）溶劑系統，取上相作為固定相，下相為流動相；轉速850 rpm，檢測波長：254 nm，溫度：25℃。在上述色譜條件下，待檢測器出口有下相流出且保持恒定時，即螺旋管內已建立兩相流體動力學平衡，將已準備好的浸膏（A3）、（B1）、（C1）樣品溶液分別注入色譜儀中，使用色譜工作站采集數據，采用自動接收器收集餾分，經薄層色譜顯色反應和HPLC檢測，收集合并含有目標化合物的餾分，減壓濃縮干燥，得29.02mg粗品（A4）、82.28mg目標成分（B2）、164.51mg粗品（C2）。

圖2 三種藤黃屬植物HPLC色譜圖

表1 目標成分garcinol在不同系統中的分配系數（K值）表

上述多花山竹子枝粗品（A4）、大葉藤黃果實粗品（C2）分別經Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，甲醇作為洗脫劑洗脫，經薄層色譜顯色反應和HPLC檢測，收集合并目標成分，減壓濃縮干燥分別得到21.75mg、154.80mg目標成分。

2.6 三種藤黃屬植物粗提物及分離物的garcinol分析

多花山竹子枝、山木瓜枝、大葉藤黃果實粗提物和經HSCCC、凝膠柱色譜分離所得餾分均經HPLC分析。HPLC的色譜條件：色譜柱：Aglient ZORBAX SBC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脫，0-45min，30%→98%乙腈，45-50min，98%→30%乙腈，50-60min，30%乙腈；流速：1.0mL·min-1；進樣量：10μL；柱溫：35℃，檢測波長：254 nm。

HSCCC及Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離所得目標成分均與garcinol對照品對照鑒定。

3 結果與分析

3.1 HPLC分析

本研究采用乙腈-0.1%甲酸水作為流動相對三種藤黃屬植物粗提物進行分析，采用2.6項下洗脫程序時，樣品中的目標峰得到很好地分離，全波長掃描發現，在254 nm的波長下，三種植物樣品色譜峰信息豐富，與目標峰有較好的分離度且響應值大，因此，選擇254 nm作為檢測波長。與對照品HPLC的保留時間和紫外光譜對比，確定組分1為garcinol，在后續目標物分離中以其為參照進行，如圖2所示。

3.2 HSCCC溶劑系統的選擇優化

溶劑系統的選擇是影響HSCCC分離的關鍵因素，根據目標成分的理化性質，結合研究報道[15-17]，考察了HSCCC中應用最廣泛的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶劑體系，實驗中選用了更為經濟環保的95%乙醇替換了甲醇。考察了一系列不同配比的溶劑體系對目標化合物分配系數的影響，結果見表1。

從表1可以看出，選擇正己烷-乙酸乙酯-95%乙醇-水（5：5：5：5，體積比）作為溶劑系統時，目標化合物幾乎完全分配于上相，因此，首先選擇正己烷-乙酸乙酯-95%乙醇-水（5：5：5：5，體積比）溶劑系統對三種藤黃屬植物醇提物進行萃取，以靶向富集目標成分。結合研究報道，選擇正己烷-乙酸乙酯-95%乙醇-水（8：8：10：6，體積比）溶劑系統作為初始篩選體系，隨著體系中95%乙醇比例的增加，上相的保留能力顯著增加，目標成分的分配系數顯著增大。選擇正己烷-叔丁基甲醚-乙腈溶劑系統篩選時，上相保留能力較低，目標成分的分配系數偏小，可導致出峰時間提前，不利于高純度目標產物的制備。溶劑系統的選擇是依據目標化合物在兩相溶劑中分配系數來確定，一般理想的分配系數（K）在0.5-2.5之間。結合上述因素及HSCCC實際分離效果，選擇正己烷-乙酸乙酯-95%乙醇-水（8：8：12：4，體積比）溶劑系統。

3.3 HSCCC結合Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離純化結果

HSCCC法采用正己烷-乙酸乙酯-95%乙醇-水（8：8：12：4，體積比）溶劑系統，結合Sephadex LH-20凝膠柱柱色譜法，可從201mg多花山竹子枝粗提物（A3）中得到純度為98.72%的garcinol 21.75mg（HSCCC保留時間82-87min），得率：0.04%（得率=產物質量/藥材質量×100%）；可從500mg山木瓜枝粗提物（B1）中得到純度為98.36%的garcinol 82.28mg（HSCCC保留時間225-260min），得率：0.27%；可從500mg大葉藤黃果實粗提物（C1）中得到純度為98.42%的garcinol 154.80 mg（HSCCC保留時間220-245 min），得率：3.98%，HSCCC色譜圖見圖3。

3.4 純度檢測和結構鑒定

在分離過程中，一直采用薄層色譜顯色反應和HPLC檢測對分離過程中所得餾分進行跟蹤檢測。目標成分純度在不同波長下經HPLC峰面積歸一化法測定，經對照品對比鑒定為garcinol，結構見圖1，HPLC譜圖見圖2。

圖3 三種藤黃屬植物粗提物HSCCC色譜圖

4 討論

為增加產物的量，本文采用正己烷-乙酸乙酯-95%乙醇-水（5：5：5：5，體積比）作為溶劑系統對粗提物進行萃取，除雜率分別為70%（多花山竹子），50%（山木瓜），77%（大葉藤黃），是一種高效的目標成分富集方法。樣品經逆流色譜分離后，結合Sephadex LH-20凝膠柱色譜法進一步純化目標餾分，可得到高純度產物。

本研究建立了適合于多花山竹子、山木瓜、大葉藤黃3種藤黃屬植物提取物中garcinol的高速逆流色譜分離方法，結合實驗步驟、實際分離效果及產率，通過對比三種材料的提取方法，發現以大葉藤黃果實作為原料時，經高速逆流色譜法結合凝膠柱色譜法，可快速高效、大量制備化合物garcinol，該方法產品收率高，制備方法可操作性強，為garcinol的制備提供了一條新的技術路線，為進一步garcinol生理活性及作用機制的研究奠定夯實的物質基礎。

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Preparative Isolation and Purification of Garcinolby High-Speed Countercurrent Chromatography

Zhang Baojun1,2,Fang Qingwei1,2,Tan Hongsheng1,2,Zheng Changwu1,2,FuWenwei1,2
(1.SchoolofPharmacy,ShanghaiUniversity ofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 2.Engineering Research CenterofShanghaiCollegesforTCM New Drug Discovery,Shanghai201203,China)

This study aimed at preparing the chemical reference substance of garcinol.A preparative high-speed countercurrent chromatography(HSCCC)was adopted for the isolation of garcinol from the twigs of Garcinia multiflora Champ,G.esculenta Y.H.Liand the fruitsof G.xanthochymus Hook.f.ex T.Anders.The crude extractswere separated by HSCCC with two phase solvent systems composed of n-hexane-ethyl acetate-95%ethanol-water(8：8：12：4,volume ratio)using the upper stationary phase and the lowermobile phase.Under the conditionsofa flow rate of 2.0 and 4.0mL· min-1,and the apparatus rotation at850 rpm,the column temperature at25℃and the detection wavelength at254 nm,the fraction containing garcinol was purified by the Sephadex LH20 chromatography.The purity test in the extracts wasdetermined by high-performance liquid chromatography.As a result,the contents ofgarcinolwere 45,281 and 4080mg respectively separated from 104.765 g twigs of G.multiflora Champ,105.270 g G.esculenta Y.H.Liand 102.318 g the fruits of G.xanthochymus Hook.f.ex T.with the purity of 98.72%,98.36%and 98.42%.Compared with the sample pretreatments and separation efficiency of the three plants,it was found that the fat-soluble extracts rapidly and efficiently extracted using n-hexane-ethyl acetate-95%ethanol-water(5：5：5：5,volume ratio)contained abundant garcinol taking fruitsof G.xanthochymus Hook.f.ex Tas the rawmaterialwith the combination ofHSCCC and Sephadex LH-20 chromatography.In conclusion,itwas indicated that the combinationmethod is efficientwith high operability and large preparation quantity.

High-speed countercurrent chromatography,Garcinia xanthochymus Hook.f.ex T.Anders,garcinol,preparativemothod

10.11842/wst.2017.02.011

R93

A

（責任編輯：王慧慧，責任譯審：朱黎婷）

2017-02-20

修回日期：2017-02-20

＊上海中醫藥大學預算內項目（2016YSN06）：菲島福木果實抗腫瘤活性成分研究，負責人：付文衛；上海中醫藥大學青年基金項目（81602990）：嶺南山竹子中活性提取化合物的合成，結構修飾及抗EV71病毒研究，負責人：鄭昌武。

＊＊通訊作者：付文衛，副研究員，博士/碩士生導師，主要研究方向：中藥活性成分研究。