肉蓯蓉種子質量評價及藥材初加工研究＊

谷彩梅，劉德旺，王增繪，蔡敏＊＊，黃林芳＊＊

（1.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所北京100193；2.內蒙古醫科大學藥學院呼和浩特010080）

肉蓯蓉種子質量評價及藥材初加工研究＊

谷彩梅1，劉德旺2，王增繪1，蔡敏2＊＊，黃林芳1＊＊

（1.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所北京100193；2.內蒙古醫科大學藥學院呼和浩特010080）

目的：對肉蓯蓉種子質量進行評價并建立種子質量分級標準；考察不同初加工方法對肉蓯蓉主要有效成分影響，確定肉蓯蓉的適宜加工方法。方法：以種子千粒重、空胚率、水分含量等方面對肉蓯蓉種子進行質量評價；分別對冷凍干燥法、自然烘干法和熱風循環烘干法進行初加工方法考察，采用HPLC-UV法測定不同初加工方法下肉蓯蓉中苯乙醇苷的含量。結果：建立肉蓯蓉種子質量分級標準并根據評級指標將種子分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個等級；通過對加工方法的考察表明最優加工方法為冷凍干燥法，該方法有效成分損失少、飲片外形美觀、質地酥脆、干燥速度快。結論：本研究結果為肉蓯蓉種子資源的質量控制提供參考，也為肉蓯蓉鮮品的初加工方法提供了科學依據。

肉蓯蓉種子質量發芽率冷凍干燥法苯乙醇苷

肉蓯蓉Cistanche deserticola Y.C.M，又稱荒漠肉蓯蓉，為列當科多年生全寄生植物，被譽為“沙漠人參”，是中國西北荒漠地區特有的名貴補益類中藥材（圖1）。始載于《神農本草經》，具有補腎陽、益精血、潤腸通便等功效；用于陽痿、不孕、腰膝酸軟、筋骨無力、腸燥便秘等癥，為歷代使用頻度最高的補腎陽藥物之一[1]。肉蓯蓉屬植物全世界約有20種，分布于歐亞溫暖的干燥地區，從歐洲的伊比利亞半島經非洲北部，亞洲的阿拉伯半島、伊朗、阿富汗、蒙古等地區，到中國的西北部。在中國，肉蓯蓉主要自然分布于內蒙古、甘肅及新疆北部[2,4]。肉蓯蓉含有苯乙醇苷類、環烯醚萜及其苷類、木脂素及其苷類、酚苷類、單萜苷類、生物堿類、糖類、糖醇類、甾醇類及揮發性成分等多種類型化學物質[5]?，F代藥理學研究表明，肉蓯蓉具有提高性功能、抗衰老、抗氧化、保護肝臟、提高學習記憶、抗阿爾茨海默病及帕金森病[6]、通便等多方面的藥效作用。廣泛應用于現代中醫臨床處方、中成藥和保健品，已研發上市有治療阿爾茨海默病的中成藥蓯蓉總苷膠囊、復方蓯蓉益智膠囊以及肉蓯蓉酒和肉蓯蓉茶等藥品和保健品，近年來，肉蓯蓉主要作為營養補充劑食用[7-11]。

隨著經濟發展和人民保健需求的不斷增加，肉蓯蓉的需求量不斷上升，野生肉蓯蓉的采挖量迅猛增加。由于過度開發利用，野生資源瀕臨枯竭，肉蓯蓉及其寄主梭梭已被列為國家二級保護植物，列入《國際野生植物保護名錄》[12]。國內外學者對肉蓯蓉的田間接種、栽培等已做了許多研究[13-16]，但對肉蓯蓉種子質量和發芽條件的研究還較少，尚未建立科學的種子質量評價標準。肉蓯蓉的傳統加工方法費工費時，受自然條件的影響，質量不穩定，嚴重影響藥材的質量和利用；同時傳統的加工方法已經不能滿足產地大量藥材初加工的需要；肉蓯蓉產地加工的相關研究報道較少，既有研究主要集中在傳統的趁鮮切片工藝研究方面，尚沒有研究全面分析評價加工方法的優劣。因此，如何提高珍惜瀕危藥材肉蓯蓉的利用率，綜合評價初加工工藝并制定符合產地大量藥材初加工的方法，以保證藥材質量穩定可靠以及資源的可持續利用，是亟待解決的關鍵問題。

本研究以阿拉善肉蓯蓉基地采集的半野生撫育種子和鮮品藥材為研究對象，采用多指標綜合評價方法，對肉蓯蓉種子質量及鮮品初加工方法技術進行了研究。本研究結果有利于解決當前生產實踐的實際問題，有利于保證藥材品質，降低生產成本，提高生產效率，為人工栽培肉蓯蓉提供技術參考，使肉蓯蓉的加工適應于現代化生產，有著重要的社會效益和良好的經濟效益。

1 材料

1.1 實驗材料

肉蓯蓉種子于2013年從阿拉善肉蓯蓉基地收集，總計20批次，種子過0.7mm篩，實驗前于4℃低溫貯藏一個月。肉蓯蓉鮮品藥材于2013年采自阿拉善肉蓯蓉基地，總計36批次，經中國醫學科學院藥用植物研究所黃林芳教授鑒定為列當科植物肉蓯蓉C.deserticola Y.C.Ma。

1.2 儀器與試劑

日本OLYMPUS體式鏡（型號：SZ2-ILST）；載玻片；智能人工氣候箱（PRX多段系列，寧波海曙賽福實驗儀器廠）；美國Waters高效液相色譜儀：1525 HPLC系統、Waters On-line Degasser AF型在線脫氣機、Waters1525型二元泵、Waters717型自動進樣器、恒溫柱箱、Waters 2487雙波長紫外檢測器、Breeze色譜工作站。哇哈哈純凈水，超聲槽（昆山超聲儀器公司，型號：KQ-400DE），0.22μm有機系濾膜，抽濾儀，1mL醫用注射器，高速萬能粉碎機，電子天平（瑞士METTLER TOLEDO，型號：AL204-IC），電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司，型號：DGG-9070B），冷凍干燥機（上海皓莊儀器有限公司，型號：FD-A10N-50）。

氟啶酮試劑（批號：14032001）購買于上海一基實業有限公司，用丙酮配制。培養皿、濾紙均購于化學試劑與耗材商店。松果菊苷（批號：MUST-14080710）和毛蕊花糖苷（批號：MUST-14070110）對照品購買于成都曼思特生物科技有限公司，乙腈（色譜純，美國Fisher公司），純水（哇哈哈飲用純凈水），甲醇（分析純，北京化工廠），甲酸（分色譜純，北京化工廠）。

圖1 阿拉善肉蓯蓉半野生撫育基地肉蓯蓉花期

2 種子質量評價

2.1 不同濃度質量氟啶酮對種子發芽率影響

實驗玻璃器具、濾紙、蒸餾水、鑷子等用高壓濕熱滅菌鍋滅菌，在烘箱內干燥待用。超凈臺紫外滅菌15min待用，實驗操作在超凈臺內完成。精確稱取1.5 mg氟啶酮粉末，1-2滴丙酮溶液溶解粉末，在100mL容量瓶中定容，配制成15mg·L-1母液，稀釋成所需濃度，分別為1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0mg·L-1。將肉蓯蓉種子分級后，選取直徑大于0.7mm的種子100粒，將種子用70%乙醇溶液浸泡2min后，2%次氯酸鈉消毒20min，蒸餾水沖洗，待用。將消毒后的種子放入75mm，盛有3-5mL不同濃度氟啶酮溶液的培養皿中，每個培養皿放2層濾紙，用封口膜密封，用鋁箔紙包裹，智能人工氣候箱中恒溫25℃下黑暗培養，30天統計發芽率。每個濃度設3個重復。

2.2 千粒重的測定

在每一批次種子中隨機取1 000粒凈種子，用電子天平稱重，精確到0.1mg，重復3次。

2.3 種子空胚率的測定

用鑷子數取每批種子各100粒，用蒸餾水浸泡24 h后，于載玻片上壓出種胚，統計有胚種子與無胚種子的百分率，重復3次，凡有胚的種子為飽滿種子，無胚種子為空癟種子。

2.4 種子水分含量的測定

取肉蓯蓉凈種子0.1 g，置小稱量瓶內，分析天平稱重記錄，放于105±2℃恒溫烘箱烘干至恒重后稱重，計算種子水分含量，重復3次。

2.5 發芽率測定

參照“2.4”項下方法操作，使用最佳質量濃度氟啶酮做預處理，對20批肉蓯蓉種子做發芽率測定。

3 鮮品肉蓯蓉產地初加工研究

3.1 色譜條件

采用Waters-C18色譜柱（3.9 mm×150 mm，4.6μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）為流動相進行梯度洗脫，洗脫程序為：線性梯度洗脫程序：0-10min，28%A，10-25min，28%→40%A。流速為1mL·min-1；紫外檢測波長254 nm。

3.2 肉蓯蓉切片樣品的制備

將新鮮的12份肉蓯蓉樣品清洗干凈，均勻切成厚度為5mm的薄片，每份樣品隨機分成3組（自然風干ZRC1-12，熱風循環烘干HRC1-12，冷凍干燥DRC1-12），分別對每一份樣品的3組做自然風干、熱風循環烘干（80℃）和冷凍干燥處理，備用。

3.3 對照品和供試品溶液的制備

精密稱取松果菊苷和毛蕊花糖苷對照品適量，加50%甲醇于2mL容量瓶至刻度，振搖混合均勻備用。配制成每1mL含1.20mg毛蕊花糖苷和1.34mg松果菊苷的母液，然后按照一定比例稀釋成0.2mg·mL-1的對照品溶液。取經不同加工方法處理后的干燥飲片，粉碎，過3號篩。精密稱取藥材粉末1 g置于帶瓶塞的錐形瓶中，加50%甲醇約50mL溶解，超聲處理30min放置至室溫，補足失重，取上清液用微孔濾膜（0.45μm）濾過，作為供試品溶液。

3.4 方法學考察

3.4.1 線性關系考察

分別精密吸取2組混合對照品液10μL進樣，每一個濃度的混合標準品溶液，重復進樣3次，記錄各峰峰面積，取3次進樣平均值。以各化合物峰積分面積為Y軸，以化合物濃度為X軸作圖，得到各線性回歸方程，毛蕊花糖苷的為y=14 458 767.78x-1 595.25，r=1顯示在0.006 5-0.200 0mg·mL-1濃度范圍內呈良好的線性關系；松果菊苷的為y=14 458 767.78x-1 595.25，r=1顯示在0.006 5-0.200 0mg·mL-1濃度范圍內呈良好的線性關系。

3.4.2 提取方法考察

比較了甲醇和流動相兩種提取溶劑，確定以50%甲醇為提取溶劑。

3.4.3 穩定性和精密度試驗

對同一樣品溶液，在26 h內每隔4 h測定一次，毛蕊花糖苷和松果菊苷的RSD%分別為0.30和0.70，同時表明精密度試驗合格。

3.4.4 重復性試驗

精密稱取同一樣品粉末5份，按“3.3”項下方法制備5份溶液，以上述色譜條件測定，松果菊苷峰面積的RSD%為0.62，毛蕊花糖苷的RSD%為1.24。

3.4.5 加樣回收率試驗

精密稱取已測得含量的樣品適量，共5份，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入相應的對照品溶液，加50%甲醇補足至25mL，稱定重量，按“3.3”項下方法操作，制備成5份樣品溶液，按測定方法測定。以測得的峰面積計算含量及回收率，結果為平均回收率：毛蕊花糖苷98.77%（RSD%為1.80）；松果菊苷為97.00%（RSD%為1.20）。

按“3.3”項下方法操作制備不同加工方法共36個樣品溶液，以色譜條件項下進行測定。

4 結果與分析

4.1 氟啶酮質量濃度對種子發芽的影響

隨著氟啶酮濃度的越大，種子的發芽率呈增大趨勢，氟啶酮濃度為10mg·L-1種子發芽率最高，但當濃度＞10mg·L-1時，隨著濃度的增大發芽率反而減小。在整個發芽過程中，很多也存在發霉情況。詳見圖2。

4.2 肉蓯蓉種子質量測定結果

根據表1得知本實驗用20批荒漠肉蓯蓉種子的千粒重在0.093 9-0.156 9 g范圍內，平均值為0.121 0 g；含水量在4.9%-7.4%范圍，平均值為6.2%；空胚率在13%-29%范圍，平均值為20.3%；發芽率在37%-52%范圍，平均值為45.05%。

4.3 種子質量分級標準的制定

以肉蓯蓉種子發芽率、千粒重、空胚率和含水量4項指標進行K類中心聚類分析，最終聚類中心值見表2。

圖2 培育10天的肉蓯蓉種子發芽以及發霉情況

表1 肉蓯蓉種子質量測定結果

表2 K類中心聚類的最終類中心值

表3 肉蓯蓉種子質量分級標準

由表2可知，發芽率3個類中心值分別為50%、43%和41%；千粒重3個類中心值分別為0.126 4、 0.109 3和0.106 7；空胚率3個類中心值分別為16%、20%和25%；含水量的3個類中心值分別為6.2%、6.3%和6.2%。以肉蓯蓉種子發芽率、千粒重、空胚率和含水量4項指標的聚類中心值作為肉蓯蓉種子分級標準的參考值，結合生產實際和可操作性，在此基礎上初步制定了肉蓯蓉種子質量分級標準，即：Ⅰ級肉蓯蓉種子外形應飽滿，有光澤，大小均勻；Ⅱ級種子外形較飽滿，略有光澤，大小較均勻，有少許癟粒；Ⅲ級種子無光澤，大小不均勻，有部分癟粒。詳見表3。

4.4 經過3種不同加工方法得到肉蓯蓉干燥品

由于我國養老地產處于初級發展階段，未形成有序的規模，經驗不足，尤其是養老地產相關的法律法規和養老服務標準等缺失或尚不完善，社會資本在運作養老地產項目時，會遭遇較大的瓶頸和障礙。

如圖3所示，應用冷凍干燥法處理的樣品外形較規整美觀，熱風循環烘干法處理的樣品，外形顏色略暗，美觀度較差；自然風干法處理的樣品外形顏色暗，美觀度較差。

圖3 不同加工方法的肉蓯蓉干燥切片

肉蓯蓉中苯乙醇苷的含量測定及HPLC色譜圖檢測結果詳見表4、圖4。

表4 肉蓯蓉中苯乙醇苷含量測定結果

5 討論

5.1 肉蓯蓉種子質量的評價及種子質量標準的建立

促進肉蓯蓉種子萌發的氟啶酮最佳濃度為10mg·L-1，平均發芽率約為50%。影響種子質量的因素中隨著空胚率的減小千粒重呈增大趨勢。種子發芽過程中部分種子發生霉變，可能是種子消毒不徹底或實驗操作過程中染菌所致。在實際生產中，應選擇千粒重大、飽滿度好的種子、適宜濃度的萌發刺激物、適宜的培養溫度，還要注意培養過程無菌操作，以得到較高的發芽率。

圖4 肉蓯蓉混合對照品和樣品的HPLC色譜圖

種子質量包含內在和外在的指標。本研究以發芽率、千粒重、空胚率和含水量4項指標制定了肉蓯蓉種子質量的分級標準。分級方法采用最低定級原則，即任何一項指標不符合規定標準都不能作為相應等級的合格種子。在分級的四項指標中，發芽率最為重要，千粒重可反映種子飽滿程度和種子成熟度等。而含水量則可通過再加工如干燥等來提高質量。本分級標準中以發芽率、千粒重兩個指標為主判斷種子質量，空胚率、含水量次之。

5.2 新鮮肉蓯蓉產地初加工研究

本研究對3種不同加工方法：自然干燥，熱風循環烘干和冷凍干燥進行考察，結果表明最優加工方法為冷凍干燥法。該方法有效成分損失少、飲片外形美觀、質地酥脆、干燥速度快，但缺點是加工成本高；其次是熱風循環烘干法，該方法有效成分有部分損失，外形顏色略暗，質地較硬，干燥速度一般，加工成本略高；3種方法中最差的是自然風干法，有效成分大部分損失，外形顏色暗，由于含糖量高易產生霉變，粉碎處理麻煩，干燥速度慢，優點是加工成本低。中藥材企業或種植基地應綜合考慮社會效益、經濟效益及自身實際情況選擇最合適的加工方式。

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A Study on the Seed Quality and Primary Processing of the Fresh Productof Cistanche deserticola

Gu Caimei1,Liu Dewang2,Wang Zenghui1,CaiMin2,Huang Linfang1
(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,Chinese Academy ofMedical Sciences＆Peking Union MedicalCollege, Beijing 100193,China;2.SchoolofPharmacy,InnerMongolia MedicalUniversity,Huhhot010080,China)

The aim of this study was to evaluate the seed quality of C.deserticola and establish quality grading rules of seeds by detecting the impacts of different processing methods on the contents of the effective components of C. deserticola for optimizing the suitable processingmethod.The seed qualitywas judged by thousand-kernelweight,empty embryo rate and water content.The sampleswere preliminary processed by freeze-drying,natural drying and hotair circulation drying respectively,and the content of phenylethanoid glycosides was determined by HPLC-UV.The seed quality classification standard of C.deserticola was established,and the seeds were divided into three grades based on the standard.Itwas found that freeze-dryingmethod was optimum,featuring less effective component loss,beautiful appearance of herbal piece,crisp texture and fast drying.In conclusion,this study laid a foundation for the quality control of the seedsof C.deserticola with the provision ofscientific evidence for the initialprocessing of the fresh product.

Cistanchedeserticola,seed quality,germination percentage,freeze-dryingmethod,phenylethanoid glycosides

10.11842/wst.2017.02.019

R28

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-12-13

修回日期：2017-01-09

＊國家自然科學基金委面上項目(81473315)：地理格局及生態驅動揭示肉蓯蓉品質生態型機理，負責人：黃林芳。

＊＊通訊作者：蔡敏，副教授，主要研究方向：天然藥物研發；黃林芳，教授，主要研究方向：中藥資源與質量評價研究。