B6AF1雌性小鼠免疫性卵巢早衰模型建立＊

王佩娟，陳思，盧燕

（1.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院南京210028；2.江蘇省中醫藥研究院南京210028）

B6AF1雌性小鼠免疫性卵巢早衰模型建立＊

王佩娟1,2＊＊，陳思1,2，盧燕1,2

（1.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院南京210028；2.江蘇省中醫藥研究院南京210028）

目的：本文主要研究自身免疫性卵巢早衰小鼠模型的建立和鑒定方法，為治療和預防免疫性卵巢早衰提供實驗基礎。方法：將A/J雄鼠和C57BL/6雌鼠進行雜交繁殖B6AF1小鼠，篩選出B6AF1雌性小鼠，運用透明帶多肽片段ZP3免疫B6AF1雌性小鼠，對陰道脫落細胞進行巴士染色，第14天結束造模，第7天和第14天分別進行模型鑒定。將卵巢進行H&E染色和ZP3免疫熒光染色，采用ELISA法檢測小鼠血清中E2和FSH的含量，來觀察小鼠動情周期、卵巢組織形態學、抗透明帶抗體免疫熒光和相關性激素的變化，評判免疫性卵巢早衰模型小鼠建立情況。結果：利用透明帶ZP3多肽免疫B6AF1雌性小鼠14天，小鼠動情周期紊亂，卵巢組織有炎細胞浸潤，卵巢中有明顯透明帶出現，血清中性激素E2含量下降和FSH含量上升，第7天上述變化不明顯。結論：利用透明帶多肽ZP3免疫B6AF1雌性小鼠14天，能夠成功建立自身免疫性卵巢早衰模型，該模型發病率高，方法簡單，能為免疫性卵巢早衰的研究提供基礎。

卵巢早衰B6AF1雌性小鼠動物模型免疫學

卵巢早衰（Premature Ovarian Failure，POF）是指女性在40歲之前因為卵巢功能衰竭所致的閉經。其主要特點為患者體內雌激素水平低落，垂體卵泡刺激素及黃體生成素水平失去抑制而升高[1,2]。臨床表現為原發或繼發閉經、不孕、低雌激素等癥狀，該病致病因素多樣，具體發病機制目前尚不明確[3,4]。現代醫學認為與POF密切相關的因素有家族致病基因遺傳、特定酶功能缺陷、機體免疫系統紊亂、手術或放化療過程中的醫源性損傷、環境中的毒素和不良應激等，其中機體免疫功能紊亂導致POF已經越來越受到重視。據統計發現，約5%-30%的POF患者自身免疫功能出現異常[5-7]。目前臨床POF的診斷仍以臨床表現和血清內分泌學檢查為主，很少進行組織病理學檢查，這使得POF研究工作受限[8,9]。

因此，建立一種操作方法簡單、發病率較高的POF動物模型，將為科研及臨床工作研究免疫性POF提供便利的條件。目前常用的免疫性POF動物模型有多種，有的用粗制的卵巢抗原來免疫實驗動物，有的對初生小鼠進行胸腺切除術來建立模型，也有研究用透明帶抗原肽來免疫實驗動物，不同的建模方法均具有不同的優缺點。本研究綜合了之前免疫性POF模型建立的研究成果，利用ZP3330-342多肽片段免疫B6AF1雌性小鼠，從而構建免疫性POF動物模型，結果表明這種方法切實可行，不僅成模率高，而且操作簡單、重復性好，對POF的研究具有很大幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

A/J雄性小鼠和C57BL/6雌性小鼠，6-8周齡，體質量20 g，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號為SCXK（滬）2008-0016，飼養環境為SPF級，室溫22-25℃，濕度40%-70%，符合國家標準。小鼠自由飲食，白天和黑夜時長各12 h。將A/J雄鼠和C57BL/6雌鼠進行雜交，繁育出B6AF1小鼠，4周齡時篩選雌性小鼠，以備免疫性POF造模使用。

1.2 試劑

透明帶多肽ZP3330-342（NSSSSQFQIHGPR），分析純度＞95%，由上海吉爾生化有限公司合成。巴士染色液、蘇木素、伊紅和熒光染色固定液均購自南京建成生物研究所。甲醛、乙醇、苦味酸和中性樹脂均購自國藥試劑有限公司。檢測血清中E2和FSH的ELISA試劑盒均購自美國eBioscience公司。不完全弗氏佐劑和結核桿菌均購自美國Sigma公司。抗透明帶抗體購自英國Abcam公司。熒光二抗購自美國CST公司。抗熒光淬滅封片液購自碧云天有限公司。

1.3 儀器

倒置熒光顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司（型號：Axio Observer A1）；石蠟切片機購自德國Leica公司（型號：RM2245）；組織脫水機、石蠟包埋機、冰臺、烤片機和烘箱均購自湖北定源醫療設備有限公司（型號：CJ-12P、CB-08、CT-9、CT-9D和DGT-G）；全自動全長酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司（型號：Multiskan Spectrum）。

1.4 動物模型建立

篩選雌性B6AF1小鼠46只，隨機分為正常組23只、模型組23只。用弗氏不完全佐劑配制結核分支桿菌，使其濃度為3.3mg·mL-1，充分混勻。用去離子水配制透明帶多肽，使其濃度達到1mmol·L-1，充分混勻。將配制好的完全弗氏佐劑和ZP3多肽液在冰上進行混合，用注射器來回抽打，制成油包水的狀態。將制備好的混勻液注射到模型組小鼠的尾根部和一側后腳掌的皮下組織，共注射0.1mL，空白組注射等體積的生理鹽水。從造模之日起（第0天）每天觀察小鼠的動情周期，第7天處死6只小鼠（正常組3只、模型組3只），留取血清和卵巢組織，鑒定模型。第14天，處死剩余小鼠，進行模型鑒定。

1.5 巴士染色

每天上午8點開始觀察動情周期。取少量無菌棉球裹在牙簽鈍頭上，沾取少量生理鹽水于小鼠陰道內輕刮一下，將刮取物均勻涂于乙醇浸泡過的載破片上，之后進行巴士染色，普通光學顯微鏡觀察并拍照，判斷小鼠動情周期的紊亂情況。

1.6 病理組織觀察

小鼠出死后將左右卵巢均取出，將一側卵巢放入Bouin氏固定液中，固定24 h后進行組織脫水，石蠟包埋后進行5μm切片，展片后拷片3 h，進行H&E染色，觀察卵巢組織的形態變化及炎癥細胞浸潤情況。另一側卵巢進行冰凍切片，將制作好的冰凍切片放入95%乙醇固定30min，切片取出放于晾片板上，吸取少量BSA溶液滴于切片上，PBS洗一次，再將片子取出，用配制好的BSA溶液將Donkey Anti-Mouse IgG稀釋成1∶200，在每張片子上滴1mL稀釋好的溶液，4℃避光孵育過夜，第2天將片子取出，PBS洗3次，吸取50μL抗熒光淬滅封片液滴于每張片子上，用蓋玻片封住片子，用熒光顯微鏡觀察，透明帶抗體的分布情況。

1.7 ELISA檢測E2和FSH

小鼠摘眼球取血，放于促凝管中，3 500 r·min-1離心5 min，吸取上清液，血清保存在-80℃中，利用ELISA試劑盒檢測血清中的雌激素和刺卵泡激素，加50μL的血清樣本到96孔板的檢測孔（提前孵育好了檢測抗體）中，抗原抗體在37℃中孵育1 h，洗3遍，加入顯色液，5min后加入終止液，用全波長酶標儀在450 nm處進行檢測E2和FSH的含量。

1.8 統計學方法

實驗數據在SPSS 17.0中統計處理，結果均采用xˉ±s的形式表示，兩組間比較用Students t檢驗，P＜0.05認為結果有統計學意義。作圖用Graphpad prism 6.0軟件。

2 結果

2.1 免疫性卵巢早衰模型小鼠動情周期紊亂

每天連續刮取小鼠的陰道脫落細胞，進行巴士染色后觀察動情周期變化情況，圖1指出了小鼠不同動情周期的變化特點，小鼠動情周期一般為4-5天，表現為以有核細胞為主的動情前期，無核角化細胞為主的動情期，白細胞為主的動情后期，三者共存的動情間期，4個周期反復循環，如圖1所示。

由表1統計表明，與空白組相比較，模型組B6AF1雌性小鼠的動情周期出現了嚴重的紊亂。空白對照組小鼠動情周期正常，無明顯變化。去除第7天殺死的6只小鼠，對20只空白組和20只模型組小鼠進行脫落細胞分析，模型組小鼠動情周期紊亂18只，動情周期延長、動情周期停滯、無明顯動情周期3種情況均有表現。各組小鼠動情周期紊亂的比例分別為：空白組5%（1/20）、模型組90%（18/20）。

圖1 卵巢早衰小鼠脫落細胞的巴士染色（100×）

表1 造模后小鼠動情周期改變情況比較（n=20）

圖2 卵巢早衰小鼠卵巢組織H&E染色（400×）

圖3 卵巢早衰小鼠卵巢組織透明帶分布（100×）

2.2 免疫性卵巢早衰模型小鼠卵巢病理和透明帶分布觀察

對小鼠卵巢組織切片進行H&E染色，結果如圖2所示，模型組小鼠卵巢發生明顯的炎癥反應。空白組卵巢組織中各級卵泡清晰可見，卵泡及卵母細胞形態規則，顆粒細胞排列整齊，淋巴細胞和漿細胞很少浸潤。模型組（第7天）小鼠卵巢中各細胞形態尚規則，但排列紊亂，炎細胞浸潤情況不明顯；模型組（第14天）小鼠卵巢中可見大量閉鎖卵泡，卵泡細胞形態不規則，顆粒細胞排列紊亂，卵泡及間質見淋巴細胞和漿細胞浸潤。這說明ZP3多肽免疫小鼠14天后，POF模型小鼠的卵巢組織有炎細胞浸潤。

對卵巢組織冰凍切片后進行抗透明帶抗體熒光染色。圖3、圖4顯示空白組未見明顯透明帶熒光。模型組（第14天）小鼠卵巢中可見數個大小不等的黃綠色透明帶熒光區，而模型組（第7天）透明帶熒光較小，且顏色較淡。ZP3免疫熒光染色提示，第7天免疫性POF模型小鼠卵巢中已有明顯透明帶出現，分泌出了透明帶抗體。第14天時透明帶較明顯，小鼠發生了明顯的自身免疫性疾病。

圖4 卵巢早衰小鼠卵巢組織透明帶分布（400×）

2.3 ELISA法檢測小鼠血清中E2和FSH含量

采用抗體雙夾心法ELISA檢測各組小鼠血清中E2和FSH的含量，全自動酶標儀上測定OD450nm和OD630nm后根據標準曲線計算血清中E2和FSH的含量。結果如圖5所示，與空白組相比較，模型組小鼠在第7天和第14天血清E2水平均下調，但第14天血E2水平下降更明顯。（P＜0.01），模型組中FSH水平明顯上調，第7天上升不明顯（P＞0.05），第14天上升明顯（P＜0.01）。

圖5 血清中E2和FSH的含量

3 討論

POF是一種復雜的疾病，目前研究較少，免疫系統紊亂與POF的發生密切相關，現有研究主要圍繞多種致病抗體的形成和T淋巴細胞亞群的失衡進行[7,10,11]。免疫性POF模型動物的建立對研究該病發病機制和治療方法的研究具有重要意義。迄今建立POF模型動物的方法多樣，但均有各自的優缺點[12-14]。①用粗制的卵巢抗原免疫動物，第14天卵巢組織學檢查見卵泡組織內及顆粒細胞中有大量的淋巴細胞、巨噬細胞和漿細胞浸潤[5]；但只有始基卵泡和小部分次級卵泡受累，卵泡與黃體的數量減少、閉鎖卵泡增加，有一定的局限性。②初生小鼠胸腺切除模型，雖然這種方法所建立的模型與人類POF相似，但給出生3天以內的小鼠行胸腺切除術，手術難度大，小鼠的死亡率高，目前難以推廣應用。③用ZP抗原免疫動物產生卵巢炎，目前已有研究認為ZP抗體影響卵泡各不同階段ZP蛋白的合成[8]，因ZP蛋白存在于哺乳動物中，哺乳動物和人的ZP3具有一定的同源性，可用于人類POF的研究，但其模型成功率低，有待進一步改進。④用小鼠透明帶ZP3第330-342個氨基酸序列（NSSSSQFQIHGPR）于小鼠雙后腳掌處進行皮下注射免疫動物而建模，成模率比較高，在卵巢形態學的表現與人類POF自身免疫性卵巢炎相似，有利于進行臨床診斷學和治療學方面的研究。

本課題組借鑒了之前免疫性卵巢早衰模型建立的各種方法，選用用透明帶多肽（pZP3）建造的自身免疫性POF動物模型。同時，國內外多項研究表明，由A/J雄鼠和C57BL/6雌鼠進行雜交繁殖出的B6AF1雌鼠建立自身免疫性疾病的動物模型的成模率達90%以上[10-13]，所以，本研究選用B6AF1雌鼠作為研究對象，用透明帶ZP3的特定序列，第330-342個氨基酸序列（NSSSSQFQIHGPR）來免疫小鼠，建立自身免疫性POF動物模型。本研究表明，造模第14天，模型小鼠卵巢H&E染色有明顯的炎癥發生，且有明顯透明帶出現在卵巢組織中，同時性激素E2水平明顯下降，FSH水平明顯上升，能較好地模擬臨床POF血清學變化，證實造模成功。因此，用透明帶ZP3多肽誘導B6AF1雌鼠自身免疫性POF模型，發病率高，方法簡單，是一種很好的實驗方法。注射ZP3免疫B6AF1小鼠建立自身免疫性POF不僅克服了手術切除胸腺造模的技術問題，還改善了粗制抗原建立POF的弊端，使模型小鼠卵巢組織學表現同人類自身免疫性卵巢炎相符，有利于進行臨床診斷學和治療學方面的研究，是理想的轉化醫學的研究模式。

目前，POF發病機制尚不明確，自身免疫異常是POF發病的一個重要因素，POF的自身免疫紊亂包括細胞免疫和體液免疫紊亂，體現在各類相關自身抗體、細胞因子、T淋巴細胞亞群等方面，這些相關免疫功能紊亂最終會導致卵泡的缺失或卵泡對促性腺激素的反應低下，引發POF。已經證實抗透明帶抗體因可以加速卵母細胞的破壞和耗竭而致POF[6,7]。但透明帶抗體引起免疫生殖損壞的具體機制尚不明確，研究發現CD4+CD25+Treg是具有保護作用的T細胞亞群之一，致炎因子Th17異常是引起免疫損害的重要因子[15]。抗透明帶抗體是否通過CD4+CD25+Treg/Th17比例影響卵巢功能有待進一步研究發現。

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Abstract:This study aimed at exploring the modeling and identification method of autoimmune POF by the ZP3 polypeptide with the provision of scientific basis for the prevention and treatment of POF.B6AF1 female mice,the hybridization of A/Jmale mice and C57BL/6 female mice,was immunized by zona pellucida polypeptide fragments. Then,themice estrous cyclewas detected by vaginal exfoliated cells Pasteur's staining.After the 14-daymodeling,the mice model was identified on the 7thand 14thday,respectively.Ovarian tissue morphology and anti-zona pellucida antibodies immunofluorescence change were detected by H&E staining and ZP3 immunofluorescence staining.Serum hormone levels of E2and FSH in themice were tested by ELISA,with the combination of estrous cycle,ovarian tissue morphology and anti-zona pellucida antibodies immunofluorescence change to judge the success of the POFmicemodel. It was found that ZP3 polypeptide immunized mice appeared the disorder of estrous cycle after 14 days,so did the marked inflammation observed by ovarian biopsy,a clear transparentzone by ZP3 immunofluorescence staining,and the decrease of serum E2declined and the increase of serum FSH by ELISA.However,no significant change was found on the 7thday in the modeling.In conclusion,ZP3 polypeptide induced autoimmune POF mice model was established successfully,featuring high incidence and simplemethod and laying a foundation for the further study of autoimmune POF.

The Establishment of Autoimmune PrematureOvarian Failure(POF)M odelUsing B6AF1 FemaleM ice

Wang Peijuan1,2,Chen Si1,2,Lu Yan1,2
(1.Affiliated HospitalofTraditionalChineseandWestern Medicine,Nanjing University of ChineseMedicine,Nanjing 210028,China; 2.Jiangsu Province Institute ofTraditionalChineseMedicine,Nanjing 210028,China)

Premature ovarian failure,B6AF1 femalemice,mousemodel,immunology

10.11842/wst.2017.02.021

R2-03

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-12-24

修回日期：2017-01-19

＊國家自然科學基金委青年科學基金項目（81303136）：從誘導調節性T細胞分化探討補腎活血中藥治療免疫性卵巢早衰的機制研究，負責人：盧燕；江蘇省科學技術廳自然基金面上項目（BK20151606）：補腎活血湯對制動應激生殖損害大鼠HPA軸及海馬內質網應激調控的影響，負責人：王佩娟；江蘇省中醫藥管理局項目（LZ13088）：從Treg角度研究補腎活血湯保護雌性大鼠應激生殖損害的免疫學機制，負責人：王佩娟。

＊＊通訊作者：王佩娟，主任中醫師，教授，主要研究方向：婦產科內分泌疾病的中西醫結合診療。