丹蛭降糖膠囊對糖尿病大鼠心肌組織TLR4、TNF-α、IL-8表達和心臟病理影響＊

李中南，程麗華，馬超，竇德梅，邢宇婷，邢艷陽

（安徽中醫藥大學第一附屬醫院合肥230031）

丹蛭降糖膠囊對糖尿病大鼠心肌組織TLR4、TNF-α、IL-8表達和心臟病理影響＊

李中南＊＊，程麗華，馬超，竇德梅，邢宇婷，邢艷陽

（安徽中醫藥大學第一附屬醫院合肥230031）

目的：本文主要探討丹蛭降糖膠囊（Dan Zhi Jiang Tang Capsule，DJC）對糖尿病大鼠心肌組織Toll樣受體4（Toll-Like Receptor 4，TLR4）、腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factorα，TNFα）、白介素-8（Interleukin-8，IL-8）的干預及對心臟病理的影響。方法：取50只雄性大鼠，除正常組8只外，其余組給予高脂飼料喂養4周，按35mg·kg-1給大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）1次，建立糖尿病大鼠模型。造模成功后將大鼠隨機分為模型組、DJC高劑量組、DJC低劑量組、吡格列酮組。DIC高、低劑量組每日分別給予1.08、0.54 g·kg-1灌胃，吡咯列酮組予10mg·kg-1灌胃，模型組、正常組予以等量生理鹽水灌胃，連續8周，并繼續喂高脂飼料；測定血糖、HbA1c、血脂；觀察心肌組織TLR4、TNF-α、IL-8蛋白表達。結果：與正常組相比，模型組大鼠心肌組織TLR4、TNFα、IL-8表達增加（P＜0.01）；與模型組相比，DJC高、低劑量組大鼠心肌組織TLR4、TNFα、IL-8表達減少（P＜0.05或P＜0.01）。病理染色發現模型組大鼠心肌組織嚴重受損，DJC高劑量組大鼠心肌組織損傷程度明顯減輕，且優于低劑量組和吡格列酮組。與正常組相比，模型組大鼠血糖、HbA1c、TG、TC、LDL-C水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），與模型組相比，DJC高、低劑量組大鼠血糖、HbA1c、TG、TC、LDL-C水平明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。結論：丹蛭降糖膠囊能夠明顯下調TLR4、TNF-α、IL-8高表達水平，減輕糖尿病大鼠心肌病變程度；具有良好的降糖調脂作用。

丹蛭降糖膠囊心臟病理Toll樣受體4腫瘤壞死因子α白介素-8

近年來，炎癥和免疫學說日益受到人們的關注。TLR4是介導炎癥和免疫反應的主體，可識別多種外源性配體，同時也能識別與炎癥、應激、機體損傷等相關的內源性配體，從而導致一系列炎癥和免疫反應的發生。TLR4信號傳導通路對炎癥和免疫反應相關基因表達有重要的調控作用，糖尿病動脈粥樣硬化、冠心病、心肌病等疾病所引起的非細菌性炎性反應都與TLR4相關[1,2]。近年的研究表明，糖尿病心血管病發病率較高，而TLR4的高表達，可能起到加速糖尿病心肌病變的作用。高血糖可通過多種途徑激活機體炎癥反應，如：TNF-α、IL-8的高表達，而日益受到關注。本研究通過測定糖尿病大鼠心肌組織TLR4、TNF-α、IL-8蛋白含量和心臟病理檢測，探討丹蛭降糖方對糖尿病大鼠心肌組織TLR4、TNF-α、IL-8的影響，從而明確該方的作用機理，為防治糖尿病心肌病變的發生、發展找到新的治療途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級、雄性健康SD大鼠50只，體質量200±20 g，購自安徽醫科大學動物實驗中心，許可證號scxk（皖）2013。大鼠一般狀態良好，毛發茂盛有光澤，進食及活動正常，反應靈敏。

1.2 主要藥物與試劑

DJC由太子參、丹皮、生地黃、菟絲子、澤瀉、水蛭組方而成（安徽中醫藥大學第一附屬醫院藥物制劑中心，規格：0.4 g/粒，批號：20130890）；鹽酸吡格列酮（杭州中美華東制藥有限公司，規格：15mg/片，批號：2015.0206）；STZ（美國Sigma公司，批號：s0130），RIPA細胞裂解液（強）（南通碧云天生物技術研究所），PVDF膜（美國Millipore公司，批號：K5CA1685L），ECL超敏發光試劑盒（美國Thermo公司，批號：QE218149），βactin一抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：16AV0210），TLR4一抗（北京博奧森生物技術有限公司，批號：160306），TNF-α試劑盒（上海源葉生物技術有限公司，批號：130529R），IL-8試劑盒（上海源葉生物技術有限公司，批號：132405R），水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，批號：2010052501）。

1.3 主要儀器

血糖監測儀（美國強生公司，型號：穩豪型），特定蛋白儀（西門子公司），電泳儀（上海天能科技有限公司，型號：EPS300），轉膜儀（上海天能科技有限公司，型號：VE-186），低速迷你離心機（海門其林貝爾儀器制造有限公司，型號：LX300），高速臺式冷凍離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司，型號：JW-3021HR），X膠片（美國伊士曼柯達公司），萬分之一電子天平、微量移液器（德國艾本德股份公司），全自動生化儀（日本株式會社，型號：日立7600）。

1.4 動物分組造模與給藥

取雄性SD大鼠50只，適應性喂養1周后，按數字表法隨機選出9只作為正常對照組，予以基礎飼料喂養（蛋白質16%、脂肪8%、碳水化合物50%）。其余作為實驗組，給予高脂飼料進食（蛋白質15%、脂肪20%、碳水化合物50%，膽固醇5%，豬油10%）。高脂飼料喂養4周后，禁食8 h，一次性腹腔注射STZ 35mg·kg-1（臨用前以pH 4.4的0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制），120 h后尾靜脈測血糖，以血糖≥16.7mmol·L-1為糖尿病大鼠造模成功[3]。造模成功后，將成模的糖尿病大鼠隨機分為模型組、吡格列酮組、DJC高劑量組、DJC低劑量組，每組8只。各藥物組繼續予高脂飼料喂養，按人與大鼠單位體質量折算系數并計算藥物量。吡格列酮組大鼠每日給藥量為10mg·kg-1，DJC高劑量組每日給藥量為1.08 g·kg-1，DJC低劑量組為0.54g·kg-1，正常對照組和模型組予以生理鹽水5mL·kg-1；每日新鮮配置藥液，灌胃1次，連續8周，每4周末行尾靜脈采血測隨機血糖。期間未成模動物2只，血糖過高死亡2只，動物打斗死亡1只。

1.5 觀察指標與方法

大鼠連續給藥8周后，禁食8 h后，以3%水合氯醛按10mg·kg-1腹腔注射麻醉，立即取血，測定血糖、血脂、HbA1c。迅速開腹，取出心臟，一部分放置于已備好的10%中性福爾馬林中固定，備測做大鼠心臟病理；另一部分放置于-80℃冰箱中保存，備測心肌組織TLR4、TNF-α、IL-8的蛋白表達，測定蛋白表達量。

1.6 Western Blot法檢測心肌組織TLR4、TNF-α、IL-8的表達

①蛋白的提取：采用碧云天RIPA細胞裂解液（含有1mM PMSF）提取勻漿后心肌組織中的蛋白；②蛋白質變性：將5×SDSBuffer加入到提取好的蛋白，煮沸變性；③SDS-PAGE凝膠電泳：凝膠由5%濃縮膠和10%分離膠配制而成，凝膠電泳參數：300mA、70min；④恒流轉膜參數為：300mA轉膜1 h；⑤封閉：5%脫脂奶粉37℃封閉2 h；⑥將封閉后的PVDF膜浸沒在一抗孵育液中，4℃孵育過夜，再將一抗孵育液漂洗干凈；⑦將漂洗后的PVDF膜浸沒在二抗孵育液中，37℃孵育1 h，再漂洗干凈；⑧在洗凈二抗孵育液的PVDF膜上滴加ECL顯影液，置于成像儀中顯影并攝片，觀察蛋白條帶。

1.7 心肌組織病理檢測

大鼠心臟經10%中性福爾馬林固定48 h后，進行常規沖洗，上行乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，連續切厚片（5μm）；再將切片進行常規二甲苯脫蠟、下行乙醇脫水HE染色，光學顯微鏡下（×400倍）觀察心肌組織形態學及病理變化并攝片。

1.8 統計學方法

本文實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理，計量資料的數據用xˉ±s表示，組間比較采用方差分析，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗進行處理。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丹蛭降糖膠囊對各組大鼠血糖、血脂的影響

如表1所示，造模后，與正常組相比，模型組大鼠血糖、HbA1c水平顯著升高（P＜0.01）。用藥8周后，與模型組相比，DJC高、低劑量組和吡格列酮組血糖、HbA1c水平明顯下降（P＜0.01）。與正常組相比，模型組TG、TC、LDL-C水平均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組相比，DJC高劑量組TG、TC、LDL-C水平均明顯降低（P＜0.01或P＜0.05）。吡格列酮組療效與DJC高劑量組相近，兩組比較無明顯差異（P＞0.05），相關分析提示TLR-4與血脂具有相關性，TLR4與TG的相關系數為0.420，與TC的相關系數為0.310。

表1 丹蛭降糖膠囊對血糖血脂的影響（n=8）

2.2 丹蛭降糖膠囊對各組大鼠心肌組織TRL-4、TNF-α及IL-8表達的影響

如表2所示，正常組心肌組織TLR4表達較少；與正常組相比，模型組大鼠心肌組織TLR4表達明顯增加（P＜0.01）；DJC灌胃8周后，與模型組相比，DJC高劑量組心肌組織TLR4表達明顯減少（P＜0.01）；低劑量DJC的療效弱于高劑量DJC（P＜0.05）。與吡格列酮組相比，DJC高劑量組心肌組織TLR4含量明顯增加（P＜0.05）。

與正常組相比，模型組大鼠心肌組織TNF-α、IL-8水平明顯升高（P＜0.01）。治療8周后，與模型組相比，DJC高、低劑量組TNF-α、IL-8表達明顯減少（P＜0.01或P＜0.05）；DJC高、低劑量組和西藥組相比無明顯差異。

2.3 各組大鼠心肌組織TRL-4、TNF-α和IL-8灰度值變化

如表3所示，造模后，與正常組相比，模型組心肌組織TRL-4、TNF-α和IL-8灰度值明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，DJC高、低劑量組和吡格列酮組心肌組織TRL-4、TNF-α和IL-8灰度值明顯下降（P＜0.01或P＜0.05）；與吡格列酮組比較，DJC高、低劑量組灰度值較高（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠心肌組織病理變化

圖1可見正常組心臟結構完整、清晰，心肌細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀規則排列，心肌纖維正常，細胞結構清晰，未見炎性細胞浸潤。模型組心肌細胞排列紊亂，細胞間隙增寬，心肌纖維出現斷裂、重排及變性壞死，心肌組織間隙見炎性細胞浸潤。DJC高劑量組心臟病理改變與模型組比較明顯減輕，心肌細胞形態基本正常，排列較整齊，心肌纖維無明顯的斷裂和變性壞死，有極少量炎性細胞浸潤。吡格列酮組的變化同DJC低組。改善程度弱于DJC高劑量組，心肌細胞形態基本正常，有少量炎性細胞浸潤。

表2 丹蛭降糖膠囊對心肌組織TRL-4、TNF-α和IL-8表達的影響（n=8）

表3 各組大鼠心肌組織TLR4、TNF-α、IL-8表達灰度值

圖1 DJC對糖尿病大鼠心臟病理的影響（HE×400）

2.5 各組大鼠心肌組織TLR4蛋白表達

經軟件分析獲得相應灰度值，以β-Actin為內參，計算TLR4蛋白的相對表達量（見圖2）。與正常組比較，模型組大鼠心肌組織TLR4蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，DJC高、低劑量組和吡格列酮組大鼠心肌組織TLR4蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01或P＜0.05）。DJC高、低劑量組與西藥組比較無明顯差異（P＞0.05）。詳見圖3。

2.6 丹蛭降糖膠囊對各組大鼠心肌組織TNF-α、IL-8蛋白表達的影響

如圖4所示，與正常組相比，模型組大鼠心肌組織TNF-α、IL-8蛋白含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，DJC高、低劑量組和吡格列酮組心肌組織TNF-α、 IL-8蛋白表達明顯減少（P＜0.01或P＜0.05）。

圖2 丹蛭降糖膠囊對大鼠心肌組織TLR4蛋白表達的影響

圖3 各組大鼠心肌組織TLR4蛋白表達

3 討論

目前糖尿病合并心肌病、冠心病的具體發病機制尚未完全闡明，但越來越多的研究表明糖代謝異常與心血管疾病可能存在共同的發病基礎。有學者指出，炎癥是冠心病與2型糖尿病共同的病理基礎，而糖尿病心肌病、冠心病既是一種心血管疾病，也是一種炎癥性疾病，其內在聯系是慢性炎癥這一共同的前期因子[1,4]。大量研究報道顯示，TLR4信號通路為炎性通路的重要組成部分，可能參與高血壓病、心室重構的發生發展，而TLR4刺激心臟增加了炎性因子的表達，包括：TNF-α、IL-6、IL-8等。這些炎癥因子正是導致心肌細胞損傷、心肌肥厚、心肌纖維化、心室重構的重要因素[1,2,4,6]。TLR4與人類動脈粥樣硬化的關系最為密切，作為新的炎癥信號傳遞門戶蛋白，是免疫反應、慢性炎癥、氧化應激、脂代謝紊亂、胰島素抵抗間的橋梁，激活TLR4可引起一系列炎癥反應，促進肥胖、動脈粥樣硬化等代謝性疾病的形成，最終激活TNF-α、IL-8、MCP-1等多種炎性因子的轉錄和合成，誘發各種炎癥反應。本研究觀察了DJC對糖尿病大鼠心肌組織TLR4、IL-8、TNF-α和心肌組織形態的影響。其中，模型組TLR-4表達量及灰度值的變化較正常組明顯升高，而DJC高、低組與吡咯列酮組明顯降低了TLR-4的表達量及灰度值，與模型組比較差異性顯著。進一步用Western Blot法進行測定，證明予DJC干預后，大鼠心臟TLR-4表達明顯減少，提示TLR4可能參與了糖尿病心肌病動脈硬化形成過程，引起一系列炎癥反應，使心肌細胞發生器質性病變，促進動脈粥樣硬化及糖尿病心肌病、冠心病的發生[5,6]。抑制心肌組織TLR4的高表達，有助于改善血管的氧化應激反應，改善炎癥反應造成的心肌缺血，降低下游相關炎癥介質的釋放，如：TNF-α、IL-8。

圖4 各組大鼠心肌組織TNF-α、IL-8表達情況

TNF-α是目前公認的炎性因子，由單核-巨噬細胞分泌，可使炎性細胞聚集、粘附，微血管擴張，誘發炎性反應[7,8]。本次實驗結果證實，模型組大鼠心肌組織TNF-α水平明顯高于正常對照組，藥物干預8周后，DJC高、低劑量組大鼠心肌組織TNF-α水平明顯降低，提示DJC可抑制糖尿病模型大鼠心臟TNF-α的高表達，證實DJC可抑制心臟TNF-α生成，減輕心肌組織炎癥反應。

IL-8也是由單核-巨噬細胞產生的一種細胞因子，使中性粒細胞趨化、脫顆粒、釋放溶酶，加強炎癥反應，在疾病發生發展中起重要作用，是一種典型的炎癥介質[9]。本次實驗結果顯示，糖尿病大鼠心肌組織IL-8表達明顯高于正常組，服用DJC后，心肌組織IL-8明顯降低，說明DJC可抑制炎癥因子IL-8的高表達，在糖尿病心肌病變中起到保護作用。

心肌組織病理學觀察提示，糖尿病大鼠心肌細胞排列紊亂，細胞間隙增寬，心肌纖維出現斷裂、重排和變性壞死，組織間隙見炎細胞浸潤；服用DJC后，心肌組織形態明顯改善，心肌細胞形態基本正常，排列比較整齊，心肌纖維無明顯的斷裂、變性壞死，僅有少量炎性細胞浸潤。以上再次說明DJC可減少促炎性細胞的形成，降低炎癥反應，減輕病理損傷，達到保護心臟的作用。

分析DJC的作用機制與本方的藥物組成相關，方中水蛭味咸、苦辛平，有破血通經、逐瘀消癥的功效。現代藥理證實水蛭能夠降低有形斑塊脂質，疏通血脈的功效；能降低血脂，祛除瘀血，對血液循環有明顯的調節和改善作用。水蛭還能降低甘油三酯，降低血粘度，凈化血液，祛除瘀血[10]。張競之等[11]研究表明丹皮對TLR4高表達有明顯抑制作用，早期呈劑量依賴性地阻斷炎癥反應，可作為TLR4的抑制劑，調控細胞內TLR4表達。生地有明確的抗炎作用，對鹿角菜膠所致的大鼠足部腫脹有顯著的抑制作用，能降低毛細血管通透性，甙類部分對炎癥的療效是通過抑制血小板聚集，抗病原微生物而發揮作用[12]。徐暉[13]研究證實澤瀉20 g·kg-1能明顯減輕二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹、抑制大鼠棉球肉芽組織增生，而對血清抗體含量及大鼠腎上腺內抗壞血酸含量無顯著影響。太子參具有提高免疫力的作用，大鼠在用藥之后左室指數顯著增加[14]。本文血糖血脂的療效，與以往的報道一致，DJC有明確的降糖調脂療效[15]。

綜上所述，本方對心臟的保護作用機制，可能是通過消除炎性細胞，降低心肌組織TLR4高表達，減輕心臟病理損傷，下調TNF-α和IL-8表達，調節代謝性疾病共同炎癥環境，降低血糖血脂，從而改善糖尿病心肌病變，并為臨床應用提供可靠的實驗及理論依據。

參考文獻

1陳潔,姜虹.TLR4信號通路與炎性反應.醫學綜述,2009,15(19)：2902-2904.

2申彥菊,劉鴻,陳青云.運動對糖尿病動脈硬化大鼠TOLL樣受體促炎通路的影響.中國糖尿病雜志,2015,23(10)：921-926.

3燕娟,郭巍偉,梁執群,等.2型糖尿病大鼠模型的建立及其驗證.臨床和實驗醫學雜志,2009,8(4)：5-6.

4劉亞坤,黃林靜,趙珊,等.血必凈注射液對缺氧/復氧大鼠心肌TLR4-NF-κВ-IL-1β通路的影響.中國應用生理學雜志,2014,30 (1)：55-59.

5李俊哲,何冠蘅,趙青武,等.護心方對冠心病合并糖代謝異常患者TLR-4炎癥通路和中醫血瘀證評分的影響.中華中醫藥學刊,2014, 32(10)：2475-2477.

6丁康.TLR4信號通路在高血壓治療中的研究進展.安徽醫科大學學報,2015,50(5)：719-722.

7馬曉玲,歐陽平.腫瘤壞死因子-α對乳鼠心臟成纖維細胞增殖及syndecan-4蛋白表達的影響.廣東藥學院學報,2013,29(2)：190-194.

8汪偉,李冬梅,李銳.口服低劑量混合稀土“常樂”對糖尿病大鼠心肌NF-κB和TNF-α表達的影響.毒理學雜志,2013,27(4)：284-287.

9劉虹,徐慶科,夏偉,等.冠心病與炎癥因子IL-6、IL-8、IL-10、hs-CRP及TNF的相關性研究.實用心腦肺血管病雜志,2011,19(9)：1446-1447.

10李艷玲,趙麗.水蛭及其炮制品的體內抗凝血活性研究.安徽農業科學,2009,37(34)：16894-16942.

11張競之,劉吉昌,范志勇,等.從丹皮酚對TLR-NF-κB信號通路的影響探討高血壓病血瘀證的形成機制.廣州中醫藥大學學報,2014,31 (3)：330-334.

12王浴生.中藥藥理與應用.北京：人民衛生出版社,1983：529-530.

13徐暉.澤瀉藥理作用研究進展.湖南中藥雜志,2004,20(3)：77-78.

14黎明.太子參的藥理研究及臨床應用.亞太傳統醫藥,2010,6(6)：25-26.

15李中南,程光亮,李莉,等.益氣養陰活血法對糖尿病模型大鼠單核細胞趨化因子及血漿纖溶酶原激活物抑制劑的影響.中國臨床保健,2013,16(4)：397-399.

Impactsof Dan Zhi Jiang Tang Capsuleon M yocardial TLR4,TNF-αand IL-8 and the Cardiopathologic Changes in Diabetic Rats

LiZhongnan,Cheng Lihua,Ma Chao,Dou Demei,Xing Yuting,Xing Yanyang
(The FirstAffiliated HospitalofAnhuiUniversity ofTraditionalChineseMedicine,Hefei230031,China)

This study chiefly aimed at investigating the effects of Dan Zhi Jiang Tang Capsule(DJC)onmyocardial Tolllike receptor 4(TLR4),tumor necrosis factorα(TNFα)and interleukin-8(IL-8)and the cardiopathologic changes in diabetic rats.Fiftymale rats,excluding 8 rats in the control group,had been administered with high fat forage for 4 weeks,which established the diabetic ratmodel combined with the intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)at 35mg·kg-1.The establishedmodel ratswere randomly divided into themodelgroup,the DJC high-dose group,the DJC low-dose group and the pioglitazone group.The rats in the model group and the control group were intragastrically administered with DJC at 1.08 and 0.54 g·kg-1each day,while those of the pioglitazone group were treated with pioglitazone at10mg·kg-1each day,and those of themodelgroup and controlgroup with saline of the same volume.The administrations lasted 8 weeks with the continues high-fat diet.The levels of TLR4,TNFαand IL-8 protein in myocardium of the rats were determined,and so were the blood glucose,HbA1cand blood lipids.Compared with the control group,the expressions ofmyocardial TLR4,TNFαand IL-8 in themodelgroup were significantly increased(P＜0.01).The expressionsof TLR4,TNFαand IL-8 in the DJChigh-dose and low-dose groupswere significantly decreased (P＜0.05 or P＜0.01).The cardiopathological report showed severe myocardial lesion in the model group.However, myocardial lesion in the DJChigh-dose group was significantlymitigated,which presented better therapeutic effects than the DJC low-dose group and the pioglitazone group.The levels of blood glucose,HbA1c,TG,TC,LDL-C in themodel group were significantly higher than those in the control group(P＜0.05 or P＜0.01).The levels of blood glucose,HbA1c,TG,TC and LDL-C were significantly decreased in the DJC high-dose and low-dose groups in comparison with the model group(P＜0.05 or P＜0.01).In conclusion,DJC down-regulated the expressions of TLR4,TNFαand IL-8 and improved the degree ofmyocardial lesion in the diabetic rats,showing favorablehypoglycemic and lipid-lowering effects.

Dan Zhi Jiang Tang Capsule,cardiopathology,Toll-like receptor 4,tumor necrosis factorα,interleukin-8

10.11842/wst.2017.02.022

R29

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-06-08

修回日期：2017-01-13

＊國家中醫藥管理局中醫臨床研究基地業務建設科研專項（JDZX2012004）：益氣養陰活血法對糖尿病亞臨床血管病變炎癥因子的機理研究，負責人：李中南。

＊＊通訊作者：李中南，主任醫師，主要研究方向：老年內分泌疾病和風濕病。