乳鐵蛋白在化妝品中的應用

李 謀，楊小琳，趙金禮

(陜西慧康生物科技有限責任公司，陜西 西安 710054)

乳鐵蛋白(Lactoferrin ,Lf)相對分子質量大小約為80kDa，是一種不依賴血紅素鐵離子結合的鐵離子結合糖蛋白，是轉鐵蛋白(Transferrin,Tf)家族的成員之一。1939年Sorense等首次發現牛乳鐵蛋白[1]，1960年Johanson等學者首次從人乳中分離得到人乳鐵蛋白[2]，乳汁中含有大量乳鐵蛋白，膽汁、唾液、眼淚等外分泌液中也檢測到乳鐵蛋白存在[3-5]。人乳汁中含有大量的乳鐵蛋白，其他哺乳動物亦同，但存在種屬差異。人乳鐵蛋白是人乳中含量最多的乳清蛋白，其含量高達2～4 mg/mL，初乳中達6～8 mg/mL[6]。研究表明乳鐵蛋白具有抗細菌[7]、抗真菌[7]、抗病毒[6]、抗炎[8]、抗氧化[9]、美白[10]、促進鐵離子吸收[11]等廣泛的生物功能，可應用于功能食品、化妝品、保健品及藥品等多種生物制劑的開發，而被研究者廣泛關注。

隨著經濟快速發展，越來越多的人開始注重生活品質的提升，美麗的容顏和不老的肌膚成為愛美人士的重要需求之一。安全、功效顯著的生物功能護膚品可滿足此類需求，而乳鐵蛋白具有豐富的生物學功能被認為是一種極具潛力的化妝品新原料。

1 乳鐵蛋白的生物學特征

1.1 乳鐵蛋白概述

人乳鐵蛋白是轉鐵蛋白家族成員之一，人乳鐵蛋白前體蛋白攜帶19個氨基酸的信號肽，信號肽可攜帶乳鐵蛋白蛋白分泌至胞外，隨后切除信號肽，成熟的人乳鐵蛋白由692個氨基酸組成。相對分子質量大小約80kDa，人乳鐵蛋白與血清轉鐵蛋白同源性達60%，二者氨基酸組成相似，二級結構相近，均具有較高的Fe3+鐵離子結合能力。

乳鐵蛋白由兩個同源性極高的葉片狀結構域N-葉和C-葉構成，N-葉包含氨基酸1～332，C-葉包含氨基酸344～692，N-葉和C-葉之間由333～343氨基酸組成的α螺旋構成的鉸鏈區連接，N-葉和C-葉均由α螺和β折疊組成，形成二級結構，被相應的分為N1、N2區和C1、C2區[12]，N-葉和C-葉均可結合Fe2+、Fe3+，乳鐵蛋白能夠可逆性地結合Fe3+離子和1個CO32-離子。也有研究報道乳鐵蛋白可結合Cu2+、Zn2+和Mn2+[13]。乳鐵蛋白內的Cys可形成分子內二硫鍵，N-葉和C-葉的Asn與乳鐵蛋白的糖基化相關[12]。

1.2 乳鐵蛋白熱穩定性

熱穩定性是活性蛋白重要理化性質之一，直接影響其是否可應用于下游制劑的開發及制劑開發過程中工藝參數的制定。研究發現，乳鐵蛋白85℃保溫10min，對其抑菌活性無影響，酸性條件下乳鐵蛋白的熱穩定性良好[15-16]。LUIS等研究發現，72℃保溫20s或135℃保溫8s幾乎不影響乳鐵蛋白的鐵結合能力[17]。但是，閆序東等的研究表明，乳鐵蛋白屬于熱敏性物質，過強的熱處理會降低乳鐵蛋白的抗菌活性和鐵結合活性，巴氏殺菌對乳鐵蛋白結構和抗菌、鐵結合活性影響不大[18]。加熱處理是否會對乳鐵蛋白的其它功能產生影響，尚待研究。

1.3 乳鐵蛋白的來源

乳鐵蛋白因其具有多種生物學功能，受到各領域學者的廣泛關注，如何獲得足量的乳鐵蛋白以便用于后續制劑的開發及應用是重要的研究課題。目前主要是從乳汁中提取、通過重組表達系統獲得乳鐵蛋白。

已有研究報道的乳鐵蛋白重組表達系統有細菌表達系統、真菌表達系統、轉基因植物、轉基因動物、動物細胞系表達系統。研究表明使用乳鐵蛋白重組表達系統獲得高產量的乳鐵蛋白是可行的。大腸桿菌表達系統可獲得17 mg/L的乳鐵蛋白[19]，畢赤酵母表達系統中最高可獲得1200 mg/L的乳鐵蛋白[20]，CHO細胞系表達系統可獲得200 mg/L的乳鐵蛋白[21]，轉基因羊可獲得30000 mg/L的乳鐵蛋白[22]。開發更高效的重組表達系統，尤其是具有產業化意義的乳鐵蛋白重組表達系統，對滿足乳鐵蛋白潛在的市場需求具有重要意義。

2 乳鐵蛋白的生物學功能

乳鐵蛋白廣泛存在于外分泌液中，具有豐富的生物學功能，已有研究報道乳鐵蛋白具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、促進成骨細胞膠原形成及抑制黑色素形成等功能。

2.1 抗菌

體內外研究表明，乳鐵蛋白具有廣泛的抑菌能力，被稱為體內第一道免疫防御，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、真菌均有抑制作用，對金色葡萄球菌、李斯特菌及肺炎球菌這些耐藥株亦有抑制作用，乳鐵蛋白對這些可整合到宿主細胞的流感嗜血桿菌和鏈球菌也能有效抑制。

目前認為乳鐵蛋白的抑菌機理是通過螯合鐵離子，競爭性地剝奪細菌生長所需要的鐵元素，從而抑制細菌的生長[23]；也有研究報道乳鐵蛋白通過與革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)結合，使得LPS從細菌細胞壁中滲漏，導致細菌崩解死亡[24-25]；另有報道乳鐵蛋白通過阻止G+性菌和G-性菌與宿主細胞結合，從而發揮抗菌功能[26]。

2.2 抗病毒

研究報道，乳鐵蛋白具有廣泛的抗病毒活性，其對RNA病毒和DNA病毒均有效[27]，可有效抵御多種病毒感染，如輪狀病毒、人免疫缺陷病毒、腸道病毒、腺病毒等。目前乳鐵蛋白抗病毒的機理尚不明確，主要的抗病毒機理假設為：乳鐵蛋白通過與病毒的粘多糖受體結合，與之結合的受體主要為硫酸肝素，從而阻止病毒和宿主細胞結合，產生抗病毒功能[28-29]。

2.3 抗炎

乳鐵蛋白可以結合脂多糖，預防炎癥途徑激活、敗血癥及組織損傷，參與機體天然免疫和獲得性免疫的調節，是重要的炎癥反應調節因子。Sfeir等研究報道，乳鐵蛋白可增加IgA的產生，增加血清IgG(2a)抗體和Th1細胞因子的分泌，調節粘膜免疫和T細胞介導的免疫應答[30]，具有降低免疫細胞的活化、遷移和生長的功能?？赡芘c乳鐵蛋白的靶標為帶負電荷的分子，這些負電分子如促炎的微生物分子、脂多糖、病毒DNA、蛋白聚糖鏈和表面細胞受體。乳鐵蛋白通過與上述受體相互作用，影響免疫細胞活化、分裂和遷移[31]。

2.4 抗氧化

戴亞妮等通過二苯代苦味肼基( DPPH) 自由基抑制率、羥基自由基抑制率、超氧陰離子自由基抑制率、還原能力和抑制大鼠肝臟體外脂質過氧化等試驗評價重組人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白的體外抗氧化性能，發現重組人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白具有抗氧化活性[32]。李婷等采用分光光度法測定乳鐵蛋白的脂質過氧化抑制率、羥自由基(·OH)清除率和DPPH自由基清除率，結果表明乳鐵蛋白對各種自由基的作用能力由大到小為：脂質過氧化抑制率>·OH清除率>DPPH自由基清除率[33]。提示乳鐵蛋白可作為天然抗氧化劑用于化妝品制劑開發。

2.5 促進膠原形成

周澤淵等研究表明，乳鐵蛋白可顯著促進MC3T3-E1細胞I型膠原蛋白(Col1)mRNA和蛋白的表達，加入ERK1/2通路抑制劑后，Col1顯著降低，提示乳鐵蛋白可能通過ERK1/2信號通路的傳導影響I型膠原蛋白的表達[34]。Yaonan等研究發現50～100 mg/mL的乳鐵蛋白在體外實驗中可促進膠原蛋白的形成，然而機理尚不明確，有待深入研究[35]。

2.6 抑制黑色素形成

宋薇等的專利中報道牛乳鐵蛋白和蝦青素聯合使用獲得了良好的美白效果，然而未提及美白機理[36]。Nanase等研究表明人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白抑制黑色素形成的效果相當，該研究團隊采用3D皮膚模型對乳鐵蛋白美白效果進行研究，結果表明，乳鐵蛋白可透過皮膚；乳鐵蛋白的美白效果具有劑量效應，可減少黑色素20%；乳鐵蛋白通過抑制小眼轉錄因子(MITF)，在轉錄水平抑制小眼轉錄因子mRNA形成，在蛋白水平降解MITF蛋白，降低黑色素形成限速酶-酪氨酸酶的活性，減少黑色素形成的數量實現美白功效[10]。

3 乳鐵蛋白在化妝品中的應用

乳鐵蛋白因具有廣泛的抗菌、抗炎、促進膠原蛋白形成及抑制黑素素形成的作用，可應用于相應功能化妝品的開發。戴亞妮等已經就重組人乳鐵蛋白對哺乳動物局部皮膚和眼睛的刺激作用、皮膚的光毒性進行考察，認為重組人乳鐵蛋白安全，對皮膚和眼睛均無刺激性且無光毒性[37]。于添等對基因重組乳鐵蛋白致畸效應進行考察，表明重組人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白為安全物質[38]。乳鐵蛋白作為一種安全物質且具有廣泛的生物學功能被認為是一種極具潛力的化妝品新原料，可作為多種效成分用于化妝品制劑的開發。

3.1 防腐劑

乳鐵蛋白具有廣譜的抗G+性菌、G-性菌及真菌、DNA病毒、RNA病毒等致病微生物的功能，且乳鐵蛋白為體內天然成分，可作為新型防腐劑用于化妝品制劑的開發。研究表明，乳鐵蛋白的抑菌效果和pH值密切相關，在pH值為7.5～8.0 時抑菌效果最佳。HCO32-濃度與乳鐵蛋白的抑菌活性成正相關；檸檬酸鈉和陽離子濃度與乳鐵蛋白的抑菌活性呈負相關。在50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液中，乳鐵蛋白喪失抑菌活性。宋薇等已經將乳鐵蛋白作為防腐成分與其它防腐劑配伍應用于化妝品的開發中[36]。但并見到將乳鐵蛋白作為化妝品制劑防腐劑的系統研究報告，乳貼蛋白在化妝品制劑開發中的應用濃度及其防腐配伍體系有待深入研究。

3.2 痤瘡治療

Kim等對36名受試者進行研究，受試者飲用含乳鐵蛋白200 mg的日劑量的發酵乳制品，發現乳鐵蛋白組與對照組比較可顯著降低痤瘡的等級，痤瘡體積顯著變小，但乳鐵蛋白組和對照組皮膚水合度和PH值無顯著差異[39]。Mueller等研究表明，39名受試者每次服用含牛乳鐵蛋白100 mg的咀嚼片，每日2次，8周后痤瘡程度顯著降低[40]。宋薇等的專利報道牛乳鐵蛋白制成的化妝品可預防和祛除痤瘡。但目前市場上尚未見到乳鐵蛋白類化妝品上市銷售。鑒于乳鐵蛋白具有良好的透皮性和廣譜的抗菌、抗炎功效，將乳鐵蛋白及其他具有抗菌、抗炎、調節皮脂腺分泌的生物活性分子如重組人溶菌酶、抗菌肽等活性成分組合，可望開發制得具有痤瘡治療功效且安全性高的新一代生物功能化妝品。

3.3 抗衰

膠原蛋白流失、膠原蛋白錯誤交聯是影響皮膚衰老進程的重要因素，文獻中報道乳鐵蛋白可促進細胞中膠原蛋白的合成，提示乳鐵蛋白可開發為抗衰老化妝品制劑，刺激機體合成膠原蛋白來彌補因年齡因素、疾病因素及外部環境因素引起的皮膚內膠原蛋白的流失，從而延緩肌膚衰老。但目前文獻報道的乳鐵蛋白促進膠原蛋白合成的功能僅局限于成骨細胞，未對成纖維細胞中乳鐵蛋白的功能進行研究。后續研究亟待明確乳鐵蛋白在成纖維細胞中對膠原蛋白合成是否有影響。

3.4 美白

宋薇等的專利中已經將乳鐵蛋白開發成化妝品，專利報道牛乳鐵蛋白和蝦青素為核心成分的化妝品美白效果顯著。Nanase等對乳鐵蛋白的美白機理進行深入研究，結果顯示乳鐵蛋白可抑制黑色素形成限速酶(酪氨酸酶)的活性，從而減少黑色素形成，雖然乳鐵蛋白的分子量較大，但3D皮膚模型測定結果顯示乳鐵蛋白的透皮性較好，開發為美白化妝品制劑可被有效吸收，研究結果顯示乳鐵蛋白可減少黑色素數量的20%。目前關于乳鐵蛋白美白化妝品制劑研究的報道較少，市場上尚無此類產品銷售，乳鐵蛋白美白制劑的開發市場潛力大。

4 展望

乳鐵蛋白作為天然活性分子，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、促進膠原蛋白合成及抑制黑色素形成等功效，被各領域學者廣泛關注。在化妝品領域被認為是極具潛力的化妝品新原料，可開發為多種功效無防腐劑化妝品制劑，具有廣闊的應用前景，對乳鐵蛋白功能進一步深入研究、并對其安全性持續監測，將促進乳鐵蛋白化妝品制劑的開發。

參考文獻

[1]Sorensen M,Sorensen S.The proteins in whey[J].Compte rendu des Travaux du Laboratoire de Carlsberg Ser Chim,1939,23:55-99.

[2]Johanson B.Isolation of an iron-containing red protein from human milk[J].Acta Chemica Scandinavica,1960,14:510-512.

[3]Iyer S,Lonnerdal B.Lactoferrin,lactoferrin receptors and iron metabolism[J].Eur J Clin Nutr,1993,47:232-241.

[4]Levay P F,Viljoen M.Lactoferrin: A general review[J].Haematologica,1995,80:252-267.

[5]Steijns J M.Milk ingredients as nutraceuticals[J].Int J Dairy Technol,2001,54:81-88.

[6]García-Montoya I A,Cendón T S,Arévalo-Gallegos S,et al.Lactoferrin a multiple bioactive protein: An overview[J].Biochim Biophys Acta,2012,1820(3):226-236.

[7]Hirai Y,Kawakata N,Satoh K,et al.Concentrations of lactoferrin and iron in human milk at different stages of lactation[J].Nutr Sci Vitaminol,1990,36:531.

[8]Teraguchi S,Wakabayashi H,Kuwata H,et al.Protection against infections by oral lactoferrin: Evaluation in animal models[J].Biometals,2004,17:231-234.

[9]Sakai T,Banno Y,Kato Y,et al.Pepsin-digested bovine lactoferrin induces apoptotic cell death with JNK/SAPK activation in oral cancer cells [J].Pharmacol Sci,2005,98:41-48.

[10]Ishii N,Ryu M,Suzuki Y A,et al.Lactoferrin inhibits melanogenesis by down-regulating MITF in melanoma cells and normalmelanocytes [J].Biochem Cell Biol,2017,95(1):119-125.

[11]Chen K,Zhang L,Li H,et al.Iron metabolism in infants:influence of bovine lactoferrin from iron-fortified formula[J].Nutrition,2015,31(2): 304-309.

[12]Shanbacher F L,Goodman R E,Talhouk R S.Bovine mammary lactoferrin: implications from messenger ribonucleic acid (mRNA) sequence and regulation contrary to other milk proteins[J].J Dairy Sci,1992;76:3812-3831.

[13]Van der Strate B W A,Belijaars L,Molema G,et al.Antiviral activities of lactoferrin [J].Antiviral Res,2001;52:225-239.

[14]Nagasako Y,Saito H,Tamura Y,et al.Iron-binding properties of bovine lactoferrin in iron-rich solution [J].J Dairy Sci,1993,76(7):1876-1881.

[15]Hiroaki A,Hitoshi S,Hiroshi M,et al.Heat stability of bovine lactoferrin at acidic pH[J].Dairy Sci,1991,74(1):65-71.

[16]Celia C,Carmen R,Eduardo C,et al.Effect of heat treatment on the antibacterial activity of bovine lactoferrin against three food borne pathogens [J].International Journal of Dairy Technology,2010,63(2):209-215.

[17]Luis M,Lourdes S,Denis R H,et al.Thermal denaturation of human lactoferrin and its effect on the ability to bind iron[J].Agric Food Chem,1998,46:3964-3970.

[18]閆序東,王彩云,云戰友.乳鐵蛋白熱穩定性研究[J].中國乳品工業,2014,42(4):18-20.

[19]Wang J R,Tian Z G,Teng D,et al.Expression and characterization of Kunming mice lactoferrin and its N-lobe[J].Biometals,2010,23(3):523-530.

[20]Jiang T M,Chen L J,Jia S Q,et al.High-level expression and production of human lactoferrin in Pichia pastoris[J].Dairy Sci Technol,2008,88(2):173-181.

[21]Blachier F,Tomé D.Effects of lactoferrin on intestinal epithelial cell growth and differentiation: an in vivo and in vitro study[J].Biometals,2014,27(5): 857-874.

[22]Yu H Q,Chen J Q,Sun W,et al.The dominant expression of functional human lactoferrin in transgenic cloned goats using a hybrid lactoferrin expression construct[J].J Biotechnol,2012,161(3):198-205.

[23]Sherman M P,Bennett S H,Hwang F F,et al.Neonatal small bowel epithelia: enhancing anti-bacterial defense with lactoferrin and lactobacillus GG[J].Biometals,2004,17(3): 285-289.

[24]Majerle A,Kidric J,Jerala R.Enhancement of antibacterial and lipopolysaccharide binding activities of a human lactoferrin peptide fragment by the addition of acyl chain[J].J Antimicrob Chemother,2003,51(5):1159-1165.

[25]Orsi N.The antimicrobial activity of lactoferrin: current status and perspectives[J].Biometals,2004,17(3):189-196.

[26]Ellison R T,Giehl T J,LaForce F M.Damage of the outer membrane of enteric gram-negative bacteria by lactoferrin and transferring[J].Infect Immun,1988,56(11):2774-2781.

[27]Ng T B,Cheung R C,Wong J H,et al.Antiviral activities of whey proteins[J].Appl Microbiol Biotechnol,2015,99(17):6997-7008.

[28]Hasegawa K,Motsuchi W,Tanaka S,et al.Inhibition with lactoferrin of in vitro infection with human herpes virus[J].Jpn J Med Sci Biol,1994,47(2):73-85.

[29]Seganti L,Di Biase A M,et al.Antiviral activity of lactoferrin towards naked viruses[J].Biometals,2004,17(3):295-299.

[30]Sfeir R M,Dubarry M,Boyaka P N,et al.The mode of oral bovine lactoferrin administration influences mucosal and systemic immune responses in mice[J].J Nutr,2004,134(2):403-409.

[31]Legrand D.Overview of lactoferrin as a natural immune modulator[J].J Pediatr,2016,173:S10-S15.

[32]戴亞妮,于 添,朱 松,等.重組人乳鐵蛋白抗氧化活性研究[J].中國食品衛生雜志,2017,9(3):251-256.

[33]李 婷,王彩云,閆序東,等.重組人乳鐵蛋白抗氧化活性研究[J].食品科學,2012,33(21):111-113,193-197.

[34]周澤淵,楊禎瑾,黃 鸝,等.乳鐵蛋白及張應力對成骨細胞成骨功能影響的實驗研究[J].現代口腔醫學雜志,2017,31(4):193-197.

[35]Zhang Yaonan,Wang Xiao,Qiu Yiwei,et al.Effect of indomethacin and lactoferrin on human tenocyte proliferation and collagen formation in vitro[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,454(2):301-307.

[36]宋 薇.一種含牛乳鐵蛋白的化妝品:中國,201410036850.7[P].2014-01-26.

[37]戴亞妮,楊雪珍,王建武,等.重組人乳鐵蛋白作為化妝品新原料的安全性評價[J].中國衛生檢驗雜志,2017,27(13):1851-1854.

[38]于 添,劉 燊,王建武,等.重組人乳鐵蛋白大鼠致畸試驗[J].毒理學雜志,2017,31(3):247-250.

[39]Kim J,Ko Y,Park Y K,et al.Dietary effect of lactoferrin-enriched fermented milk on skin surface lipid and clinical improvement of acne vulgaris[J].Nutrition,2010,26(9):902-909.

[40]Mueller E A,Trapp S,Frentzel A,et al.Efficacy and tolerability of oral lactoferrin supplementation in mild to moderate acne vulgaris: An exploratory study[J].Curr Med Res Opin,2001,27(4):793-797.