淬火溫度對瓊膠多糖凝膠過程的影響

代博娜， 鄒亞娟， 吳節莉

(上海交通大學 分析測試中心，上海 200240)

淬火溫度對瓊膠多糖凝膠過程的影響

代博娜， 鄒亞娟， 吳節莉

(上海交通大學 分析測試中心，上海 200240)

為表征瓊膠多糖溶液在淬火后形成凝膠過程中分子構象的變化，提出脈沖梯度場核磁共振技術表征的新手段。通過測量溶液中瓊膠多糖分子的質子信號強度和自擴散系數的變化，考察了淬火溫度對瓊膠多糖形成凝膠過程影響。研究發現，淬火發生30 min內，多糖質子信號強度及自擴散系數都急劇減小，而后在恒溫測量(0.5～18 h)期間，多糖質子信號強度進一步減小。在恒溫測量(0.5～18 h)期間，當淬火溫度接近凝膠轉變溫度時，瓊膠多糖分子的自擴散系數變大，而當淬火溫度低于凝膠轉變溫度時，瓊膠多糖的自擴散系數會減小。結果表明：淬火發生后凝膠分兩步形成：首先，多糖分子形成聚合物網狀結構；其次，隨著時間的推移，越來越多的多糖分子進入到聚合物網狀結構。如果淬火溫度低于凝膠轉變溫度，體系的變化快而顯著。

瓊膠； 脈沖梯度場核磁共振； 自擴散系數； 凝膠； 淬火溫度

0 引 言

瓊膠是從紅藻中提取的一種親水性膠體，通常可稱為瓊脂、洋菜、凍粉等，英文名Agar或Agar-agar[1-2]。瓊膠是一種復雜的水溶性多糖，由瓊脂糖和硫瓊膠兩部分組成。瓊脂糖是一種中性多糖且具有極強的凝膠能力，而硫瓊膠是一種陰離子型多糖，不易形成凝膠。瓊膠高溫時可以在水中溶解，低溫下會形成凝膠。瓊膠因其良好及穩定的凝膠特性而廣泛應用在食品工業。形成凝膠的多糖類對改善食品的質地起著重要的作用[3-4]，對其凝膠機理的研究是開發相同類型水凝膠的基礎，同時也是對該體系的各方面性能進行改進的前提。目前對多糖水凝膠的研究主要是從流變學、生物學和形貌學的角度[5-8]，這些對說明凝膠機理有一定局限性，所以對其分子水平機理的研究是十分必要的。

核磁共振(NMR)技術廣泛應用于研究多糖水凝膠，其中，應用核磁共振氫譜(1H NMR)可以確定體系的凝膠溫度，即可通過相關組分化學位移或信號強度變化的拐點來確定體系的凝膠轉變溫度[9-11]；應用弛豫時間測量技術[12-16]可以從分子水平對凝膠內水分子的存在狀態、與高聚物的相互作用進行系統深入的研究；而利用脈沖梯度場(PFG)NMR技術[17-21]不僅可以從分子水平研究凝膠機理，還可以通過觀測探測分子在凝膠中的擴散行為，評價凝膠的網孔尺寸等探究多糖水凝膠的微觀構象。

本文應用PFG-NMR技術研究不同淬火溫度對瓊膠溶液形成凝膠過程中微觀結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓊膠(BA-10，Mw=3.44×105g/mol，Ina Food Industry Co. Ltd.，Nagano， Japan)。

1.2 儀器與設備

Bruker Avance II 400WB超導核磁共振波譜儀；HLC-8120 GPC(Tosoh Co. Ltd， Japan)。

1.3 方 法

1.3.1 NMR樣品制備

將瓊膠粉末分散在D2O里室溫下攪拌過夜，然后在95 °C下保溫6 h直至樣品完全溶解，最后將所得溶液快速轉移到預熱過的10 mm核磁管中，并控制核磁管中溶液高度不超過1 cm。實驗結束后，樣品在105 °C的烘箱里干燥12 h后稱重以確定瓊膠溶液中瓊膠的質量百分比。

1.3.2 GPC樣品制備

將適量瓊膠粉末置于去離子水中，95 °C溶解制備約0.1%的瓊膠溶液用于GPC實驗以測定瓊膠的相對分子質量。在可以編程控溫的烘箱中(室溫)對瓊膠溶液進行淬火處理制備瓊膠凝膠，粉碎，10 500 r/min離心15 min，取上清液用于GPC實驗以測定瓊膠凝膠中處于溶液狀態的瓊膠的相對分子質量分布情況。

1.4 NMR實驗

溶液NMR實驗采用Bruker Avance II 400WB核磁共振波譜儀，其1H的共振頻率為400.13 MHz，梯度場處于z方向上。擴散實驗所用脈沖序列為PFG-STE，見圖1。第1及第2個90°脈沖之間的間隔τ2、第2及第3個90°脈沖之間的間隔τ1分別為2.12和7.85 ms。實驗采用溫控系統為BVT 3200，溫度由放置在核磁管中的光纖溫度計(Takaoka Electric Manufacturing Co.)測定，示意圖見圖2，溫控誤差±0.1 K。實驗溫度由80 °C直接降到45 °C、34 °C及23 °C恒溫30 min后開始第1次采樣，而后每隔1.5 h采1次樣直至第18 h最后一次采樣實驗結束。實驗中1H的90°脈沖的寬度16 μs，弛豫延遲時間5 s，采樣次數32，采樣點數8 192。自擴散系數由下式計算[22-23]：

其中：I(g)和I(0)分別為t=2τ2+τ1梯度脈沖存在及梯度脈沖為零時1H的信號強度；γ為1H的磁旋比；脈沖梯度場寬度δ為1 ms；擴散時間Δ為10 ms；脈沖梯度場強度g從2.0 T/m逐步(分8次)等間隔遞增到8.0 T/m。1H化學位移以HDO質子信號(25 °C，相對于DSS為δ4.70)為標準設定。

圖1 PFG-STE 脈沖序列

圖2 待測樣品示意圖

1.5 GPC實驗

所有樣品在實驗前都經0.45 μm濾膜過濾。實驗所用流動相為0.1 mol/L NaCl，實驗溫度為30 °C，流速1.0 mL/min，以普魯蘭(pullulan)多糖標樣繪制校正曲線。

2 結果與分析

2.1 溶液中瓊膠多糖質子信號強度的變化

由圖3(a)可見，分子擴散運動引起NMR信號強度的衰減，與梯度脈沖的脈寬δ、強度g及分子的自擴散系數D有關。我們將脈沖梯度場的強度從2.0 T/m逐步(分8次)等間隔遞增到 8.0 T/m，記錄一系列相應的1D1H NMR譜，然后對δ(3.0～5.8)×10-6的譜峰進行積分。由圖3(b)可見，盡管瓊膠多糖的相對分子質量分布存在一定的范圍，但實驗所用樣品在所有時刻的實驗數據都是呈線性分布的，因此，得到3組平均自擴散系數值Dagar，并獲得質子信號強度值Iagar(0)。所有的Iagar(0)值都基于相應樣品在80 °C時的Iagar(0)值進行了歸一化。

(a)

(b)

圖3 (a) 2.0%瓊膠溶液在80 °C時的1H堆積譜；(b)γ2g2δ2(Δ-δ/3)對積分強度的自然對數值作圖

BA-10瓊膠多糖溶液在質量濃度為2.0%左右時的凝膠溫度為45 °C[21]。在溶液狀態，瓊膠多糖分子以無序的無規線團形式存在，分子鏈段的運動是自由的。瓊膠多糖分子的橫向弛豫時間T2在81～103 ms(遠大于2τ2，約4 ms)，縱向弛豫時間T1在1 s左右(遠大于τ1，約8 ms)。在PFG-STE實驗中，多糖分子質子信號強度在回波時間2τ2+τ1內因弛豫引起的衰減很少。當瓊膠多糖分子形成雙螺旋的剛性結構后，分子鏈段運動受阻，其弛豫時間變短，低于回波時間2τ2+τ1，在PFG-STE實驗中這些多糖分子信號在回波時間內衰減為零，儀器將無法采集到這些多糖分子的質子信號。

從圖4可知，3條Iagar(0)曲線在溶液溫度從80 °C驟降至目標溫度后，最初的30 min都呈現一個大幅的減少。這說明當瓊膠多糖溶液的溫度驟降到凝膠轉變溫度附近或低于凝膠轉變溫度時，凝膠開始形成，分子鏈長的多糖分子經歷從無序的無歸線團到有序的雙螺旋的構象轉換過程之后，并于分子鏈之間產生氫鍵作用和分子纏結，形成交聯點，最終形成聚合物網狀結構。聚合物網狀結構是剛性的，多糖分子鏈運動受限，相應質子信號在回波時間內衰減為零，所以實驗所能檢測到的仍處于溶液狀態中的多糖分子的信號Iagar(0)變小。由圖4可以發現，淬火溫度越低，初期形成網狀結構的瓊膠多糖分子越多。在凝膠恒溫保存至18 h的時間里，越來越多的瓊膠多糖分子參與到網狀結構中，到第18 h，淬火溫度為34 °C及23 °C的兩份瓊膠溶液，約90%的瓊膠多糖分子已經形成聚合物網狀結構，而淬火溫度為45 °C的瓊膠溶液，約45%的瓊膠多糖分子還處于溶液狀態。

圖4 瓊膠溶液中瓊膠多糖的1H時相圖

2.2 溶液中瓊膠多糖分子自擴散系數的變化

在淬火發生后30 min時，多糖分子的自擴散系數都驟降，這是由于溫度驟降造成的。而在恒溫保存期間，淬火溫度為34 °C及23 °C的兩份瓊膠溶液中，多糖的Dagar數據雖然有些分散，但整體趨勢有略微減小，由此可推測在約90%的瓊膠多糖分子已經形成聚合物網狀結構之后，有些瓊膠多糖分子形成了松散的聚集體但仍處于溶液狀態[21]，使得處于溶液狀態中的多糖運動變慢。而淬火溫度為45 °C的瓊膠溶液中多糖的自擴散系數Dagar略有增大，表明在越來越多的多糖分子形成聚合物網絡結構留在溶液狀態的分子越來越少的同時，多糖分子運動變快。這與從凝膠中提取的水相中多糖的相對分子質量分布情況一致。與原始的瓊膠多糖分子大小相比(見圖5)，凝膠中仍處于溶液狀態的瓊膠多糖相對分子質量都有減小，而從淬火溫度為45 °C的凝膠中提取的水相多糖相對分子質量較另外兩組要偏大些。

圖5 BA-10瓊膠及從其凝膠中提取的液相的瓊膠相對分子質量分布圖

3 結 語

脈沖梯度場核磁共振實驗結果表明，淬火發生后，瓊膠多糖凝膠的聚合物網狀結構很快形成。凝膠在恒溫保存時間內，越來越多的多糖分子加入到網狀結構之中。當淬火溫度低于凝膠轉變溫度時，凝膠的聚合物網狀結構更快形成，留在溶液中的多糖分子也越少。

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堅持以人為本、推進素質教育是教育改革發展的戰略主題，是貫徹黨的教育方針的時代要求，核心是解決好培養什么人、怎樣培養人的重大問題，重點是面向全體學生、促進學生全面發展，著力提高學生服務國家人民的社會責任感、勇于探索的創新精神和善于解決總是的實踐能力。

——摘自《國家中長期教育改革和發展規劃綱要(2010—2020年)》

Pulse Field Gradient NMR Studies on the Gelation Mechanism in Agar Solutions by Different Quenching Temperatures

DAIBo-na，ZOUYa-juan，WUJie-li

(Instrumental Analysis Center，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240, China)

Changes in the molecular mobility of agar were measured by pulsed-field-gradient stimulated echo (PFG-STE)1H NMR after quenching, in order to elucidate the effect of different quenching temperature on gelation in agar solutions. Both the echo signal intensity of agarIagar(0) and the diffusion coefficient of agarDagarshowed a steep decrease during the initial cooling stage (in the first ca. 30 minutes) andIagar(0) decreased further with time going by，whileDagarincreased a little after quenching occurred at aroundTs-gand decreased a little when quenching temperature was belowTs-g. These results suggested that the gelation occurred in two stages：firstly the polysaccharide chains in agar aggregated into bundles to form a network when quenching happened. And then more and more agar chains were involved into the network. Changes became more rapidly and more obviously while the quenching temperatures was belowTs-g.

agar； pulse field gradient nuclear magnetic resonance (PFG NMR)； diffusion coefficient； gelation； quenching temperature

2016-04-07

上海交通大學科技創新專項—青年教師科研起步(AF4040006)

代博娜(1981-)，女，博士，工程師，研究方向：核磁共振在化學、生物學中的應用。

Tel.：021-34206175/34206173-116；E-mail：daibona@sjtu.edu.cn

TS 201.7

A

1006-7167(2017)01-0042-04