重離子所致DNA雙鏈斷裂損傷修復的γH2AX焦點響應

隋 麗，王 豫，關 華，孔福全，周平坤

（1.中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所，北京100850；2.中國原子能科學研究院，北京102413）

·基礎研究·

重離子所致DNA雙鏈斷裂損傷修復的γH2AX焦點響應

隋 麗1，2，王 豫1，關 華1，孔福全2，周平坤1

（1.中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所，北京100850；2.中國原子能科學研究院，北京102413）

DNA雙鏈斷裂（DSB）是電離輻射所致基因組DNA的主要和最嚴重的損傷類型，磷酸化組蛋白γH2AX能比較特異地在DSB處形成焦點，是DSB的分子標志物之一。比較了重離子7Li、12C與γ射線輻照小鼠MEF細胞誘發γH2AX焦點的規律特征。結果顯示，誘發形成的平均每個細胞的γH2AX焦點數目與照后時間相關，表達峰值出現在照后2 h，但不同類型輻射高表達的持續時間不同。在相同劑量下，致焦點形成率與輻射的LET值相關，LET值越高，形成率越大。γ射線誘發的γH2AX焦點尺寸隨照后時間無明顯變化，高LET重離子誘發的γH2AX焦點尺寸隨時間變化先增加后減小；與低LET的γ射線相比，高LET輻射誘發的焦點平均尺寸明顯變大，LET越高焦點尺寸越大且保持時間越長。

基因組穩定性；DNA雙鏈斷裂；DNA修復；磷酸化組蛋白H2AX聚焦點；重離子；γ射線

1 引言

基因組DNA是放射損傷的關鍵靶，DNA損傷是引發包括早期確定效應或組織反應和遠后致癌效應在內的健康危害的放射生物學原初效應［1］。DNA雙鏈斷裂（DNA Double?Strand Break，DSB）是電離輻射誘發的眾多DNA損傷中最為關鍵的一種，它的正確和完全修復可保證細胞的存活和基因組的穩定，而錯誤修復和殘余DNA損傷將導致細胞的死亡、突變和發生惡性轉化［2?4］。當DSB發生時，與基因組DNA密切接觸的組蛋白H2AX在其 SQE基序上的第139絲氨酸迅速發生磷酸化修飾，并聚焦于 DSB處，在數量上與DSB位點形成一一對應的磷酸化H2AX焦點，即γH2AX foci［5?8］。因此，通過γH2AX特異性抗體和分子免疫熒光激光共聚焦技術檢測γH2AX，可以確定細胞中DNA雙鏈斷裂損傷的發生和修復情況。進一步通過激光共聚焦顯微鏡的斷層掃描優勢，可克服非焦平面及焦平面非焦點光斑信息，提高分辨率和圖像清晰度，實現在細胞中的精確定位、定量和斑點尺寸變化規律的分析。借助此技術，本文研究比較了重離子與γ射線照射小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）誘發的DNA雙鏈斷裂損傷修復及γH2AX焦點的尺寸效應。

2 實驗材料與方法

2.1細胞培養

實驗采用小鼠胚胎成纖維細胞（MEF），由美國哥倫比亞大學放射生物學中心Tom Hei教授提供，本實驗室保存。細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養液、飽和濕度、37℃恒溫和5%二氧化碳的培養箱中培養。DMEM和胎牛血清均購自Hyclone公司。為了便于免疫熒光實驗，輻照前24小時將細胞接種和生長于蓋玻片上。

2.2細胞輻照

實驗分別使用2 Gy劑量的12C離子、7Li離子和γ射線輻照細胞。

12C離子輻照在中國科學院近代物理研究所的重離子加速器上進行，離子的能量為300 MeV／u，對應在水中的LET值為12.6 keV／μm，射程約為15 cm，劑量率為0.35 Gy／min。因為粒子束流為水平出射，所以在輻照前先將置有細胞爬片的培養皿中的培養液倒掉，再將培養皿面向束流接受輻照，輻照完畢后立即加入培養液繼續進行培養。

7Li離子輻照在中國原子能科學研究院的HI?13串列加速器裝置上進行，離子的能量為37.3 MeV，對應在水中的LET值為70.2 keV／μm，射程約為300 μm，劑量率為0.33 Gy／min。

γ射線（LET為0.2 keV／μm）輻照在軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所60Co輻照裝置上進行，樣品輻照方法同重離子照射，輻照劑量率為0.22 Gy／min。

2.3 γH2AX的免疫熒光檢測及定量分析

細胞受照后立即置于37℃恒溫、飽和濕度的5%二氧化碳培養箱中繼續培養。在照后0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h和24 h的不同時間點收取長有細胞的玻片，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，用4℃預冷的 4%多聚甲醛固定過夜。PBS洗 3× 10 min，0.3%Triton?100冰上透化15 min，然后使用3%的胎牛血清白蛋白（BSA）封閉1 h，再用抗γH2AX的一抗（購自 Upstate）按1∶200稀釋后4℃孵浴過夜，1%BSA洗3×5 min。接著使用熒光標記的山羊抗小鼠二抗（FITC）按1：1000稀釋后室溫孵育1 h，再用PBS洗3×5 min，DAPI對細胞樣品染色5 min，PBS洗3×5 min，10%甘油封片，最后用掃描激光共聚焦顯微鏡40×物鏡觀察γH2AX焦點。對于每一個樣品，均隨機選取5個不同區域進行掃描成像，細胞統計數不少于100個。每個細胞核內的γH2AX焦點同時使用人工和Image J（National Institutes of Health）圖像分析軟件兩種方法進行統計，以驗證結果的可靠性。每個γH2AX焦點的大小由Image J軟件定量得到。

2.4統計學分析

實驗結果中所有數據用SPSS統計軟件進行統計學處理，組間比較采用方差分析及t檢驗進行統計分析，所有統計結果均以平均數±標準方差表示。

3 結果與討論

3.1 γ射線、12C和7Li重離子照射細胞誘發γH2AX焦點的變化規律

圖1（a）為激光共聚焦掃描顯微鏡觀測到的小鼠成纖維細胞MEF在2 Gy γ射線輻照后0.5～24 h不同時間點的γH2AX焦點變化情況。從圖中可以直觀地看到，與對照細胞相比，照后0.5 h細胞中的γH2AX焦點數量就有了明顯增多。隨著時間的增加，γH2AX焦點的表達出現先增后減的變化趨勢。而且，輻照后細胞核中的γH2AX焦點基本呈現為均勻和分散的分布規律，即使在焦點數很多的細胞中也是如此，體現了γ射線稀疏電離輻射的特性。

對不同時間點細胞樣品中的γH2AX焦點和細胞數進行統計，得到了平均每個細胞中γH2AX焦點隨時間的變化情況（圖1（b））。在照后0.5 h焦點數就增加到了1.54個，約為對照樣品中的13倍。隨著時間的推移，焦點數繼續上升，至2 h時達到最大值2.4個，之后開始下降，但趨勢極為緩慢，到24 h時基本恢復到本底水平，尤其在8 h之后至24 h進入比較全面的修復階段。

以每個細胞中的γH2AX焦點數為統計對象，得到了細胞中焦點數量的分布情況。圖1（c）給出了輻照后0.5 h、2 h和8 h的不同γH2AX焦點數細胞的分布圖。可以看到，對于這三個時間點來說，有45%～50%的細胞沒有觀察到γH2AX焦點。每個細胞中形成的焦點數量，以1～3個為最多，占到了25%～35%。其次是4～6個和7～9個，分別占到了10%～15%和4%～5%，其中8 h點略占優勢。數量介于10～15個的在2 h和8 h時出現，比例為3%～5%，其中2 h點比例略高于8 h。而數量大于19的只出現在2 h，且僅占了不到1%。由此可見，從2 h到8 h這段時間內，每個細胞中的焦點數量在逐漸減少，這一變化趨勢暗示了細胞的緩慢修復過程。此外，對于γ射線輻照后每一個時間點來說，焦點數量越少的細胞在細胞總數中占的比例越多。

圖2給出了12C重離子以2 Gy劑量輻照MEF細胞后，在0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h和24 h的不同時間點，細胞中γH2AX焦點的變化情況。由圖2（a）可見，γH2AX焦點直觀圖像的變化趨勢與γ射線類似，即隨著時間的推移，呈現先增加后減少的變化規律。但在相同時刻，與γ射線相比，形成焦點的數量多、尺寸大。而且焦點多在核內的局部區域成簇出現，與γ射線誘發的均勻和分散的分布規律截然不同。

圖2 （b）為12C離子輻照后，每個細胞平均γH2AX焦點數隨照后時間變化的動力學曲線。從整體變化趨勢看，它與γ射線誘發的相同，即焦點數量先增加而后減少。形成的焦點數量上，在2 h之前（含2 h）各時間點和24 h高于γ射線，但在4～8 h期間又低于γ射線，而且與其自己的2 h點相比，4 h點數量減少了28%。很明顯，12C離子輻照后24 h，細胞中焦點的數量相對較高，提示12C離子由于其高能和高 LET值，在局部范圍內電離密度較高，可能會形成相對多的不易修復的簇集DSB，導致DNA殘留損傷的增加。

圖2（c）為12C離子輻照后0.5 h、2 h和8 h單個細胞中形成的γH2AX焦點數量的細胞分布圖。從整體看，分布規律與 γ射線的相似，焦點數集中于柱狀圖的左側，即較少焦點區域。不同之處是，在2 h和8 h點，無 γH2AX焦點的細胞所占比例減少了25%。而且形成的γH2AX焦點數量在1～18個范圍內分布，同比所占比例明顯高于γ射線產生的，尤其是在照射后8 h出現一個含有16～18個焦點數細胞分布次高峰期。這說明12C離子在細胞核單位面積上誘發的γH2AX焦點數更多，反映出了高能量的12C離子在穿過細胞時，沉積的能量強于γ輻射。此外，重離子還有可能干擾了細胞的氧化應激系統，致使局部產生代謝性高濃度的自由基，導致繼發性 DNA損傷的發生。

圖3（a）給出了7Li離子以2 Gy劑量輻照MEF細胞后，在0.15 h、0.5 h、1 h、2 h、8 h和24 h的不同時間點，細胞中γH2AX焦點的觀察結果。可見，焦點量的變化趨勢與 γ射線和12C離子類似，即隨著時間的推移，呈現先增加后減少的變化規律。但在相同時刻，與 γ射線甚至12C離子相比，形成焦點的數量多，尺寸大。而且焦點多在核內的局部區域成簇出現，有些甚至呈斑塊狀。

圖3 （b）為7Li離子輻照后不同時間點，平均每個細胞中γH2AX焦點數的定量結果。如圖所示，焦點數在照后0.25 h就激增到了2.2個，接近γ射線的最高表達水平。隨著時間的增長，焦點數急劇上升，到2 h時達到峰值，約為0.25 h時的3倍，γ射線相同時間點的2.8倍，隨后開始逐漸減少，8 h時減為峰值的83%。之后繼續減少，至24 h時變為0.24個，約為本底水平和γ射線相同時間點的2倍。γH2AX焦點數在照后0.25～2 h急劇增加現象的一種可能解釋是，在7Li輻照后的細胞中，存在大量的非雙鏈斷裂DNA集簇性損傷，這些損傷在細胞的修復過程中雙鏈DNA的兩條在相臨近的位點被同時切割而轉化為新的雙鏈斷裂，隨著時間的延長，這些損傷又被逐漸修復，因而又出現逐漸減少的現象，體現了細胞中針對復雜的集簇損傷的修復機制的存在。

圖3（c）為7Li離子輻照后0.5 h、2 h和8 h單個細胞中形成的γH2AX焦點數量的細胞分布圖。對于2 h僅有6%沒有出現焦點，表明此時絕大多數細胞中的DNA都發生了雙鏈斷裂。而且2 h與其它兩個時間點相比，焦點數的分布區間明顯后移，表明2 h時刻每個細胞中出現了更多的焦點，由圖中可見僅在數量為1～3個或16～18個的范圍內的細胞略少，其它各處均高于另外兩點，特別是表達7～15個和19～21個焦點數的細胞明顯較多。8 h與0.5 h相比，出現γ?H2AX焦點的細胞有所增多，且γ?H2AX數量為7～21個的細胞顯著多于0.5 h。與γ射線相比，7Li離子輻照后，各時間點未出現γ?H2AX焦點的細胞明顯減少，這是因為7Li離子是具有高LET的射線，相比低LET的γ射線而言，它的徑跡結構復雜，局部劑量大，通過自由基攻擊和細胞間信號傳遞能誘發更多的細胞DNA發生雙鏈斷裂。

3.2重離子與γ射線誘發γH2AX焦點尺寸大小的變化規律

DNA依賴蛋白激酶（DNA?PK）是DNA損傷應答和雙鏈斷裂修復中的一個關鍵分子，有研究報道，在缺乏DNA?PK激酶活性的細胞中觀察到高LET輻射誘發大尺寸的γH2AX焦點的存在，但其詳細的產生和變化規律及生物意義尚不清楚［7］。圖4（a）為2 Gy γ射線輻照后0.5 h、2 h和8 h時，細胞中不同大小尺寸γH2AX焦點的分布規律。可見，在這三個時間點，70%的焦點分布在0.8 μm2以下，并以0.2～0.4 μm2的較小焦點為最多，約達到了總焦點數的一半或一半以上。尺寸在1.0～1.8 μm2的中等大小和大于2 μm2的較大焦點也有出現，所占比例依時間不同而有所差別，2 h時刻最多，其次是 8 h和 0.5 h。0.5 h、2 h和8 h三個不同時間點的γH2AX焦點尺寸大小的平均值沒有差別（圖4（b））。

2 Gy12C離子輻照后細胞中γH2AX焦點大小的分布如圖4（c）所示。與γ射線相比，大于1 μm2以上的焦點有所增多，特別是在2 h時間點出現了較多的大于2 μm2的焦點。圖4（d）為12C離子誘發γH2AX焦點的平均尺寸的測量結果，表明形成焦點的平均最大尺寸約為γ射線的1.5倍。γH2AX焦點尺寸大小的差異，很可能與重離子誘發的DNA雙鏈斷裂為復雜的集簇性損傷有關。γH2AX焦點尺寸大小可成為表征細胞修復和輻射敏感性的一個生物學參數。

圖4 （e）和（f）給出了7Li離子輻照后0.5 h、2 h和8 h細胞中γH2AX焦點大小的分布情況。同樣，與γ射線的結果相比，在相同時間點，7Li離子輻照后的焦點大小的分布譜明顯向較大尺寸方向移動，而且分布譜的范圍變寬，在大于2 μm2的范圍出現了峰值，以2 h點最多，達到了約25%，其次是0.5 h和8 h，相同時間點在比例上較γ射線增加了2倍多，在具體尺寸上也顯著增大。這些大尺寸焦點是7Li離子徑跡直接誘發產生的，每一個焦點代表了一個集簇性基因組DNA損傷。而那些小尺寸的焦點，則可能是由δ射線、次級粒子或旁效應誘發而成。另外，結果還顯示，對于7Li離子來說，8 h時焦點尺寸有向較小尺寸變化的趨勢，提示細胞進入了損傷修復階段。細胞中焦點的平均尺寸的結果如圖4（f）所示，可見，焦點大小呈現為明顯地先增后減的趨勢，從0.5 h的1.1 μm2增加到2 h的2.0 μm2，至8 h點降為1.2 μm2，表明了雙鏈斷裂損傷開始產生、加重到緩慢修復的反應過程。與γ射線相比，相同時間處7Li離子誘發形成的焦點的平均尺寸要大，尤其是在2 h點，約為γ射線的2.2倍。與12C離子相比，在分析的這三個時間點，誘發的效應整體較大，大尺寸焦點的形成率也明顯多。此外，與低LET的γ射線不同，7Li離子輻照后形成的焦點在數量和大小上均具有時間響應，12C離子輻照也產生類型的效應現象，表明了高LET輻射與細胞中DNA相互作用的不同機制。

4 結論

本研究通過免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡掃描技術，觀測了不同LET值的7Li（70.2 keV／μm）、12C（12.6 keV／μm）和γ射線（0.2 keV／μm）輻照MEF細胞誘發γH2AX聚焦點及DNA雙鏈斷裂損傷修復的效應規律。與低LET的γ射線相比，具有較高LET的12C離子和高LET的7Li離子誘發的DNA雙鏈斷裂的損傷更嚴重。本研究從γH2AX焦點大小變化，描述了不同類型輻射誘發DNA雙鏈斷裂損傷點即電離輻射誘發焦點（IRIF）的尺寸效應。2 Gy不同品質射線（包括7Li、12C和γ射線）輻照MEF細胞后，誘發形成的平均每個細胞的γH2AX焦點數具有時間響應性，最大值均出現在照后2 h，效應的強弱依次為7Li離子＞12C離子＞γ射線。不同射線誘發的γH2AX焦點高表達持續時間不同，γH2AX焦點大小與LET值相關，LET越高誘發的焦點平均尺寸越大，焦點尺寸的變化有可能作為表征不同類型輻射作用、輻照集簇DNA斷裂損傷及細胞修復過程的參數。

（References）

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（責任編輯：龐迎春）

Response of γH2AX Foci in Repair of DNA Double Strand Breaks Induced by Heavy Ions

SUI Li1，2，WANG Yu1，GUAN Hua1，KONG Fuquan2，ZHOU Pingkun1

（1.Beijing Institute of Radiation Medicine，Beijing 100850，China；2.China Institute of Atomic Energy，Beijing 102413，China）

DNA double?strand break（DSB）is a major and severe damage of genomic DNA induced by ionizing radiation.In case of the occurrence of DSB，the histone protein H2AX is phosphorylated and recruited at DSB site to form phosphorylated H2AX（γH2AX）foci as a DSB biomarker.The yield，size and dynamics of γH2AX foci in mouse MEF cells induced by different linear energy transfer（LET）radiation including heavy ions7Li，12C and60Co γ?ray were investigated.The results indicated that the average number of γH2AX foci per cell was changed as a function of time post?ir?radiation for all the radiations，and the peak of γH2AX foci formation appeared at 2h after irradia?tion.The persistence of increased number of foci was depended on the radiation type.The frequency of γH2AX foci production was associated with the LET value，the higher the LET，the greater the production frequency.The average size of γ?H2AX foci induced by γ?rays was not changed with the post?irradiation times.An increase in the size of γH2AX foci induced by high LET ion beams was found，as compared with γ?rays irradiation.Moreover，the foci size increased with elevated LET.

genomic stability；DNA double?strand break；DNA repair；γH2AX foci（phosphoryla?ted H2AX foci）；heavy ion；γ?ray

Q691.5；Q789

：A

：1674?5825（2017）02?0245?07

2016?05?19；

2017?02?28

載人航天預先研究項目（040101）

隋麗，女，博士，研究員，研究方向為重離子輻射生物學與防護。Email：lisui＠ciae.ac.cn