基于黑木耳菌Aas1502液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

劉俊梅，丁偉，王慶，楊盼盼，王玉華，樸春紅，于寒松，李琢偉

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118；2.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130033）

基于黑木耳菌Aas1502液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

劉俊梅1，丁偉1，王慶1，楊盼盼1，王玉華1，樸春紅1，于寒松1，李琢偉2，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118；2.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130033）

以胞外多糖產(chǎn)量和菌絲體干重為檢測指標(biāo)，優(yōu)化黑木耳菌Aas1502胞外多糖液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)基組成。通過單因素試驗(yàn)，確定培養(yǎng)基碳源和氮源種類及培養(yǎng)基中碳源、氮源、KH2PO4和MgSO4·7H2O的濃度。利用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化，并通過方差分析最終確定優(yōu)化培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯淀粉20 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨4 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L，此時(shí)胞外多糖產(chǎn)量和菌絲體干重，分別為9.36 g/L和12.27 g/L，胞外多糖比優(yōu)化前提高了1.48倍，為后續(xù)利用深層發(fā)酵提取黑木耳多糖提供了理論基礎(chǔ)。

液態(tài)深層發(fā)酵；正交優(yōu)化；胞外多糖

黑木耳菌（Auricularia Auricular strain，Aas）是一種藥食同源真菌[1]，目前采用該菌作為固體栽培出發(fā)菌株，其黑木耳子實(shí)體中活性物質(zhì)多糖含量最為豐富。但采用固體栽培獲得黑木耳子實(shí)體存在生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量低、受季節(jié)等條件限制的問題[2-4]，黑木耳多糖的產(chǎn)量較低，而采用深層發(fā)酵技術(shù)可以有效避免上述條件的限制，還可以避免提取多糖過程中胞內(nèi)多糖不易溶出的問題[5]，進(jìn)而提高黑木耳多糖的產(chǎn)量。黑木耳多糖（Auriculariaauricular polysaccharide），是一種具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物[6]，在食品領(lǐng)域常作為增稠劑、穩(wěn)定劑、粘合劑[7]；在醫(yī)藥、保健品領(lǐng)域常起到抗炎[8]、抗氧化[9]和提高免疫[10]等作用。近年來，黑木耳多糖日益受到人們的重視[11]，國內(nèi)外對黑木耳多糖的報(bào)道也數(shù)見不鮮。本文采用液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成，進(jìn)一步提高黑木耳多糖的產(chǎn)量。為進(jìn)一步利用液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)黑木耳多糖提供理論參考。

1材料與方法

1.1菌種與試劑

菌種來源：黑木耳菌種（AuriculariaAuriculastrain）Aas1502購買于吉林省吉蕈食用菌研究所。

標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、重苯酚、硫酸、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）均為分析純試劑。

1.2主要培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯切片，沸水煮汁30min，定容至1 L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂粉20 g/L。

種子培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯切片，沸水煮汁30min，葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4· 7H2O 0.5 g/L，蒸餾水定容至1 L。

碳源試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，馬鈴薯淀粉20 g/L（葡萄糖、蔗糖、果糖、玉米淀粉），蛋白胨4 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，VB0.05 g/L，蒸餾水定容至1 L。

氮源試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，馬鈴薯淀粉20 g/L，蛋白胨3 g/L（豆粕粉、魚粉、酵母浸粉、牛肉膏），KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，VB0.05 g/L，蒸餾水定容至1 L。

無機(jī)鹽試驗(yàn)培養(yǎng)基：采用優(yōu)化好的碳氮源，分別加入不同比例的KH2PO4（MgSO4·7H2O），蒸餾水定容至1 L進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4儀器與設(shè)備

MCV-131BNF（T）超凈工作臺：SANYO Electric Co.，Ltd.；DHP120恒溫培養(yǎng)箱：上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；CHA-S恒溫振蕩器：國華企業(yè)；3K15高速冷凍離心機(jī)：美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基配制與操作

1.2.1.1種子活化

在無菌條件下，切取新鮮斜面種子菌絲塊約0.5 cm2，接種于裝有100mL液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在30℃、150 r/min的恒溫箱搖床中培養(yǎng)5 d。

1.2.1.2發(fā)酵培養(yǎng)

在無菌條件下，將液體種子按照液體發(fā)酵培養(yǎng)基10%的比例，接種于裝有100mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中。在30℃、150 r/min環(huán)境下的恒溫培養(yǎng)5 d。

1.2.2胞外多糖提取

發(fā)酵體系9 500 r/min離心15min，將菌絲體與發(fā)酵液分離，菌絲體用蒸餾水洗滌3次，凍干，保存。發(fā)酵液加入3倍體積95%乙醇，4℃過夜，凍干，獲得樣品即為胞外粗多糖。

1.2.3淀粉檢測

發(fā)酵上清液，用碘溶液檢驗(yàn)淀粉是否完全水解。

1.2.4胞外粗多糖稱重

胞外粗多糖在-55℃條件下，冷凍干燥，稱重。

1.2.5菌絲體干重的測定

照明設(shè)計(jì)逐漸成為展示空間氛圍營造的重要元素，它不僅可以界定展示空間、照明展示環(huán)境，還能創(chuàng)造出不同的文化內(nèi)涵和空間格調(diào)。展示空間的照明設(shè)計(jì)師一個(gè)系統(tǒng)工程問題，具有很強(qiáng)的工藝要求，要合理選擇光源、燈具和布局形式，以營造出賦有生命、充滿活力、感覺逼真、整體優(yōu)化的展示環(huán)境，從而提高展示空間效果。

用3倍體積蒸餾水將菌絲體洗滌3次，在9500 r/min條件下，離心10min，冷凍干燥至恒重，稱重，即為菌絲體干重。

1.2.6正交試驗(yàn)分析

分別以胞外多糖的產(chǎn)量（Aw yield），菌絲體干重（Dry weightofmycelium，MDW），胞外多糖產(chǎn)量占菌絲體干重的百分比（Aw content）為考察依據(jù)，對碳源種類、氮源種類、碳源濃度、氮源濃度、KH2PO4濃度、MgSO4·7H2O濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，單因素結(jié)果采用origin8.0進(jìn)行圖表分析；然后，以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，利用spss軟件對正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析。

經(jīng)過對碳源種類、氮源種類、碳源濃度、氮源濃度、K2HPO4濃度、MgSO4·7H2O濃度單因素試驗(yàn)，獲得四因素三水平正交試驗(yàn)因素水平表，見表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表Table1 L9（34）Orthogonalexperiment factor levels

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1碳源種類對胞外多糖的影響

以胞外多糖產(chǎn)量、菌絲體干重、胞外多糖占菌絲體干重百分比為檢測指標(biāo)，考察葡萄糖、蔗糖、果糖、馬鈴薯淀粉、玉米淀粉5種碳源對各指標(biāo)的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 碳源種類對生產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.1 Effectof carbon sourceon exopolysaccharidep roduction

從圖1中可以看出，以上5種碳源對胞外多糖產(chǎn)量有很大影響；蔗糖與果糖不利于該菌種的生長且胞外多糖的產(chǎn)量較低；玉米淀粉有利于該菌種的生長，不利于胞外多糖的合成。胞外多糖產(chǎn)量分析得出，不同碳源發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果之間存在差異顯著性（P＜0.05）。考慮到馬鈴薯淀粉價(jià)格低廉、來源豐富，重復(fù)性試驗(yàn)驗(yàn)證該菌種對馬鈴薯淀粉的利用最好，確定為最佳碳源。

以胞外多糖產(chǎn)量、菌絲體干重、胞外多糖占細(xì)胞干重百分比為檢測指標(biāo)，考察蛋白胨、豆粕粉、魚粉、酵母浸粉、牛肉膏5種氮源對各指標(biāo)的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 氮源種類對生產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.2 Effectof Nitrogen sourceon exopolysaccharideproduction

從圖2中可以看出，以上5種氮源對胞外多糖的產(chǎn)量有一定影響；蛋白胨有利于該菌種的生長，Aw的產(chǎn)量明顯高于其他組；牛肉膏不利于該菌種生長，胞外多糖產(chǎn)量很低。胞外多糖產(chǎn)量分析得出，發(fā)酵培養(yǎng)基氮源中蛋白胨分別與酵母浸粉、牛肉膏組有顯著性差異（P＜0.05）。通過重復(fù)性試驗(yàn)，考察3個(gè)指標(biāo)證明該菌種對蛋白胨的利用最好，確定為最佳氮源。

2.1.3碳源濃度對胞外多糖的影響

通過碳源種類優(yōu)化，確定最佳碳源為馬鈴薯淀粉，其中，總碳源中含有20 g/L的葡萄糖；通過考察胞外多糖產(chǎn)量、菌絲體干重、胞外多糖占菌絲體干重百分比3個(gè)指標(biāo)，探究不同碳源濃度對生產(chǎn)胞外多糖影響，結(jié)果見圖3。

圖3 碳源濃度對生產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.3 Effectof carbon source concentration on exopolysaccharide production

從圖3得出，隨著碳源濃度的上升，各指標(biāo)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，胞外多糖產(chǎn)量和菌絲體干重曲線趨勢相似。碳源濃度在30 g/L～40 g/L之間時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量和菌絲體干重呈現(xiàn)明顯上升趨勢；碳源濃度為40 g/L時(shí)，3個(gè)指標(biāo)分別達(dá)到6.23 g/L、11.21g/L、56.08%；馬鈴薯淀粉濃度為10、20、30 g/L時(shí)，Aw的產(chǎn)量和MDW均具有顯著性差異（P＜0.05）。因此，選擇10、20、30g/L作為后續(xù)正交試驗(yàn)馬鈴薯淀粉濃度的3個(gè)水平。

2.1.4氮源濃度對胞外多糖的影響

通過氮源種類優(yōu)化，確定最佳碳源為蛋白胨；利用胞外多糖產(chǎn)量、菌絲體干重、胞外多糖占菌絲體干重百分比3個(gè)指標(biāo)，考察不同濃度蛋白胨對生產(chǎn)胞外多糖的影響，結(jié)果如圖4所示。

從圖4得出，各指標(biāo)隨著蛋白胨濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。蛋白胨濃度在2 g/L～4 g/L之間時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量、菌絲體干重急劇上升；蛋白胨濃度為4 g/L時(shí)，菌絲體干重、胞外多糖占細(xì)胞干重百分比分別達(dá)11.95g/L、49.95%；蛋白胨濃度在4 g/L～10 g/L之間時(shí)，不利于胞外多糖的產(chǎn)生和菌體生長。蛋白胨濃度為2、4、6 g/L時(shí)，Aw的產(chǎn)量和MDW均具有顯著性差異（P＜0.05）。因此，選擇2、4、6 g/L作為后續(xù)正交試驗(yàn)蛋白胨濃度的3個(gè)水平。

2.1.5 KH2PO4濃度對胞外多糖的影響

圖4 氮源濃度對生產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.4 Effectof nitrogen source concentration on exopolysaccharide production

以胞外多糖產(chǎn)量、菌絲體干重、胞外多糖占菌絲體干重百分比為檢測指標(biāo)，考察不同KH2PO4濃度對生產(chǎn)胞外多糖的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 KH2PO4濃度對生產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.5 Effectof KH2PO4concentration on exopolysaccharide production

從圖5中可以看出，各檢測指標(biāo)隨著KH2PO4的增加呈現(xiàn)線性增長，又緩慢下降的變化趨勢，當(dāng)KH2PO4為1.0 g/L時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量、菌絲體干重、胞外多糖占菌絲體干重百分比均達(dá)到最大值，分別為7.06 g/L、11.98 g/L、58.93%。當(dāng)KH2PO4在0～1.0 g/L時(shí)，隨著KH2PO4濃度的不斷增加，胞外多糖產(chǎn)量和菌體呈線性生長；當(dāng)KH2PO4濃度超過1.0 g/L時(shí)，3個(gè)指標(biāo)開始緩慢下降，KH2PO4濃度為0.5、1.0、1.5 g/L時(shí)，Aw的產(chǎn)量和MDW均具有顯著性差異（P＜0.05）。綜上所述，選擇0.5、1.0、1.5 g/L濃度KH2PO4作為正交試驗(yàn)3個(gè)水平。

2.1.6 MgSO4·7H2O濃度對胞外多糖的影響

以胞外多糖產(chǎn)量、菌絲體干重、胞外多糖占菌絲體干重百分比為檢測指標(biāo)，考察不同MgSO4·7H2O濃度對生產(chǎn)胞外多糖的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 M gSO4·7H2O濃度對生產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.6 EffectofM gSO4·7H2O concentration on Aw production

從圖6中可以看出，胞外多糖產(chǎn)量與菌絲體干重整體變化趨勢不大，胞外多糖占菌絲體干重百分比明顯增加。當(dāng)MgSO4濃度小于0.4 g/L時(shí)，胞外多糖占菌絲體干重百分比急劇上升；當(dāng)MgSO4濃度在0.2 g/L～0.4 g/L之間時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量緩慢上升，最大值為7.23 g/L；當(dāng)MgSO4濃度大于0.4 g/L時(shí)，Aw產(chǎn)量和菌絲體干重緩慢下降并趨于平穩(wěn)。綜上，當(dāng)MgSO4·7H2O濃度達(dá)到0.2 g/L以上后，對MDW無顯著影響，對胞外多糖的積累有一定影響，胞外多糖產(chǎn)量為主要檢測指標(biāo)，確定MgSO4·7H2O 3個(gè)水平濃度為0.2、0.4、0.6 g/L。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)因素水平表（表1），進(jìn)行試驗(yàn)，得出正交試驗(yàn)結(jié)果，如表2。

表2 培養(yǎng)基組成優(yōu)化正交試驗(yàn)表Table2 Theorthogonal test tableofm edium optim ization

續(xù)表2培養(yǎng)基組成優(yōu)化正交試驗(yàn)表Continue table2 Theorthogonal test tableofmedium optim ization

通過直觀分析表2可以得出，4個(gè)因素對每個(gè)指標(biāo)有明顯影響且對各指標(biāo)的影響趨勢相似。4個(gè)因素中，馬鈴薯淀粉濃度是影響3個(gè)指標(biāo)的主要因素，最終得出影響試驗(yàn)結(jié)果的主次順序?yàn)椋厚R鈴薯淀粉濃度＞蛋白胨濃度＞KH2PO4濃度＞MgSO4·7H2O濃度。胞外多糖產(chǎn)量為結(jié)果主要指標(biāo)，通過k值得出最佳培養(yǎng)基組成為A2B2C2D1，即馬鈴薯淀粉20 g/L、蛋白胨4 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L。而表2中第5組試驗(yàn)A2B2C3D1胞外多糖產(chǎn)量最高，但與之培養(yǎng)基組成含量不同，因此需要驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的可靠性與穩(wěn)定性，將得到A2B2C2D1的培養(yǎng)基組成與表2第5組試驗(yàn)進(jìn)行對比，結(jié)果經(jīng)分析，由A2B2C2D1組成的培養(yǎng)體系中胞外多糖平均產(chǎn)量為（9.121±0.21）g/L，第5組試驗(yàn)的胞外多糖平均產(chǎn)量為（9.355±0.25）g/L，該結(jié)果表明，第五組試驗(yàn)培養(yǎng)基組成能有效提高胞外多糖產(chǎn)量，且可靠性與穩(wěn)定性較好。

2.4方差結(jié)果分析

胞外多糖產(chǎn)量、菌絲體干重、胞外多糖占菌絲體干重正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表3。

表3 胞外多糖產(chǎn)量、菌絲體干重、胞外多糖占菌絲體干重正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab le3 Theanalysisofvarianceof theorthogonalexperim entalof Aw yield，MDW and Aw content

從表3可知，馬鈴薯淀粉濃度是影響胞外多糖產(chǎn)量、菌絲體干重、胞外多糖占菌絲體干重的極顯著因素（P＜0.01），馬鈴薯淀粉的添加量，在整個(gè)發(fā)酵過程中起主導(dǎo)作用；蛋白胨濃度是影響胞外多糖產(chǎn)量、菌絲體干重的顯著性因素（P＜0.05），可以使胞外多糖占菌絲體干重比例維持在一定水平；K2HPO4濃度是影響菌絲體干重的顯著性因素，有利于胞內(nèi)多糖的提取。

3討論

國內(nèi)外研究表明，深層發(fā)酵與碳源存在很大關(guān)系，碳作為構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)的主要來源，也是菌絲體生長的主要能量來源，單糖作為單一碳源，雖然可以直接利用，但在培養(yǎng)基中代謝過快，容易產(chǎn)酸，影響培養(yǎng)基的pH值，可能抑制菌絲體生長[12]。因此本研究重點(diǎn)考察葡萄糖與其他碳源組合對胞外多糖產(chǎn)量的影響。結(jié)果證明，碳源是影響本試驗(yàn)多糖產(chǎn)量的極顯著因素。黑木耳菌為偏好碳源性真菌，氮源在培養(yǎng)基中比例較小。無機(jī)鹽因子是培養(yǎng)基組成的關(guān)鍵因素，研究表明，磷酸鹽對于黑木耳深層發(fā)酵過程非常重要，硫酸鎂對黑木耳發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖有良好的促進(jìn)作用[13]。

4結(jié)論

通過對以上試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，篩選出深層發(fā)酵黑木耳菌Aas1502最佳培養(yǎng)基組成為A2B2C3D1，即馬鈴薯淀粉20 g/L、蛋白胨4 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO4· 7H2O 0.2 g/L。利用此培養(yǎng)基深層發(fā)酵黑木耳菌Aas1502，胞外多糖產(chǎn)量、菌絲體干重、胞外多糖占菌絲體干重比例分別可達(dá)9.36 g/L、12.27 g/L、76.28%，胞外多糖產(chǎn)量是優(yōu)化前的1.48倍。

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M edium Optim ization for Extracellular Polysaccharide Production of Auricularia Auricula strain 1502 by Subm erged Fermentation

LIU Jun-mei1，DINGWei1，WANGQing1，YANGPan-pan1，WANGYu-hua1，PIAOChun-hong1，YUHan-song1，LIZhuo-wei2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Jilin AgriculturalUniversity，Changchun 130118，Jilin，China；2.Changchun Vocational Instituteof Technology，Changchun 130033，Jilin，China）

The composition of submerged fermentationmedium for extracellular polysaccharides from Auricularia Auricula strain 1502wasoptimized in thisstudy.Production ofextracellular polysaccharide andmycelium dryweightwere regarded as research index to determine the composition of themedium.Carbon sources，nitrogen sources，carbon concentration，nitrogen concentration，KH2PO4concentration and MgSO4·7H2O concentrationwere determined by single-factor test.Orthogonal testwasused to analysis the variance of the two indexes，the optimal composition of culturemedium were determined：potato starch 20 g/L，glucose 20 g/L，peptone 4 g/L，KH2PO41.5 g/L and MgSO4·7H2O 0.2 g/L.Production ofextracellular polysaccharide andmycelium dry weightwere 9.36 g/L and 12.27g/L，respectively.The effectwas significant that the production of extracellular polysaccharide was 1.48 times as before.A theoretical basis was provided for the subsequent extraction of polysaccharides from Auricularia Auriculastrain using submerged fermentation by this result.

submerged fermentation；orthogonaloptimization；extracellularpolysaccharide

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.042

2016-05-25

吉林省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目（20140203019NY）

劉俊梅（1973—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品生物化學(xué)與功能性食品。

*通信作者：李琢偉（1974—），男，副教授，碩士，研究方向：食藥菌加工與生產(chǎn)。