三株產乳酸芽孢桿菌共生培養胞外代謝產物的活性與成分分析

鐘日聰++劉影++徐春厚

摘要：對3株產乳酸芽孢桿菌共生培養產生的胞外代謝產物的活性與化學成分進行了初步研究，用杯碟法測定代謝產物的抑菌活性，用氣相色譜質譜儀（GC/MS）分析代謝產物的成分。結果表明，3株菌共生培養產生的胞外代謝產物有抑菌活性，對革蘭氏陽性菌的抑制作用強；胞外代謝產物中，4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮相對含量最高，為11.16%；其次是開司米酮（5.13%）和烯丙基苯酚（4.02%）；初步確定的抑菌物質為烯丙基苯酚，芳香類物質為4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮和開司米酮。

關鍵詞：芽孢桿菌；共生培養；代謝產物；抑菌物質；芳香物質

中圖分類號：S816.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）05-0915-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.031

Analyses on the Activity and Composition of Extracellular Metabolites from Symbiotic Culture Liquid of Lactic acid Bacillus Strain SC， SL1 and TR

ZHONG Ri-cong1，LIU Ying2，XU Chun-hou2

（1.Guangdong Guangken Animal Husbandry Co.，Ltd.，Guangzhou 510612，China；

2.Agricultural College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，Guangdong，China）

Abstract： The antibacterial activity and chemical composition of extracellular metabolites produced by the Lactic acid Bacillus strain SC，SL1 and TR on symbiotic culture were studied using the method of cup dish and gas chromatography-mass spectrometer. The results showed that antibacterial substances existed in the extracellular metabolites produced by three Bacillus on symbiotic culture，it had strong bacteriostatic action to gram positive bacteria. In the extracellular metabolites，the 4-tert-butyl-2，6-dimethyl-3，5-dinitroacetophenone was the highest in the relative amount，for 11.16%， followed by cashmeran（5.13%） and allylphenol（4.02%）. Allylphenol was preliminary identified as the antibacterial substances，4-tert-butyl-2，6-dimethyl-3，5-dinitroacetophenone and cashmeran were the aromatic substances.

Key words： Bacillus； symbiotic culture； metabolite； antibacterial substance； aromatic substance

微生態制劑具有調節腸道功能紊亂、抑制病原菌繁殖、維持腸道內菌群平衡、促進機體生長和提高免疫力等作用[1，2]，且能夠解決服用抗生素帶來的耐藥性、二重感染及藥物殘留等問題，已被廣泛用于畜牧、水產養殖及飼料等行業[3-7]。微生態制劑的制備需要益生菌，而產乳酸芽孢桿菌是一類既能產生乳酸又能形成芽孢的革蘭陽性桿菌，同時具有乳酸菌和芽孢桿菌的優點，已成為最理想的益生菌之一[8]。芽孢桿菌SC、蠟狀芽孢桿菌SL1和芽孢桿菌TR是徐春厚等[9]分離鑒定的益生菌，為了探討3株產乳酸芽孢桿菌共生培養時的胞外代謝產物的活性及其化學成分，進行了抑菌試驗和氣相色譜質譜儀（GC/MS）分析，以期為3株益生菌的開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

芽孢桿菌SC（Bacillus sp.sc，FJ627944）、蠟狀芽孢桿菌SL1（Bacillus cereus SL1，FJ627945）和芽孢桿菌TR（Bacillus sp. TR，FJ627946），3株菌均產生乳酸和形成芽孢，由廣東海洋大學預防獸醫學實驗室分離、鑒定和保存。

1.2 培養基

1.2.1 GYP培養基 蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 發酵培養基 10%黃豆汁100 mL/L，白糖80 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，MnSO4·H2O 0.1 g/L，115 ℃滅菌20 min。

1.3 指示菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia. coli）、雞白痢沙門菌（Salmonella pullorum）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocide）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），購于中國獸醫藥品監察所。

1.4 芽孢桿菌共生培養液的制備

用GYP培養基分別活化3株產乳酸芽孢桿菌，按5%接種量和1∶1∶1的接種比例，同時加入的接種順序，接種到發酵培養基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養24 h，再靜置培養24 h；將培養物4 000 r/min離心20 min，收集上清液，微孔濾膜過濾，濾液即為3株芽孢桿菌共生培養液；將未接菌的發酵培養基同上處理，即為空白培養液。

1.5 代謝產物的抑菌活性測定

將5種指示菌分別接種到營養肉湯培養基，37 ℃培養12 h，配制成106 CFU/mL的菌懸液，即為指示菌液。采用杯碟法[10]測定芽孢桿菌共生培養液的抑菌活性，用抑菌圈直徑的大小表示抑菌活性的高低；同時，用空白培養液同上處理作為對照。

1.6 代謝產物的成分分析

1.6.1 代謝產物的萃取 取3株芽孢桿菌的共生培養液，用二氯甲烷在中性、酸性、堿性條件下萃取，共萃取3次；對照為空白培養液的二氯甲烷萃取物。

1.6.2 GC/MS分析 采用石英毛細管柱DB-5（30 mm×0.25 mm×0.25 μm），色譜柱程序升溫條件：初始溫度60 ℃，初始溫度保持4 min后，以5 ℃/min的速率升溫至300 ℃，并保持5 min；載體：氦氣，不分流；柱前壓：123.3 kPa；進樣口溫度310 ℃；EI源電子轟擊能：70 eV；離子源溫度：320 ℃；掃描質量范圍：100～400 AMU；掃描間隔：0.5 s。

2 結果與分析

2.1 代謝產物的抑菌活性測定

3株產乳酸芽孢桿菌共生培養液的抑菌活性測定結果見表1。由表1可知，產乳酸芽孢桿菌共生培養時產生的胞外代謝產物對指示菌均有抑菌效果，其中對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭陽性菌的抑制作用強，最大抑菌圈直徑可達29.7 mm；對大腸埃希菌等革蘭陰性菌的抑菌作用較弱，最小抑菌圈直徑僅為11.9 mm。

2.2 空白培養液二氯甲烷萃取物的GC/MS分析

經GC/MS分析得到空白培養液萃取后的化學組分總離子流色譜圖（圖1），經計算機內存的標準質譜庫檢索，確定空白培養基萃取物有25種成分，其中相似度在75%以上的有13種（表2），相對含量最高的是4-丁基聯苯，為14.12%；其次是鄰苯二甲酸二異辛酯和開司米酮，分別為10.93%和9.01%。

2.3 芽孢桿菌共生培養液的GC/MS分析

經GC/MS分析得到3株產乳酸芽孢桿菌共生培養液萃取后的化學組分總離子流色譜圖（圖2），經計算機內存的標準質譜庫檢索，確定出3株芽孢桿菌共生培養產生的胞外代謝產物成分有24種，其中相似度在75%以上的有15種（表3），相對含量最高的是開司米酮，為14.14%；其次是4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮和鄰苯二甲酸二異辛酯，分別為11.16%和8.43%。

2.4 共生培養液與空白培養液萃取物的主要成分比較分析

對3株芽孢桿菌共生培養液與空白培養液萃取物進行GC/MS檢測，主要成分比較分析結果見表4。由表4可知，3株產乳酸芽孢桿菌共生培養液二氯甲烷萃取物中檢測出的相對凈含量最高的成分是4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮，達到11.16%；其次是開司米酮（5.13%）、烯丙基苯酚（4.02%）、二甲二甲氧基-硅烷（3.62%）、丙基雙環己基乙烯（3.53%）、沙丁胺醇（2.57%）、N-乙酰-L-纈氨酸（2.16%）；其中，開司米酮、二甲二甲氧基-硅烷、丙基雙環己基乙烯等成分在空白培養液二氯甲烷萃取物中亦檢測出來，但含量低于3株菌共生培養液；而4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮、烯丙基苯酚、沙丁胺醇、N-乙酰-L-纈氨酸等成分在空白培養基二氯甲烷萃取物中未檢測出來，應該是3株乳酸芽孢桿菌共生培養產生的特有成分。

3 小結與討論

益生菌能夠產生抑菌物質，體外抑菌試驗表明，乳酸芽孢桿菌能夠抑制大腸埃希菌、沙門氏菌等生長的活性物質[11]。王曉翠等[12]從健康仔豬糞中分離出2株乳酸芽孢桿菌，對大腸桿菌和傷寒沙門氏菌有抑菌作用。本試驗結果亦證明了3株產乳酸芽孢桿菌共生培養時，能夠產生有抑菌作用的胞外代謝產物，但對革蘭陽性菌的抑制作用強，對大腸桿菌等革蘭陰性菌抑制作用弱。

3株產乳酸芽孢桿菌共生培養的胞外代謝產物的二氯甲烷萃取物主要化學成分及相對凈含量分別為：4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮（11.16%）、開司米酮（5.13%）、烯丙基苯酚（4.02%）、沙丁胺醇（2.57%）、N-乙酰-L-纈氨酸（2.16%）等；其中4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮又名酮麝香或麝香酮，有類似天然麝香香氣，香氣幻想逼真，用作化妝品香精和季節性用香精的定香劑，在醫學上有抗癡呆、抗炎、抗腫瘤等作用[13]；開司米酮具有獨特的花香、麝香香氣，是一種用途廣泛的香料品種，用于配制高檔香水和化妝品香精[14]；這表明乳酸芽孢桿菌共生培養后可產生芳香類物質，添加到飼料中可改善飼料的適口性。產生的烯丙基苯酚具有抑菌殺菌作用，目前的研究主要針對植物病原菌如番茄灰霉病菌、蘋果腐爛病菌和小麥紋枯病菌有抑制作用[15]。沙丁胺醇具有較強的支氣管擴張作用，主要用于平喘藥；N-乙酰-L-纈氨酸可用于蛋白質合成，是動物生長和繁殖不可缺少的氨基酸。

通過抑菌試驗及GC/MS分析，確定3株乳酸芽孢桿菌共生培養時，可以產生具有抑菌活性和芳香性作用的胞外代謝產物，主要是烯丙基苯酚、4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮和開司米酮。為3株乳酸芽孢桿菌的進一步開發應用提供了試驗依據。

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