牦牛源鮑曼不動(dòng)桿菌的分離及鑒定

劉 鑫，湯 承，2，岳 華，2*

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.國家民委青藏高原動(dòng)物疫病防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，四川 成都 610041）

牦牛源鮑曼不動(dòng)桿菌的分離及鑒定

劉 鑫1，湯 承1，2，岳 華1，2*

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.國家民委青藏高原動(dòng)物疫病防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，四川 成都 610041）

本試驗(yàn)從患肺炎的牦牛細(xì)支氣管中分離得到一株致病細(xì)菌“SWUN6759”，用PCR擴(kuò)增其16S rRNA序列進(jìn)行鑒定，并作同源性比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化分析，以及藥物敏感及致病性檢測(cè)。結(jié)果顯示：SWUN6759為鮑曼不動(dòng)桿菌，它與鯛源、雞源、水蠟蟲源、人源、牛源鮑曼不動(dòng)桿菌的核苷酸序列的同源性均低于50%，說明SWUN6759具有種屬特異性；耐藥性結(jié)果顯示其僅對(duì)多西環(huán)素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星敏感，致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示其對(duì)小鼠具有較強(qiáng)的致病作用。

牦牛；鮑曼不動(dòng)桿菌；16S rRNA；系統(tǒng)進(jìn)化分析

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii，Ab）廣泛分布于自然界，在水、土壤、乳和健康動(dòng)物的皮膚、胃腸道、生殖道以及呼吸道中均存在，常引起腦膜炎、傷口感染、敗血癥等嚴(yán)重的醫(yī)源性感染，通常認(rèn)為Ab屬于條件致病菌，易在重癥監(jiān)護(hù)病房流行[1-3]。Ab對(duì)大多數(shù)抗生素不敏感，治療比較困難。近年來，由該菌引起畜禽發(fā)病的報(bào)道在逐漸增多，鄒德穎等[4]從病死雛雞中分離出Ab；鐘世勛等[5]在某發(fā)病羊場(chǎng)分離到兩株對(duì)小鼠有較強(qiáng)致病作用的Ab，其對(duì)多種抗菌藥物具有耐藥性。本研究在對(duì)牦牛肺炎病原學(xué)的調(diào)查中從牦牛肺支氣管內(nèi)分離出一株牦牛源Ab，鑒定報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 病料及試驗(yàn)動(dòng)物 有出血和實(shí)變的牦牛肺臟，采自甘孜州理塘縣牦牛屠宰點(diǎn)；4～6周齡昆明系小鼠10只（22g±2g），購自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 18種抗菌藥物的藥敏片（克林霉素、林可霉素、青霉素、萬古霉素、慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、鏈霉素、大觀霉素、利福平、呋喃妥因、氨芐西林、頭孢噻肟、氟苯尼考、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林），普通肉湯、麥康凱培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、革蘭氏染色液，均購自杭州微生物有限公司；DNA提取試劑盒購自上海陽光試劑有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs均購自TaKaRa公司；DNA Marker購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無菌切開肺臟，用接種環(huán)鉤取細(xì)支氣管內(nèi)的分泌物，首先接種于普通肉湯培養(yǎng)基，37℃增菌培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于TSA平板，37℃培養(yǎng)24h，觀察菌落特征，挑選單個(gè)菌落抹片，革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)，并對(duì)分離菌株進(jìn)行克隆純化，命名為SWUN6759。

1.4 PCR鑒定 將SWUN6759接種于TSA，37℃培養(yǎng)12 h，用滅菌生理鹽水洗下菌苔，用DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA，用16S rRNA基因通用引物[6]擴(kuò)增其16S rRNA 1500bp片段。上游引物序列 F1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物序列R1：5′-AAGGAGGTGATCCACCC-3′（引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成），采用25μL反應(yīng)體系：DNA模板2μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP 2 μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 16.3μL，同時(shí)設(shè)無模板對(duì)照。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃ 變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)成像，產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.5 序列分析 用Blast對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，將從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的同源性較高的不同種屬來源的鮑曼不動(dòng)桿菌的序列作為參考序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行同源性分析。

1.6 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定SWUN6759對(duì)18種抗菌藥物的敏感性，按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）的標(biāo)準(zhǔn)判斷SWUN6759對(duì)受試藥物的敏感程度[7]。

1.7 動(dòng)物試驗(yàn) 將小鼠隨機(jī)分為兩組，每組5只。一組腹腔注射SWUN6759（2.2×108CFU/只），另一組腹腔注射等體積滅菌生理鹽水作為健康對(duì)照，逐日觀察各組小鼠的發(fā)病情況。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢，并采集脾臟作為病料接種TSA，分離細(xì)菌，然后擴(kuò)增其16S rRNA進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 SWUN6759的菌落及形態(tài)特征 SWUN6759在在37℃ TSA平板上長(zhǎng)出濕潤、光滑、半透明、邊緣整齊、微隆起、中等大小的圓形菌落（圖1）；革蘭氏染色顯示，分離菌為革蘭氏陰性球桿菌，無芽孢（圖2）。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 凝膠成像系統(tǒng)觀察顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1 500 bp附近處出現(xiàn)一條明亮的特異性條帶（圖3），與預(yù)期大小相符。測(cè)序結(jié)果顯示，SWUN6759的16S rRNA序列與GenBank中已發(fā)表的Ab 16S rRNA基因的同源性較高，達(dá)99%以上，證明SWUN6759為Ab。

圖1 SWUN6759菌落形態(tài)

圖2 SWUN6759革蘭氏染色特性結(jié)果（10×100）

圖3 SWUN6759 16S rRNA PCR產(chǎn)物的電泳圖

2.3 SWUN6759的16SrRNA序列分析 同源性分析結(jié)果顯示（圖4）：SWUN6759與參考菌株KX242271（魚源）、KT964444（雞源）、JX966428（昆蟲源）、JN668838（人源）的同源性均為44.1%，與JQ404488（牛源）的同源性為 44.0%，均低于 45%，說明SWUN6759具有種屬特異性。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示（圖5）：SWUN6759與昆蟲源Ab處于同一小分支。

2.4 SWUN6759對(duì)抗菌藥物的敏感性 SWUN6759僅對(duì)多西環(huán)素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星敏感，而對(duì)其余15種抗菌藥物均具有耐藥性（表1）。

2.5 SWUN6759的致病性 腹腔接種SWUN6759，48h內(nèi)全部小鼠死亡，剖檢可見肝脾腫大、瘀血，呈暗紅色，肺充血，腸黏膜彌漫性出血，其余器官未見明顯病變。從死亡小鼠的脾臟中回收到與感染菌形態(tài)特征一致的細(xì)菌，PCR擴(kuò)增出鮑曼不動(dòng)桿菌的rRNA。對(duì)照組小鼠健康狀況良好，剖檢未見病理變化。

圖4 分離菌16S rRNA系統(tǒng)同源性比對(duì)

圖5 分離菌16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 mm

3 結(jié)論

一般認(rèn)為Ab毒力較低，只有在機(jī)體抵抗力下降或免疫功能受損時(shí)才引起感染，能引起人體各部位的感染，多見于醫(yī)院內(nèi)感染，其中以尿道和呼吸道感染率最高[8-9]。本研究通過病原學(xué)檢查和16S rRNA基因測(cè)序從牦牛病變肺臟中分離出一株Ab，通過細(xì)菌毒力檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的毒力，同時(shí)具有較為廣泛的耐藥性，表明其對(duì)牦牛養(yǎng)殖業(yè)具有較大威脅，應(yīng)特別注意防范。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明：雖然SWUN6759與其他各株Ab參考菌株處于一個(gè)大分支上，與昆蟲源處于一個(gè)小分支上，但是其與人源、牛源、雞源、魚源、昆蟲源的同源性都低于45%，可見其具有種屬特異性，可能是由于牦牛食用牧草時(shí)感染Ab所致，具體原因還需進(jìn)一步研究。■

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Isolation and Identification of Acinetobacter Baumannii from Yak

Liu Xin1，Tang Cheng1，2，Yue Hua1，2*
（1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Sichuan Chengdu 610041；2.State Ethnic Affairs Commission to Create Innovation Team of Animal Disease Prevention and Control of the Qinghai Tibet Plateau，Sichuan Chengdu 610041，China）

One pathogenic bacteria strain named SWUN6759 was isolated from the lungs and bronchus of diseased yak.The 16S rRNA gene of the SWUN6759 strain was amplified by PCR-sequencing，the homology comparison and phylogenetic analysis were carried out.In addition，mice were inoculated with the culture of isolated bacteria to detect virulence，and susceptibility test was performed for screening effective antibiotics.The results indicated that the isolated strain was identified as an acinetobacter baumannii.The homology was 44.1%with porgy，gallus，mealybug，Homo sapiens and 44.0%with calves.It showed that theSWUN6759had speciesspecific.TheSWUN6759 wasonlysensitivetodoxycycline、ofloxacin、ciprofloxacin and multiresistant to most antibiotics and it had high pathogenicity to mice.

Yak；Acinetobacter baumannii；16S rRNA；Phylogenetic analysis

S858.234.43

B

1001-8964（2017）03-0028-03

2017-01-05

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2016YFD0500907）

劉鑫（1991-），男（土家族），湖北恩施人，碩士，研究方向：動(dòng)物疫病防控技術(shù)。

*通訊作者：岳華（1963-），女,河南睢縣人，博士，教授，主要從事動(dòng)物病原分子生物學(xué)研究。