實驗用小型豬乙型腦炎病毒的分離鑒定

王 吉，付 瑞，李曉波，王淑菁，鞏 薇，衛 禮，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院國家實驗動物微生物遺傳檢測中心，北京 100050)

研究報告

實驗用小型豬乙型腦炎病毒的分離鑒定

王 吉，付 瑞，李曉波，王淑菁，鞏 薇，衛 禮，岳秉飛*，賀爭鳴*

(中國食品藥品檢定研究院國家實驗動物微生物遺傳檢測中心，北京 100050)

目的 了解小型豬感染乙型腦炎病毒株的特點。方法 豬腦組織經過處理，接種BHK21細胞，進行病毒培養、間接免疫熒光試驗、中和試驗、電鏡觀察，及通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增新分離毒株E區段和PrM區段核苷酸序列，測序后進行基因型鑒定。結果 25只豬腦組織接種BHK21細胞，有3個組織處理液能使BHK21細胞發生圓縮、集聚等病變；3個組織接種的BHK21病變細胞滴片進行免疫熒光試驗，均產生強綠色熒光反應；中和實驗結果顯示3株新分離株中和效價均為1∶64；電鏡下可見直徑40nm左右球型病毒粒子；RT-PCR產物測序結果與疫苗株E區段核苷酸比較同源性均為95%；3株新分離株均為GIII型乙腦病毒。結論 實驗表明小型豬場存在乙型腦炎病毒感染，為GIII型乙型腦炎病毒。

乙型腦炎病毒；分離；鑒定

流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)成員，乙型腦炎病毒基因為單股正鏈RNA，病毒顆粒呈球形，有包膜，直徑40～ 60nm，病毒粒子呈20面體對稱[1-4]。由乙型腦炎病毒引起的流行性腦炎簡稱乙腦，乙腦是一種人畜共患的自然疫源性疾病，是以中樞神經系統損害為主的急性傳染病，帶毒豬是本病的主要傳染源[4，5]。因此防治乙腦不僅可以減少養豬業的損失，并通過豬的免疫預防，可控制本病在豬及人群中的流行。

我國于1949年在北京首次分離到乙腦病毒，隨后在其他地區也相繼分離到該病毒[6]。乙腦主要流行于亞洲國家及地區，近年來流行區域不斷擴大，已經擴展到澳大利亞，韓國、泰國、印度尼西亞的爪哇、俄羅斯西伯利亞的濱海地區等相繼有乙腦的報道。我國除新疆、西藏、青海省外，其余各省均有發病流行，是嚴重危害公眾健康的重要傳染病，乙腦已成為世界關注的公共衛生問題之一[1，6-9]。國內外對JEV的研究較多，在我國也從多個省份通過不同途徑分離得到JEV，但從豬腦中分離到JEV的報道還不多[5]，尤其是從小型豬腦中分離JEV目前還沒有報道。為了解北京小型豬感染JEV的特征，加強小型豬的免疫預防，本研究從北京市某小型豬場的3頭豬腦組織中分離到的3株乙型腦炎病毒，并進行形態學、血清學和分子生物學鑒定，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料

DMEM培養基：HyClone公司產品；胎牛血清：杭州四季青公司產品；免疫熒光素(山羊抗豬IgG-FITC)：KPL公司產品；豬抗JEV血清及豬陰性血清：中國動物疫病預防控制中心獸醫診斷室提供；細胞固定液：中國農業大學生命科學研究中心電鏡室提供；乳倉鼠腎細胞(Baby Hamster Syrian Kidney， BHK21)。BHK21細胞：本室凍存； JEV毒株(Nakayama-NIH)、兔抗JEV標準陽性對照血清：由本院病毒一室提供；25只豬腦組織：北京某小型豬場提供的-70℃凍存腦組織；RNA快速提取試劑盒：購自德國Qiagen公司；Taq HS酶、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)、10×PCR buffer、100bp DNA marker：均購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR儀：美國Bio-Rad公司MYCYCLER；核酸瓊脂糖凝膠電泳儀：美國Bio-Rad公司PwerPac Basic；凝膠成像分析儀：美國 Kodak公司 GL212Pro； DNA序列分析軟件：DNA Star MegAlign軟件。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離

取的25個凍存的豬腦組織(編號為1～25)，無菌條件下用PBS研磨，經1000 r/min離心10 min，除菌過濾。

將樣品處理液接種長滿單層的BHK21細胞，置于37℃體積分數5%CO2培養箱中培養，每天觀察細胞病變，并記錄結果。每隔2～3 d換液1次，10 d后如出現致細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)則進行盲傳，盲傳至3代仍無CPE出現，則視為分離陰性。出現CPE的細胞，待CPE達到80%～ 90%收凍。凍融3次后繼續傳代，傳至3代，仍有CPE出現，則視為分離陽性[10-12]。

1.2.2 免疫熒光試驗

將連續傳至第3代的細胞滴片，與1∶10稀釋的豬JEV陰性血清和豬JEV陽性血清進行免疫熒光試驗。同時設正常BHK21細胞片和JEV感染BHK21細胞片作為陰性抗原片和陽性抗原片對照。在陰性抗原對照和陽性抗原對照成立的條件下，樣品片與JEV陰性血清和JEV陽性血清均無綠色熒光反應，該樣品判為JEV陰性；樣品片與JEV陰性血清無綠色熒光反應，與JEV陽性血清有綠色熒光反應，該樣品判為JEV陽性。

1.2.3 中和試驗

用兔抗JEV標準陽性血清和細胞維持液分別與JEV細胞毒(JEV感染BHK21細胞毒)、與經細胞試驗和免疫熒光試驗檢測JEV陽性的3只豬腦組織接種的P5代BHK21細胞毒，以1∶2～1∶512混合，37℃作用30 min后，接種BHK21細胞。同時設JEV標準毒株對照和正常BHK21對照，每天觀察細胞病變，連續觀察7d并記錄結果。

1.2.4 病毒形態的鑒定

將細胞試驗分離陽性的樣品細胞毒繼續接種BHK21細胞，待細胞病變達80%～90%時，將細胞瓶內液體棄掉，加入0.25%胰酶進行消化。用PBS將分散的細胞吹打懸浮于滅菌離心管中，1000 r/min離心10 min后，棄上清；將細胞用PBS再次懸浮，1000 r/min離心10 min后，棄上清，用細胞固定液將細胞懸浮，準備用透射電鏡鑒定病毒形態。電鏡圖片委托中國農業大學生命科學研究院電鏡室制作。

1.2.5 乙腦病毒分離株E基因和PrM基因的RT-PCR擴增

(1)引物設計

參考GenBank中已發表的乙腦病毒核苷酸序列，采用Primer 5.0軟件進行引物設計，其中E1-F/E1-R用于擴增E基因，PrM1-F/PrM1-R用于擴增PrM基因，引物的序列和位置見表1。

表1 用于擴增E基因和PrM基因的引物序列及位置

(2)病毒分離株RNA的提取

3株乙腦病毒分離株、JEV標準株、正常BHK21細胞，各取0.3 mL模板，按QIAGEN試劑盒說明書的操作步驟提取病毒RNA。

(3)反轉錄

反轉錄體系為：5×RNA PCR buffer 2.5 μL、dNTPsmixture 2.5 μL、RNase free dH2O 9.5 μL、隨機引物1 μL、RNase inhibitor 1 μL、 AMV反轉錄酶0.5 μL、病毒RNA 8 μL，反應條件為：37℃ 90 min、42℃ 15 min、95℃5 min。

(4)PCR產物的擴增

以E1引物及PrM1引物，對分離株分別進行E基因和PrM基因擴增。利用Taq酶進行PCR，其反應體系為：10×buffer 2.5 μL，dNTP(mmol)2.5 μL,上下游引物(E1-F/E1-R或PrM1-F/PrM1-R)各1 μL，cDNA產物2.5 μL，Taq酶0.5μL，加去離子水總體積為25 μL，混勻后進行PCR擴增。PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環；最后72延伸5 min。

(5)PCR擴增產物的鑒定

反應結束后，取5 μLPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增結果。將電泳結果陽性的PCR產物送上海生物工程技術服務有限公司測序。測序結果與Genbank中JEV核酸序列進行比對，從分子的角度來驗證分離株是否是JEV。

1.2.6 乙腦分離株E基因的核苷酸同源性分析

利用Chen等建立的乙腦病毒基因分型方法，選擇乙腦病毒E區的部分核苷酸序列，對3株分離株與已知的23株乙腦病毒代表株序列一起進行核苷酸同源性分析，構建乙型腦炎病毒遺傳進化樹[8，9，13]。

2 結果

2.1 病毒的分離

25個豬腦組織接種BHK21細胞，有3個腦組織(編號分別為3、12、23)接種的BHK21細胞72 h之內發生明顯CPE，而且CPE達到80%以上，病變細胞表現圓縮，形成空斑。其他22個豬腦接種的BHK21細胞盲傳3代后，均無CPE出現，視為分離陰性。

2.2 病毒的鑒定

2.2.1 免疫熒光試驗

取25個豬腦組織接種的BHK21細胞滴片做免疫熒光試驗，有3、12、23號腦組織出現強綠色熒光反應，其他22個腦組織無綠色熒光反應。

2.2.2 中和試驗

3、12、23號腦組織感染細胞毒與兔抗JEV標準陽性血清反應的中和效價均為1∶64。

2.2.3 病毒形態的鑒定

電鏡下可見正常細胞內無病毒顆粒出現，核膜完整，見圖5。感染細胞核膜已被破壞，病毒顆粒有規律的排列在細胞核膜周圍，病毒顆粒呈圓形，外周有囊膜和纖維突起，直徑40 nm左右，見圖6。所分離到的3株病毒分別命名為 JDY1、JDY2、JDY3。

圖1 正常 BHK21細胞Fig.1 Normal BHK21 cells

圖2 3號腦組織感染BHK21細胞Fig.2 Virus-infected BHK21cells in the No 3 brain tissue

圖3 3號腦組織感染BHK21細胞與陰性血清反應Fig.3 Virus infected BHK21 cellsin theNo 3 brain tissueshow negative serum reaction.

圖4 3號腦組織感染BHK21細胞與陽性血清反應Fig.4 Virus-infected BHK21 cells in theNo 3 brain tissueshow positive serum reaction.

圖5 正常BHK21細胞在電鏡下的形態Fig.5 Ultrastructure of normal BHK21 cells

圖6 病毒分離株感染BHK21細胞在電鏡下的形態Fig.6 Ultrastructural morphology of virus-infected BHK21 cells

2.2.4 分離株部分核苷酸的鑒定

(1)病毒分離株RNA的提取

3株乙腦分離株、JEV標準株、正常BHK21細胞，按試劑盒說明書的操作步驟提取病毒3 μL。

(2)乙腦病毒分離株E基因和PrM基因的RT-PCR擴增及鑒定

電泳結果顯示，3株分離株均能擴增到約197 bp E基因和519 bpPrM基因的目的條帶，電泳結果見圖7和圖8。擴增到的E基因和PrM基因測序結果與Genbank JEV序列比較，同源性均在95%～98%之間。

注：M：100 bp DNA Mark；1：JDY1；2：JDY2；3：正常;BHK21細胞；4：JDY3；5：JEV。圖7 3株分離株E基因擴增電泳結果Note.M: 100 bp DNA marker; 1: JDY1; 2: JDY2; 3: Normal BHK21cells; 4: JDY3; 5: JEV.Fig.7 Electrophoresis results of E gene amplification of 3 isolates

注：M：100 bp DNA Mark；1：JEV；2：JDY1；3：JDY2；4：JDY3；5：正常BHK21細胞。圖8 3株分離株PrM基因擴增電泳結果Note. M: 100 bp DNA marker; 1: JEV; 2: JDY1; 3: JDY2; 4: JDY3; 5: Normal BHK21 cells.Fig.8 Electrophoresis results of PrM gene amplification of 3 isolates

(3)乙腦分離株的基因分型

3株分離株與Beijing-1、GB30、Nakayama、SA14-14-2等23株乙型腦炎病毒參考序列的E基因核苷酸進行同源性分析，結果顯示核苷酸同源性為95%～99%。3株分離株比較，JDY1和JDY2核苷酸同源性為99%，JDY1和JDY3核苷酸同源性為97%，JDY2和JDY3核苷酸同源性為97%。3株分離株與疫苗株SA14-14-2核苷酸同源性均為95%。

遺傳進化樹分析結果(見圖9)顯示，本次分離的3株新分離株JDY1、JDY2、JDY3與Beijing-1株親緣關系最近，3株分離株均為GⅢ型乙型腦炎病毒。

3 討論

隨著生物、醫學等學科的不斷發展，實驗用小型豬的應用越來越廣泛。近年來我國實驗用小型豬的開發利用也在逐年遞增，但大部分小型豬為開放飼養，很難避免由蚊蟲傳播感染疾病，同時JEV對豬的感染也會對實驗人員和飼養人員造成潛在威脅，尤其是乙型腦炎病毒。因此實驗用小型豬JEV預防控制也受到相關部門的重視。本實驗用于鑒定的25只小型豬是用于制定北京市小型豬地方標準做本底篩查樣本小型豬的一部分，在樣本采集之前沒有接種過JEV疫苗。實驗室同時對包括被鑒定的25只豬在內的共60只小型豬進行JEV血清抗體篩查，ELISA和IFA檢測結果顯示60只小型豬JEV抗體陽性率分別26.7%和28.3%[3，4]，與文獻報道相符(20%～30%)[12]。被鑒定的25只小型豬ELISA和IFA檢測JEV抗體陽性率均為24.0%(6/25)。雖然胡燕等(2006)和楊欣艷等(2007)分別通過血清學方法對北京小型豬感染JEV進行了報道，但并沒有對病毒進行分離鑒定[14,15]。本實驗通過病毒分離鑒定和抗體檢測說明北京小型豬確實存在JEV的感染，同時實驗也為北京市小型豬地方標準的修訂及其不斷完善提供了科學的參考數據。北京市于2011年發布了地方標準《實驗用小型豬微生物學等級及監測》，將乙型腦炎病毒作為普通級小型豬必須檢測項目[15]，但并沒有對普通級小型豬是否進行JEV免疫接種提出要求，只是要求接種疫苗的普通級小型豬在疫苗接種有效期內群體免疫合格率達到70%以上[16]。實際通過本實驗室近幾年對北京市小型豬JEV的檢測，還有部分豬場沒有定期接種JEV疫苗或者沒有完全按JEV免疫接種程序進行接種。定期按免疫程序接種疫苗的豬場，免疫合格率基本均能達到70%以上。通過本實驗及文獻[14]和文獻[15]，建議豬場對普通級小型豬進行JEV疫苗的免疫接種，既能保障豬群免受JEV感染，也能保障飼養人員與實驗人員的安全。

實驗采用BHK21細胞培養法從25個小型豬腦組織中分離出3株疑似為JEV的毒株，根據細胞病變情況，說明能分離到活的病毒；3株分離株病變細胞滴片與JEV抗血清能夠產生強綠色免疫熒光反應；3株分離株細胞毒能中和JEV標準抗血清，中和效價均為1：64；3株分離株經掃描電鏡形態鑒定，為直徑約為40nm的有囊膜病毒，符合JEV特征；經E基因和Prm基因部分核酸序列分析，與GenBank中JEV核苷酸同源性為95%～99%。充分證明分離到的3株豬源病毒為JEV。

本實驗是國內首次從小型豬種群中分離到JEV。通過部分核苷酸序列分析，JDY1、JDY2、JDY3與Beijing-1核苷酸同源性分別為98%、98%和97%，與SA14-14-2 疫苗株核苷酸同源性均為95%。通過E基因遺傳進化樹分析3株分離株均為GIII JEV。

圖9 3株新分離乙腦病毒E基因系統進化樹分析Fig.9 Phylogenetic analysis of JEV E gene of three newly isolated strains

通過農業部批準SA14-14-2減毒疫苗可用于豬乙型腦炎病毒的預防接種[17]，足見國家對預防豬乙型腦炎病毒感染的重視。實驗通過對分離到得北京豬源JEV的初步鑒定，證明近年在北京流行的仍然為與SA14-14-2減毒株親緣關系很近的GIII JEV。進一步證明SA14-14-2疫苗可以用于豬感染JEV的預防接種，不僅對從源頭上控制飼養人員和實驗人員JEV的感染很有意義，而且對養豬業的發展也很有意義。

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Isolation and identification of Japanese encephalitis virus in the experimental minipigs

WANG Ji, FU Rui, LI Xiao-bo, WANG Shu-jing,GONG Wei, WEI Li, YUE Bing-fei*,HE Zheng-ming*

(National Institutes for Food and Drug Control, National Center for Quality of Laboratory Animals, Beijing 100050, China)

Objective To understand the characteristics of minipigs infected withJapanese encephalitis virus(JEV).Methods After the brain tissues were treated, the pig brain tissue treatment solution was inoculated with BHK21 cells. Then, virus culture,indirect immunofluorescence assay, neutralization test, electron microscopic observation, and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) amplification of the new isolate E segment and PrM segment nucleotide sequence were performed and the genotype was identified.Results BHK21 cells were inoculated into 25 pigbrain tissues. Among them, three tissue-treated fluid couldinduce shrinkage and aggregation of BHK21 cells, and immunofluorescence staining showed strong green fluorescence response. The results of neutralization test showed that the neutralization titer of these three new isolates was 1:64, and the size of the virus particles was about 40nm under the electron microscope. The homology of both RT-PCR product sequencing results and E-segment of vaccine strain were 95%. Three new isolates were type GIII JEV.Conclusion The results ofthisstudydemonstrate that there is G III type Japanese encephalitis virus infection in the minipig farm.

Japanese encephalitis virus, JEV; Isolation; Identification

王吉(1974-)，女，副研究員，從事微生物學和免疫學研究。Email:wj_nd_jds@sina.com

岳秉飛(1960-)，男，研究員，研究方向：實驗動物學。Email：y6784@126.com 賀爭鳴(1957-)，男，研究員，研究方向：微生物學和免疫學。E-mail: zhengminghe57@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 03-0057-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.011

2016-07-25