trnH—psbA序列作為DNA條形碼在蒼耳屬雜草鑒定中的應用

袁俊杰　魏霜　馬華　龍陽 張娜 陳文 楊卓瑜

摘要：以trnH-psbA序列作為DNA條形碼，對從國外截獲的9種蒼耳屬雜草及1種國內蒼耳進行物種鑒定研究。采用DNeasyPlantMiniKit試劑盒進行總DNA的提取，應用通用引物對其trnH-psbA基因進行PCR擴增，測序得到10種蒼耳屬雜草的trnH-psbA序列，并利用MEGA7.0軟件進行比對分析構建系統進化樹。結果顯示：蒼耳屬雜草trnH-psbA基因序列共有543個位點，其中有53個變異位點，31個變異信息位點，22個單突變位點，30個堿基缺失；種間遺傳距離為0～0.093，種內無遺傳差異；進化樹顯示10個蒼耳物種均處于獨立分支，能夠利用該條形碼對蒼耳屬雜草進行區分鑒定。

關鍵詞：trnH-psbA序列；DNA條形碼；蒼耳屬；雜草鑒定

中圖分類號：S451文獻標志碼：A文章編號：1003-935X（2016）02-0001-06

蒼耳屬（Xanthium）雜草是菊科的一類重要惡性雜草，該屬雜草幼苗具有毒性，威脅牲畜健康，成熟總苞具刺和喙，易刺傷牲畜及人類，且入侵性極強，一旦傳入、定植，將嚴重影響我國人畜健康和環境安全[1-2]，因此，防止蒼耳屬雜草的入侵具有重要意義。在進出口貨物中，蒼耳屬雜草種類繁多，近似種相似性較高，鑒定困難；且種子在運輸過程中總苞表面堅硬的刺以及密布的柔毛等重要鑒定特征會發生較大磨損，給形態學鑒定帶來很大的難度[3-4]。因此，建立穩定且準確的分子生物學分類方法具有重要意義。

DNA條形碼（DNAbarcoding）技術是利用1段至幾段標準的、易擴增的、種間差異顯著大于種內差異的DNA片段來鑒別物種的新技術[5-7]，是傳統植物分類與鑒定的強有力的補充。張偉等在建立檢疫性雜草銀毛龍葵的DNA條形碼檢測技術中，使用來自不同基因組的3個DNA片段（tunS-trnG、ndhF、waxy）建立快速檢測方法，并在此基礎上探討這3個基因作為茄屬條形碼輔助片段的可能性[8]；陳冬美分析了毒麥屬種內和種間rDNAITS區序列的差異來快速分辨鑒定6個近似種，結果與形態學分類基本一致[9]；Gao等針對菊科494屬2315種3490個樣品進行最佳條形碼篩選，提出以ITS2作為條形碼，鑒定效率達76.4%[10]。以上研究均表明DNA條形碼技術已經運用在雜草鑒定上，具有一定的可行性，對口岸快速鑒定雜草籽具有重要的意義。

在口岸鑒定中須將雜草籽鑒定至種，屬于精確的物種鑒定，然而，傳統的形態學鑒定方法需要很強的專業知識和經驗，受鑒定人主觀意識影響較大，所以應該在形態學初步鑒定的基礎上（鑒定至科屬水平較容易），探索分子層面鑒定物種的可能性。DNA條形碼技術能夠在較短時間內建成易被利用的應用系統，使標本鑒定過程實現自動化和標準化，突破對經驗的過度依賴，在物種分類和鑒定方面展示出強大的生命力。trnH-psbA片段是進化速率最快的葉綠體間隔區之一，片段兩端存在75bp的保守序列，便于設計通用引物。該片段引物通用性較好，擴增成功率較高，并且平均長度較短（大多數在450bp左右），有利于對降解材料擴增[11]。本研究以trnH-psbA序列作為DNA條形碼，對10種蒼耳屬雜草進行物種區分鑒定研究，旨在為口岸雜草鑒定工作提出新思路。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用的蒼耳屬雜草種子樣本是從近5年的進境糧谷（美國黃大豆、巴西黃大豆、烏克蘭玉米、澳大利亞油菜籽、加拿大油菜籽、美國高粱等）中截獲的，具體情況如表1所示，經中國檢驗檢疫科學研究院鑒定，憑證標本保存于湛江出入境檢驗檢疫局。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取

采用改良后的DNeasyPlantMiniKit試劑盒法提取DNA，得到200μLDNA樣品，于-20℃冰箱保存。

1.2.2PCR擴增和電泳檢測

引物序列為trnH-psbAf-5′GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；trnH-psbAr-5′CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。PCR反應使用寶生物工程（大連）有限公司的rTaq酶進行擴增，反應采用50μL體系：3μLDNA模板，5μL10×PCRbuffer，4μLdNTPs，0.25μLrTaq，各1μL正反引物，補充ddH2O至50μL。trnH-psbA的PCR條件：95℃4min；94℃30s，52℃1min，72℃1min，35個循環；72℃10min；4℃冷卻。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、凝膠成像分析系統分析。

1.2.3測序及拼接

使用ABI3730XL測序儀（AppliedBiosystemsCo.，USA）對PCR產物進行雙向測序。利用序列拼接軟件CodonCodeAlignerV3.7.1對測序峰圖文件進行剪切拼接，去除引物區及低質量序列。使用Clustalt和MEGA7.0軟件對拼接后的序列進行比對分析并構建進化樹。

2結果與分析

2.1PCR結果

從圖1可看出，10種蒼耳屬雜草的trnH-psbA序列擴增條帶單一清晰，無特異性條帶及拖尾現象，與marker對比可知，該擴增產物大小接近500bp，與預期大小一致。登陸NCBI，將拼接后的序列進行BLAST檢測，結果證明10種蒼耳屬雜草的trnH-psbA序列擴增及測序成功。

2.2堿基構成分析

利用MEGA7.0軟件對10種蒼耳屬雜草進行ClustalW校對，校對后的序列繼續用MEGA7.0進行分子進化遺傳分析。從表2可以看出，蒼耳屬雜草trnH-psbA序列的G、A、C、T堿基的變化范圍依次減小，分別為1.3%、1%、1%、0.9%。其中，G堿基含量最高的是刺蒼耳，為15.1%，最低的是北美蒼耳、球果蒼耳、西方蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳，均為13.8%；A堿基含量最高的是北美蒼耳、球果蒼耳、西方蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳，均為33.3%，最低的是蒼耳，為32.3%；C堿基含量最高的是柱果蒼耳、意大利蒼耳、河岸蒼耳，為12.8%，最低的是刺蒼耳，為11.8%；T堿基含量最高的是柱果蒼耳、意大利蒼耳、河岸蒼耳，均為40.8%，最低的是刺蒼耳，為39.9%。

2.3基因位點分析

由MEGA7.0測算可知，蒼耳屬雜草trnH-psbA序列共有543個位點，其中490個保守位點、53個變異位點、31個變異信息位點、22個單突變位點，30個堿基缺失（表3）。

2.4遺傳距離分析

同一地區樣本的不同個體序列完全相同，種內遺傳距離為0。利用MEGA7.0軟件，采用Tajima-Nei模型計算種間遺傳距離（表4），蒼耳屬雜草trnH-psbA序列的遺傳距離最高值為0.093，為刺蒼耳與柱果蒼耳、意大利蒼耳、河岸蒼耳的遺傳距離；最小值為0.000，為北美蒼耳與球果蒼耳、西方蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳的遺傳距離。這說明雖然北美蒼耳與球果蒼耳、西方蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳從序列上看，于449～458位點存在片段缺失差異，但在Kimura2-parameter模型中被忽略不計，所以從遺傳距離上無法區分。

2.5系統進化發育樹

利用MEGA7.0軟件，采用Neighbor-Joining方法構建系統發育樹（圖2），蒼耳、刺蒼耳被分為一支；柱果蒼耳、意大利蒼耳、河岸蒼耳被分為一支；北美蒼耳、球果蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳、西方蒼耳被分為一支；對其進行Bootstrap檢驗，其分組支持率為100%，說明這3支蒼耳屬雜草在系統進化發育中是相互獨立的。柱果蒼耳、意大利蒼耳、河岸蒼耳又被劃分為3個不同級別的分支，但其Bootstrap檢驗支持率較低，說明這3種蒼耳屬雜草獨立性相對較弱。北美蒼耳、球果蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳、西方蒼耳也被分為各自獨立的分支，但其Bootstrap檢驗支持率較低，說明這5種蒼耳屬植物獨立性相對較弱。

3結論與討論

蒼耳屬雜草種間的傳統鑒定方法主要依賴于形態鑒定，依靠總苞的大小、顏色，苞刺的長短、疏密、碾去時的難易程度及果柄橫切面和總苞表皮毛茸的顯微特征等方面[12]。近些年發展為化學分析層面，從果實粉末的薄層色譜、紫外吸收光譜的差異分析來區分蒼耳屬種間的親緣關系[13]。然而在蒼耳屬雜草檢疫鑒定過程中存在鑒定材料不完整、化學分析耗時長等問題，難以滿足過關檢疫快速準確的要求，因此筆者依據當代分子生物學技術，利用DNA條形碼技術，開發了可適用于蒼耳屬雜草的鑒定條形碼trnH-psbA序列。從試驗結果可以看出，trnH-psbA序列可作為DNA條形碼對10種蒼耳屬雜草進行區分，9種檢疫性蒼耳可與本地蒼耳進行鑒定區分；將10種蒼耳屬雜草分為3個大類群，并在基因位點上進一步區分，各不同檢疫性蒼耳處于獨立分支，可通過構建進化樹進行區別。但不足之處是，柱果蒼耳、意大利蒼耳、河岸蒼耳僅在序列397位存在點突變，在進化樹中分支的Bootstrap支持率較低；西方蒼耳、賓州蒼耳在序列上完全相同，不存在變異變點，在進化樹中分支的Bootstrap支持率較低。為了更好地區分其他蒼耳物種之間的區別，建議開發其他條形碼序列進行補充。

參考文獻：

[1]伏建國，安榆林，楊曉軍.雜草風險分析概述[J].植物檢疫，2009，23（增刊1）：39-44.

[2]諶運清，劉翔，楊萬風，等.進境大豆植物檢疫截獲疫情分析及工作建議[J].植物檢疫，2009，23（增刊1）：61-64.

[3]熊穎，劉啟德，宓穗卿.蒼耳子化學研究進展[J].廣東藥學，2005，15（6）：65-68.

[4]高銳紅，龔大坤，張星明.蒼耳子及其偽品單喙蒼耳子的比較鑒別[J].中藥材，2001，24（6）：410-411.

[5]CBOLPlantWorkingGroup.ADNAbarcodeforlandplants[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，2009，106（31）：12794-12797.

[6]丁潛，邢光東，胡肄農，等.識別杜洛克豬個體身份的DNA條形碼[J].江蘇農業學報，2014，30（5）：1058-1063.

[7]HollingsworthPM，GradamSW，LittleDP.ChoosingandusingaplantDNAbarcode[J].PlosOne，2011，6（5）：e19254.

[8]張偉，范曉虹，邵秀玲，等.DNA條形碼在檢疫性雜草銀毛龍葵鑒定中的應用研究[J].植物檢疫，2013，27（3）：60-65.

[9]陳冬美.毒麥屬6個種的分子檢測檢疫應用研究[D].長沙：湖南農業大學.2007.[ZK）]

[10]GaoT，YaoH，SongJ，etal.EvaluatingthefeasibilityofusingcandidateDNAbarcodesindiscriminatingspeciesofthelargeAsteraceaefamily[J].BMCEvolutionaryBiology，2010，10（1）：324.

[11]程佳月，王麗華，彭克美，等.國際生命條形碼計劃-DNABarcoding[J].中國畜牧獸醫，2009（8）：49-53.

[12]呂益濤，侯海宮，蘇耀海，等.蒼耳屬植物的鑒別研究[J].中國中藥雜志，2001，26（1）：17-20.

[13]阮貴華，李攻科.蒼耳子的化學成分及其分離分析研究進展[J].中成藥，2008，30（3）：421-426.