轉基因成分的檢測方法綜述

阮先樂+張杰

摘要：隨著轉基因生物在全世界的廣泛應用，轉基因成分檢測技術越來越受到廣大消費者、各國政府及相關機構人員的重視。本文從聚合酶鏈式反應（PCR）檢測技術、環介導等溫擴增檢測技術、近紅外光譜檢測技術、生物傳感器檢測技術、生物芯片檢測技術和蛋白質檢測技術等方面進行綜述，并提出今后轉基因成分檢測技術的發展趨勢和研究方向。

關鍵詞：轉基因；成分；檢測方法

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0012-03

達及轉基因生物對環境、食用安全性的影響，從而建立一套高效的技術研究體系；另一方面，轉基因生物安全管理部門也有必要建立一套轉基因成分檢測技術標準，使各項工作得以順利實施。2002年歐盟要求對轉基因產品從生產、運輸、保存、銷售等過程進行全程的跟蹤和檢測[1]。現在已有65個國家和地區對轉基因產品采取強制性的標志管理制度，但也有一些國家和地區采取自愿標志模式[2]。2014年5月27日，我國農業部發布《農業部關于進一步加強農業轉基因生物安全監管工作的通知》，要求各級農業部門，要以水稻、玉米、大豆和油菜種子為重點，依法嚴厲查處非法生產、加工、銷售轉基因種子的行為。2015年10月1日起施行的《中華人民共和國食品安全法》第六十九條明確要求生產經營轉基因食品應當按照規定顯著標志。

1轉基因成分檢測技術

1.1PCR檢測技術

PCR檢測技術是一種靈敏度高、技術較成熟的轉基因成分檢測方法。根據特異性的不同可把它分為篩查法、目的基因特異性、構造特異性和事件特異性4種方法[3]。檢測的主要基因包括調控基因、標記基因和目的基因，其中調控基因包括啟動子和終止子。常用的啟動子是花椰菜花葉病毒CaMV 35S，終止子是脂肪堿合成酶NOS，標記基因有Barr（抗草丁膦基因）、Kmr（抗卡那霉素基因）、Neor（抗新霉素基因）、Hygr（抗潮霉素基因）[4]。目前，PCR檢測技術已經成功地應用在玉米、大豆、水稻和小麥的轉基因成分檢測上[5-8]。

轉入多個目標基因，需要用多重PCR技術進行檢測，這種技術不但能提高檢測效率，而且能夠有效地防止假陽性。魏霜等研究表明，以水稻內源基因SPS、外源抗蟲基因CrylAb、外源抗蟲基因CrylAb/Ac、外源抗蟲基因Btc、報告基因GUS、NOS終止子和CaMV 35S啟動子為檢測對象，建立的7重PCR體系能有效地檢測出水稻中的轉基因成分，檢測過程比較簡便，特異性比較好[9]。利用此項技術，在煙葉、甘蔗、大豆、玉米、柑橘和棉花上都成功地檢測到轉基因成分[10-15]。

目前，許多國家和地區對轉基因產品規定了最低閾值，如歐盟和俄羅斯為0.9%，日本和中國臺灣為5.0%，韓國為30%[16]。為此，須要采用實時熒光定量PCR技術保證轉基因成分的定量檢測。沈元劼等用實時熒光定量PCR研究棉花黃萎病菌，檢測靈敏度為100 copies/μL[17]。仇有文等采用實時熒光定量PCR技術檢測耐除草劑轉基因大豆 A5547-12，結果表明定量PCR檢測方法的LOD和LOQ分別是1、10 copies/μL[18]。王盛等采用實時熒光定量PCR技術檢測轉基因煙草中外源綠色熒光蛋白基因（GFP）的拷貝數，在檢測的5株轉基因煙草中，GFP基因的拷貝數分別為5、8、19、28、45個，非轉基因煙草植株的GFP基因拷貝數為0[19]。

1.2環介導等溫擴增檢測技術

2000年Notomi等發明了一種新的DNA擴增方法，即DNA環介導等溫擴增技術（loop mediated isothermal amplification，簡稱LAMP）[20]。這種技術對目的基因6個不同區域分別設計了4種不同的特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下反應，從而完成核酸的擴增。邵碧英等研究表明，建立的LAMP檢測方法能穩定、特異地檢測轉基因大豆 A2704-12品系，檢測限達到了0.1%[21]。閆興華等對玉米LY038中cordapA基因建立的LAMP擴增技術靈敏度高、特異性好、穩定性較高[22]。陳金松等用LAMP法針對玉米表達載體的花椰菜花葉病毒CaMV 35S進行檢測，結果表明，這種方法特異性高、用時少、成本較低，為檢測轉基因玉米提供了一種更加簡便快速的方法[23]。王永等建立的轉基因水稻中crylAc基因的LAMP檢測法比傳統的PCR檢測方法最低定性檢測限高10倍，它非常適合抗蟲轉基因水稻的快速檢測[24]。

1.3近紅外光譜分析檢測技術

近紅外光譜是介于可見光譜和中紅外光譜之間的電磁波，波長范圍在780～2 526 nm之間，它不會對人體有任何傷害，也不會對周圍的環境造成污染，同時這項技術對大多數樣品不需要進行預處理就可以直接測量，真正地做到低成本、快速、實時和無損測量[25]。2002年，Farid首次提出利用近紅外光譜可以解決聚合酶鏈式反應法和酶聯免疫法在轉基因農產品檢測中所存在的問題[26]。

閆靈采集了金龍魚等6個品牌的菜籽油，利用近紅外光譜儀對117份樣品進行了全譜段的光譜采集，結果表明，基于近紅外光譜的轉基因菜籽油快速鑒別方法是可行的[27]。翟亞鋒等對不同品種的9個轉基因小麥樣品種子分別建立了鑒別模型，通過近紅外光譜儀掃描獲得光譜數據，結果表明該方法具有較高的鑒別準確度，可以作為一種快速無損的轉基因小麥種子鑒別方法[28]。吳江等利用近紅外光譜分析儀對大豆掃描得到反射光譜，應用主成分分析結合反向傳播（backpropagation，簡稱BP）神經網絡法分析鑒別，結果說明近紅外光譜結合主成分分析和BP神經網絡法能無損快速準確地鑒別轉基因大豆[29]。芮玉奎等以轉基因棉花及對照作為試驗材料，利用近紅外光譜儀對轉基因棉花及對照根際土壤和非根際土壤中的全氮和有機質進行分析研究，同時利用標準的方法進行對比檢測，結果表明近紅外檢測樣品的結果與標準方法結果無明顯的差別[30]。唐麗娟等運用傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）技術分析過量表達HPS/PHI轉基因與野生型天竺葵在甲醛脅迫下體內各物質含量的變化規律及光譜表征，結果表明FTIR可作為一種鑒定有甲醛光合同化途徑的轉基因天竺葵與野生型天竺葵表型差異的新技術[31]。

1.4生物傳感器檢測技術

生物傳感器是利用細胞、組織、酶或免疫制劑等生物識別元件的特異性生物化學反應，借助光、電等各種信號對化學物質進行檢測的一類裝置[32]。該技術具有高靈敏度、高特異性、實時和快速等優點，在環境檢測、食品和發酵等方面得到了廣泛的應用[33-35]。近年來，隨著轉基因產品逐漸走入人們的生活及生物產業的迅猛發展，生物傳感器在轉基因產品檢測方面也發揮了越來越重要的作用。王學亮等利用DNA電化學生物傳感器對外源草甘膦乙酰轉移酶基因片段進行檢測，檢出限是0.032 nmol/L[36]。許凱等利用DNA電化學生物傳感器定量檢測根癌農桿菌終止子基因片段，檢出限是0081 nmol/L[37]。茹柿平以轉基因作物中常見的CrylAb蛋白為檢測對象，利用電化學免疫生物傳感器技術實現了對CrylAb蛋白的定量檢測[38]。王健通過研究表明，DNA生物傳感器對NPT-[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因中特異片段的準確檢測可作為一種通用方法應用于許多轉基因植物的快速鑒定[39]。肖守斌建立的表面等離子共振生物傳感檢測系統能夠靈敏、快速、簡單地用于轉基因玉米的檢測[40]。

目前生物傳感器的應用受到穩定性、重現性和使用壽命的限制，再加上轉基因生物成分的復雜性，使得實現商業化的生物傳感器數量受到制約。但隨著計算機技術、微制造技術和生物材料的不斷發展，生物傳感器技術在轉基因成分檢測領域的應用會越來越廣泛。

1.5生物芯片檢測技術

所謂生物芯片是指采用微加工技術在玻璃、尼龍膜等固體材料上構建微型生物化學分析系統，從而對細胞、核酸片段、蛋白質、糖類及脂類等進行準確、快速和高通量的檢驗。按照生物芯片上固化材料的不同，可分為蛋白質芯片、基因芯片、組織芯片和細胞芯片等。汪琳等建立的對Cry1Ac蛋白、植酸酶蛋白、Cry1Ah蛋白等3種轉基因成分的蛋白芯片檢測技術，具有較高的靈敏性、特異性和可靠性[41]。武海斌等采用基因芯片技術結合多重PCR，能夠在l張芯片上同時有效地檢測及鑒定7種轉基因玉米，大大提高了檢測的準確率和效率[42]。劉烜等利用基因芯片技術對轉基因玉米中相關轉基因成分的研究表明，此項技術的檢測靈敏度可達到01%[43]。周萍萍等建立的轉基因大豆基因芯片檢測技術，對CaMV 35S啟動子、NOS終止子和外源基因[WTBX][STBX]CP4EPSPS[WTBZ][STBZ]的檢測靈敏度均達到0.45%[44]。

生物芯片技術在轉基因成分檢測中所發揮的作用越來越受到人們的重視，但還需要依賴生物基因數據庫的不斷建立和完善，依賴于該技術可靠性和特異性的不斷提高，才能夠在以后的轉基因成分檢測中發揮更大的作用。

1.6蛋白質檢測技術

1.6.1酶聯免疫吸附測定（ELISA）法

利用抗原抗體反應，對樣品中的蛋白質進行定性或定量檢測。王新桐等采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法定量檢測轉基因棉花中新霉素磷酸轉移酶（NPT Ⅱ）基因，結果表明該方法具有良好的應用價值和應用前景[45]。劉志浩等采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法定量檢測轉基因玉米中膦絲菌素乙酰轉移酶（PAT）基因，結果表明該方法對轉基因玉米中的PAT蛋白能夠進行準確、特異和有效的檢測[46]。

1.6.2蛋白質印跡（Western Blot）雜交法

利用Western Blot分子雜交技術特異性檢測目的蛋白質，它可以確定一個樣品中是否含有低于或高于一定水平的目標蛋白質，特別適合不溶性蛋白質的檢測和分析。楊爍等采用Western Blot分子雜交技術對轉基因水稻中的HPT蛋白質進行分析，結果表明只需要單粒種子的1/10就可以確定是否含有HPT蛋白質成分[47]。蘭金蘋等采用Western Blot分子雜交技術對NPTⅡ蛋白質在轉基因水稻中的表達特征進行了研究，結果表明苗期葉片中這種蛋白質的含量約為其鮮質量的0.08‰[48]，該蛋白質在水稻不同的發育時期、不同的器官和組織中表達量有所不同。

2討論

PCR和LAMP這2種檢測技術在實際運用中，存在引物設計的特異性、核酸的提取質量、產品在加工過程中產生的抑制劑等問題，在一定程度上限制了這2種檢測技術的應用。蛋白質檢測技術的問題是由于蛋白質在深加工過程中容易失去抗原性，此項技術也不適合深加工轉基因產品的檢測。近紅外光譜技術、生物傳感器技術和生物芯片要求技術含量高，操作比較復雜，數據分析也比較麻煩。綜上所述，在進行轉基因成分檢測時，無論采用哪一種方法，都需要針對轉基因產品進行大量的試驗，弄清楚如何提取DNA、如何建立反應體系、如何進行分析和描述等工作。綜合運用基因水平、蛋白質水平的檢測技術，綜合運用定性和定量檢測技術。從而為轉基因產品的研究和安全評估提供可靠的技術保障體系。

隨著轉基因技術的發展，將來會有越來越多的轉基因產品走進人們的生活，對轉基因成分的檢測技術也提出了更高的要求，向著快捷、簡便、靈敏、高效的方向發展，同時向著一次性、可視性的轉基因成分檢測方向發展。

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