黃瓜耐低氮生理與分子機制

范蓮雪+郝寧+張天怡+陳煥軒+秦智偉+武濤

摘要：為理解和闡述黃瓜耐低氮的生理與分子機制，以前期試驗篩選出的耐低氮性強的黃瓜品種D0328和耐低氮性弱的黃瓜品種D0422為材料，于2014年4—7月對二者在低氮脅迫（3 mmol/L NO-3）和正常氮（14 mmol/L NO-3）下生理和分子指標的變化規律及差異進行研究。結果表明，在低氮脅迫下，耐低氮性不同的2個黃瓜品種D0328和D0422在整個生長發育的關鍵時期（苗期、抽蔓期、盛果期），氮素吸收相關生理指標，如地上和地下部分硝態氮含量，地上和地下部分總氮含量沒有顯著差異；氮素同化相關生理指標，如硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）活性也沒有顯著差異；同時，與氮素吸收和同化相關基因響應模式一致。然而，在低氮脅迫下的盛果期，D0328的可溶性蛋白質含量顯著低于D0422，暗示其可能具有較高的氮素再循環效率；同位素示蹤結果進一步證明，D0328具有比D0422高的氮素再循環效率。根據上述規律證明，氮素再循環效率是影響黃瓜耐低氮能力的關鍵因子之一。

關鍵詞：黃瓜；耐低氮；氮素再循環；低氮脅迫；生理變化；分子機制

中圖分類號： S642.201文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0117-05

氮素作為一種大量礦物質元素，是核苷酸和蛋白質的主要成分。它不僅是植物細胞中許多重要結構遺傳和代謝等復合物的重要組成部分，也是葉綠素和能量轉換復合物（如ATP等）的主要組成成分，因此被絕大多數植物在整個生長發育階段所需要[1-4]。在大多數的農業種植體系中，氮肥的供應通常影響作物產量，包括黃瓜（Cucumis sativus L.）等園藝作物。農民盲目施用過量氮肥也會造成環境惡化、生產成本增加、黃瓜硝酸鹽含量超標等現象[5-7]。為解決這一系列問題，深入研究黃瓜耐低氮的機制是必要且漫長的過程。

隨著黃瓜耐低氮機制研究的陸續開展，現已取得了一些成果。徐志遠將黃瓜的經濟產量、株高、真葉面積、根體積、根干質量、葉綠素含量6個指標確定為鑒定黃瓜耐瘠薄指標[8]。于明磊等以葉綠素b含量為黃瓜耐低氮性最佳的評價指標，篩選出耐低氮性最強品種D0328和耐低氮性最弱品種D0422，并進行了相關特性的分子標記[9]。徐靜靜等從生理角度發現耐低氮能力強和耐低氮能力弱的黃瓜葉片總氮含量、硝酸還原酶活性、葉綠素含量、葉片干質量、葉面積等指標在生育期內響應低氮脅迫的模式均沒有顯著差異，之后也對根系相關指標的變化進行了分析[10-11]。馮卓對耐低氮能力弱的黃瓜品種在低氮脅迫下幼苗葉片在轉錄水平及蛋白質水平進行了差異比較[12]。何紅梅等對低氮脅迫下黃瓜鈣依賴蛋白激酶基因CsCDPK進行了克隆、表達分析及遺傳轉化[13]。馮卓等對谷氨酰胺合酶基因[WTBX][STBX]GS1[WTBZ][STBZ]和黃瓜硝酸鹽轉運蛋白基因[WTBX][STBX]CsNRT1.5[WTBZ][STBZ]等進行了克隆與表達分析[14-15]。然而，從不同發育時期結合氮素吸收、同化和再循環相關生理及分子指標了解影響黃瓜耐低氮能力重要因子的報道尚未出現。

植物的氮素代謝過程主要包括氮素吸收、同化、再循環3個階段。植物吸收系統對硝酸鹽吸收具有不同的親和性：高親和系統和低親和系統。每個高親和性與低親和性的硝酸鹽轉運系統都由組成型和硝酸鹽誘導型組成[16]。根部吸收獲得的硝酸鹽一小部分直接在根部被同化吸收，很大一部分被運輸到莖部，首先在硝酸還原酶（NR）的作用下在細胞質中被還原成亞硝酸鹽，然后在質體中被亞硝酸還原酶還原成銨鹽，再在谷氨酰胺合成酶（GS）的作用下催化氨的同化，使其轉變成谷氨酰胺（Gln）和谷氨酸（Glu）[17]。在植物的營養生長階段，葉片是氮的存儲器，在后期衰老過程中，這些氮多數以氨基酸的形式被再循環利用，而葉綠體是一個重要的氮再動員庫，因為它包含了大約80%的葉片總氮并以蛋白質的形式存在其中[18-19]。植物中氮素含量、硝態氮含量以及可溶性蛋白質含量直接反映作物體內氮素積累與代謝情況，是研究作物氮素營養、氮素同化利用與再利用狀況的重要指標[20]。NR和GS活性決定氮素的代謝速度，也能反映植物體內氮素狀況[21]。另一方面，低氮在遺傳學角度的相關研究也已經被報道，如水稻等耐低氮能力的QTL定位分析等[22]。盡管這些指標在許多作物中已被研究報道，并且存在較大差異，但在黃瓜上進行全面研究的報道比較少，因此為深入研究黃瓜耐低氮機制提供了理論支持。

本研究以耐低氮性強的D0328和耐低氮性弱的D0422這2個黃瓜品種為材料，對二者在低氮脅迫下3個關鍵發育時期（苗期、抽蔓期、盛果期）的氮素吸收、代謝、再循環相關生理和分子生物學指標進行比較分析，以此確定影響黃瓜耐低氮能力的關鍵因子，為下一步深入探究黃瓜耐低氮機制提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

筆者所在實驗室前期篩選出的耐低氮性最強的黃瓜品種D0328和耐低氮性最弱的黃瓜品種D0422種子，由東北農業大學園藝學院黃瓜課題組提供[9]。

1.2方法

1.2.1播種

將D0328和D0422種子催芽后，直播于 8 cm×8 cm的全蛭石營養缽中，待其子葉展平，將幼苗移栽到規格一致、盛等體積蛭石的塑料桶中，于2014年4月開始，在東北農業大學園藝學院試驗站開展以下試驗。

1.2.2低氮處理試驗

待上述2個黃瓜品種子葉展平時，用低氮（3 mmol/L NO-3）和正常氮（14 mmol/L NO-3）的營養液進行處理，基礎營養液配方[23]為1.512 mmol/L NaH2PO4·2H2O，0.257 mmol/L Na2HPO4·12H2O，1.500 mmol/L MgSO4·7H2O，4.000 mmol/L Ca（NO3）2·4H2O，6.000 mmol/L KNO3，8.600 μmol/L C10H12FeN2NaO8·3H2O，10.300 μmol/L MnSO4，1.000 μmol/L CuSO4·5H2O，30.000 μmol/L H3BO3，24.000 nmol/L Na6Mo7O24· 4H2O，130.000 nmol/L CoCl2·6H2O。分別在苗期（37 d）、抽蔓期（50 d）、盛果期（63 d）取材（根和第3～5節位葉片），一部分保存于-20 ℃用于生理指標測定，另一部分用液氮速凍后保存于-80 ℃，用于總RNA的提取。

1.2.315N同位素示蹤試驗

2個同位素示蹤試驗分別用于檢測營養生長階段（苗期至抽蔓期）和生殖生長階段（抽蔓期至盛果期）的氮素再循環效率。用含有15N的14 mmol/L NO3-營養液進行處理，Ca（15NO3）2·4H2O（豐度為10%）和K15NO3（豐度為10%）代替Ca（14NO3）2·4H2O和K14NO3，基礎營養液配方如“1.2.2”節所述。

營養生長階段的同位素試驗：子葉展平時，進行15N處理，35 d（T1）時取根和全部標記葉片為初始葉片，剩余植株洗根后用14N營養液處理，42 d（T2）時取標記葉片為初始葉片、新葉、根和花器官。

生殖生長階段的同位素試驗：子葉展平時，進行15N處理，42 d（T3）時取根和全部標記葉片為初始葉片，剩余植株洗根后用14N營養液處理，64 d（T4）時取標記葉片為初始葉片、新葉、根和花器官；每個處理3次重復。

15N的含量計算方法參照Diaz等所述[24]。

1.3生理指標測定

硝態氮含量采用水楊酸比色法[25]測定；總氮含量釆用凱氏定氮法[25]測定；NR活性測定、GS活性測定、可溶性蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法[25-26]。

1.4總RNA提取、cDNA第一鏈合成及qRT-PCR

采用Trizol法提取黃瓜葉片總RNA，并用SAM 1000超微量紫外分光光度計檢測RNA質量。

按照TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉錄試劑盒說明書，以總RNA為模板進行逆轉錄反應，合成 cDNA 的第一鏈。

依照TOYOBO公司的SYBRGreen Realtime PCR Master Mix說明書，以上述cDNA為模板進行qRT-PCR分析，基因引物序列見表1，參照基因為[WTBX][STBX]1.5數據處理

采用DPS 9.50數據處理系統軟件進行生物學統計分析。

2結果與分析

2.12個黃瓜品種在低氮脅迫下氮素吸收能力的比較

植物在低氮脅迫下，可吸收的氮素減少，其體內的硝態氮含量及總氮含量會相應降低。圖1表明，在整個發育時期，D0328和D0422在低氮脅迫下，地上、地下部分硝態氮含量以及地上、地下部分總氮含量都低于正常氮處理，且2個品種在低氮脅迫下的變化幅度一致，說明2個黃瓜品種具有相似的氮素吸收能力，也暗示氮素吸收能力并不是引起2個品種耐低氮能力差異的主要原因。

2.22個黃瓜品種在低氮脅迫下氮素同化能力的比較

NR和GS都參與氮同化過程，在植物氮素代謝過程中起著重要作用，并且對外界氮素濃度的反應比較敏感。從圖2可以看出，2個耐低氮能力不同的黃瓜品種在低氮脅迫下，地上、地下部分NR活性基本呈現顯著降低的趨勢。在37、50、63 d時NR活性和GS活性在2個品種間的變化并沒有明顯的規律，這一點說明氮素代謝能力并不是黃瓜具有較強耐低氮性的主要原因。

利用qRT-PCR對黃瓜生殖生長階段葉片中氮素吸收和代謝相關基因的表達模式進行分析發現，2個黃瓜品種在低氮脅迫下

2.42個黃瓜品種在低氮脅迫下氮素再循環效率比較

可溶性蛋白質是氮素再循環的一個重要來源和指標。圖4結果顯示， D0328葉片中可溶性蛋白質含量在苗期、抽蔓期

和盛果期均顯著低于正常氮條件下，而D0422地上部分可溶性蛋白質含量在苗期和抽蔓期并沒有顯著改變，卻在盛果期明顯減少（圖4-a）；而且在盛果期D0328低氮脅迫下葉片中的可溶性蛋白質含量減少75%，D0422減少57%（圖4-a）；而2個品種根部的可溶性蛋白質含量在3個時期并沒有明顯減少（圖4-b）。蛋白質降解是氮素再循環的必要過程之一，這些結果表明在生殖生長階段即盛果期，D0328比D0422具有更高的氮素再循環效率。

2.52個黃瓜品種生殖生長時期的氮素再循環能力比較

15N同位素示蹤試驗進一步證明，在營養生長階段（T1—T2），2個品種初始葉片中15N的分配比例相似，說明具有相似的[CM（25]氮素再循環效率（圖3結論與討論

植物在遭受低氮脅迫時，體內會發生一系列的生理生化適應性反應[27]。許多研究表明，在低氮條件下，作為氮素同化的關鍵酶NR和GS活性降低，蛋白質含量也隨之下降[28-29]。然而，對于不同作物及不同部位對低氮的響應也存在差異，例如，Kant等在研究鹽芥比擬南芥耐低氮脅迫的機制時發現，與充足的氮處理相比，低氮脅迫下鹽芥根和莖中的NR活性變化不大，擬南芥的NR活性在根和莖中分別下降3.4倍和3.7倍；鹽芥和擬南芥的GS活性不受低氮脅迫影響，變化不大；擬南芥的可溶性蛋白質含量都下降，但是鹽芥的下降比例少[30]。以上研究結果與本試驗結果產生的差別可能是由于作物種類及研究部位的不同引起的。

同位素示蹤技術在研究植物氮素吸收、轉運和積累中被廣泛應用[35-37]。本試驗通過對2個耐低氮能力不同的黃瓜品種中營養生長階段和生殖生長階段的氮素再循環效率進行比較發現，D0328在生殖生長階段的氮素再循環效率高于D0422，在營養生長階段并無區別。

本研究從黃瓜生長發育的3個關鍵時期，對2個耐低氮性不同黃瓜品種的氮素吸收、代謝和再循環效率進行分析。結果顯示，耐低氮性強的D0328的氮素再循環效率高于耐低氮性弱的D0422，而氮素吸收和代謝能力相似；同時，2個品種的氮素吸收、代謝相關基因的表達模式基本一致，初步推斷黃瓜氮素再循環效率可能是影響其耐低氮性的主要因素。接下來的同位素示蹤試驗發現，在生殖生長階段2個黃瓜老葉片中的15N分配出現了不同，說明耐低氮性強的D0328在生殖生長階段的氮素再循環效率高于耐低氮性弱的D0422。從于明磊等對黃瓜耐低氮性進行的種質資源篩選中，發現從形態學角度耐低氮性強的黃瓜品種衰老延遲[9]。馮卓等對黃瓜幼苗低氮脅迫下進行轉錄組分析時，鑒定出一批響應低氮脅迫的基因，其中部分低氮響應基因與氮素再循環相關[14]。上述數據初步闡明，生殖生長階段的氮素再循環效率是影響黃瓜耐低氮性的主要因子之一。這一結論為接下來深入開展黃瓜耐低氮生理與分子機制的研究提供了重要的理論基礎。

參考文獻：

[1]Frink C R，Waggoner P E，Ausubel J H. Nitrogen fertilizer：retrospect and prospect[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1999，96（4）：1175-1180.

[2]Crawford N M，Forde B G. Molecular and developmental biology of inorganic nitrogen nutrition[J]. The Arabidopsis Book，2002，l（1）：e0011.

[3]Garnett T P，Conn V，Kaiser B N. Root based approaches to improving nitrogen use efficiency in plants[J]. Plant Cell and Environment，2009，32（9）：1272-1283.

[4]郝南青. 大豆氮素利用效率相關基因的克隆及功能驗證[D]. 北京：中國農業科學院，2013.

[5]Robertson G P，Vitousek P M. Nitrogen in agriculture：balancing the cost of an essential resource[J]. Environment and Resources，2009，34：97-125.

[6]Peoples M B，Freney J R，Mosier A R. Minimizing gaseous losses of nitrogen[J]. Nitrogen Ferlilization in the Envinnment，1995：565-602.

[7]蔣永忠，吳金桂，婁德仁，等. 氮素化肥對農業生態環境的污染及其控制措施[J]. 江蘇農業科學，1998（6）：48-50.

[8]徐志遠. 黃瓜種質資源耐氮瘠薄性的評價[D]. 哈爾濱：東北農業大學，2006.

[9]于明磊，秦智偉，徐靜靜，等. 黃瓜耐低氮基因型的篩選及遺傳分析[J]. 中國蔬菜，2011（12）：46-51.[ZK）]

[10]徐靜靜. 黃瓜耐低氮性特征特性研究[D]. 哈爾濱：東北農業大學，2011.

[11]徐靜靜，秦智偉，于明磊，等. 低氮脅迫下黃瓜根系相關指標的變化[J]. 中國蔬菜，2011（14）：47-51.

[12]馮卓. 低氮脅迫下黃瓜幼苗差異表達基因鑒定與蛋白質組學分析[D]. 哈爾濱：東北農業大學，2012.

[13]何紅梅. 黃瓜CDPK基因的克隆及遺傳轉化[D]. 哈爾濱：東北農業大學，2013.

[14]馮卓，秦智偉，武濤，等. 黃瓜細胞質型谷氨酰胺合成酶基因（[WTBX][STBX]GS1[WTBZ][STBZ]）的克隆及其在低氮條件下的表達[J]. 中國農業科學，2012，45（15）：3100-3107.

[15]馮卓，秦智偉，武濤，等. 黃瓜硝酸鹽轉運蛋白基因[WTBX][STBX] CsNRT1.5 [WTBZ][STBZ]的克隆及表達分析[J]. 東北農業大學學報，2013，44（7）：80-84.

[16]Miller A J，Fan X，Orsel M，et al. Nitrate transport and signalling[J]. Journal of Experimental Botany，2007，58（9）：2297-2306.

[17]Lam H M，Coschigano K T，Oliveira I C，et al. The molecular-genetics of nitrogen assimilation into amino acids in higher plants[J]. Annu Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biolopgy，1996，47（1）：569-593.

[18]Okumoto S，Pilot G. Amino acid export in plants：a missing link in nitrogen cycling[J]. Molecular Plant，2011，4（3）：453-463.

[19]Adam Z，Adamska I，Nakabayashi K，et al. Chloroplast and mitochondrial proteases in Arabidopsis a proposed nomenclature[J]. Plant Physiology，2001，125（4）：1912-1918.

[20]鄭殿峰，宋春艷. 植物生長調節劑對大豆氮代謝相關生理指標以及產量和品質的影響[J]. 大豆科學，2011，30（1）：109-112.

[21]陳煜，朱保葛，張敬，等. 不同氮源對大豆硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性及蛋白質含量的影響[J]. 大豆科學，2004，23（2）：143-146.

[22]鄭修文，張文會，趙志超，等. 水稻DH群體苗期耐低氮能力QTL定位分析[J]. 江蘇農業科學，2010（3）：42-43.

[23]Fujiwara T，Hirai M Y，Chino M，et al. Effects of sulfur nutrition on expression of the soybean seed storage protein genes in transgenic petunia[J]. Plant Physiology，1992，99（1）：263-268.

[24]Diaz C，Lematre T，Christ A，et al. Nitrogen recycling and remobilization are differentially controlled by leaf senescence and development stage in Arabidopsis under low nitrogen nutrition[J]. Plant Physiol，2008，147（3）：1437-1449.

[25]張志良，瞿偉菁，李小方. 植物生理學實驗指導[M]. 4版.北京：高等教育出版社，2009.

[26]趙世杰. 植物生理學實驗指導[M]. 北京：中國農業科學技術出版社，2002.

[27]王業建. 大豆對低氮脅迫的形態和生理學響應及介導低氮脅迫miRNA的鑒定[D]. 長沙：中南大學，2013.

[28]王月福，姜東，于振文，等. 氮素水平對小麥籽粒產量和蛋白質含量的影響及其生理基礎[J]. 中國農業科學，2003，36（5）：[ZK）][HT][HJ][HT][FL）]

[HT8.]513-520.

[29]陳曉飛，寧書菊，魏道智，等. 氮素營養水平對水稻幼苗氮代謝的影響[J]. 中國生態農業學報，2008，16（3）：571-575.

[30]Kant S，Bi Y M，Weretilnyk E，et al. The Arabidopsis halophytic relative Thellungiella halophila tolerates nitrogen-limiting conditions by maintaining growth，nitrogen uptake，and assimilation[J]. Plant Physiology，2008，147（3）：1168-1180.

[31]Wang R C，Xing X J，Wang Y，et al. A genetic screen for nitrate regulatory mutants captures the nitrate transporter gene [WTBX][STBX]NRT1.1[WTBZ][STBZ][J]. Plant Physiology，2009，151（1）：472-478.

[32]Filleur S，Dorbe M F，Cerezo M，et al. An Arabidopsis T-DNA mutant affected in [WTBX][STBX]Nrt2[WTBZ][STBZ] genes is impaired in nitrate uptake[J]. Febs Letters，2001，489（2）：220-224.

[33]Ho C H，Lin S H，Hu H C，et al. CHL1 functions as a nitrate sensor in plants[J]. Plant Cell，2009，138（6）：1184-1194.

[34]Hu H C，Wang Y Y，Tsay Y F. AtCIPK8，a CBL-interacting protein kinase，regulates the low-affinity phase of the primary nitrate response[J]. Plant Journal，2009，57（2）：264-278.

[35]Fan S C，Lin C S，Hsu P K，et al. The Arabidopsis nitrate transporter [WTBX][STBX]NRT1.7[WTBZ][STBZ]，expressed in phloem，is responsible for source-to-sink remobilization of nitrate[J]. Plant Cell，2009，21（9）：2750-2761.

[36]Ishiyama K，Inoue E，Watanabe-Takahashi A，et al. Kinetic properties and ammonium-dependent regulation of cytosolic isoenzymes of glutamine synthetase in Arabidopsis[J]. Journal of Biological Chemistry，2004，24（16）：16598-16605.

[37]Lin S H，Kuo H F，Canivenc G，et al.Mutation of the Arabidopsis [WTBX][STBX]NRT1.5[WTBZ][STBZ] nitrate transporter causes defective root-to-shoot nitrate transport[J]. Plant Cell，2008，20（9）：2514-2528.