3株真菌固態發酵產木質素降解酶的研究

錢靜亞++張正沛+季蓉蓉+馬真+陳菊++李佳少++張志才+葛才林

摘要：對菌株JS-1008、米曲霉CGMCC5992、黃孢原毛平革菌CICC40719等3株真菌固態發酵產木質素降解酶、纖維素酶、半纖維素酶進行了研究。結果表明，3株菌株中，米曲霉發酵產木質素降解酶活性最高，木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶活性可達2.08、1.79 U/g DS，產纖維素酶、半纖維素酶活性則相對較低，分別為1.69、4.19 U/g DS，木質素降解率為7.23%；菌株JS-1008產木質素降解酶、纖維素酶、半纖維素酶的活性均較低，木質素降解率最低；黃孢原毛平革菌產木質素降解酶的水平最低，木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶的活性分別為0.40、0.51 U/g DS，但產纖維素酶、半纖維素酶的活性最高，分別達到2.54、10.86 U/g DS，木質素降解率達11.7%。

關鍵詞：菌株JS-1008；米曲霉；黃孢原毛平革菌；木質素過氧化物酶；錳過氧化物酶

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0277-04

木質素是自然界中除纖維素外的第2大聚合物，由苯丙烷單元通過醚鍵、碳碳鍵連接形成聚酚類三維網狀結構，由于其復雜、穩定、多樣的無定形三維體型而成為農作物秸稈中比纖維素更難降解的成分，導致秸稈營養價值、利用率低[1]。要徹底降解纖維素，關鍵在于降解包裹在纖維素晶體外面的木質素以及半纖維素。因此，秸稈利用研究從過去的降解纖維素的研究轉向了木質素降解研究[2]。

木質素降解過程中的關聯酶系主要有3類：H2O2產生酶系（如葡萄糖氧化酶、乙二醛氧化酶等）、木質素氧化酶系（木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶等）、其他酶系（甲基化酶、纖維二糖脫氫酶等）[3]。在木質素氧化酶系中，研究較多的酶主要有木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶[4]。木質素過氧化物酶是降解木質素酶系的主要成分，在木質素降解中起關鍵作用[5]。錳過氧化物酶在Mn2+、H2O2存在時，能氧化分解芳香環多聚體，被認為是木質素降解的關鍵酶之一[6]。

自然界中產生降解木質素降解酶的微生物有真菌、放線菌、細菌等，其中可徹底將木質素降解為CO2、H2O的是白腐真菌，如黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）[7]、紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum）[8]、栓菌屬（Trametes）[9]、側耳屬（Pleurotus）[10]、糖單孢菌屬（Saccharomonospora）[11]、不動細菌屬菌株B-2（Acinetobacter sp. B-2.）、Pandoraea sp.B-6、纖孔菌屬菌株（Inonotus sp.）[12]等。但是白腐真菌在人工培養條件下產生的木質素降解酶活性較低，造成木質素酶生產成本較高，因此有必要探索木質素降解酶活性高的真菌。

筆者前期從污泥中分離得到了菌株JS-1008和米曲霉CGMCC5992，但未對其降解木質素進行系統研究。本研究比較菌株JS-1008、米曲霉CGMCC5992、黃孢原毛平革菌產木質素降解酶、纖維素酶、半纖維素酶的能力，試圖找到1株產高活性木質素降解酶活性的菌株，以期為降低木質素酶的生產成本，實現其工業化生產應用奠定基礎，也為真菌降解秸稈木質纖維素并用于秸稈的資源化利用提供依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

JS-1008，分離自江蘇大學玉帶河污泥樣品中，初步鑒定為匍枝根霉。米曲霉，分離自江蘇大學玉帶河污泥樣品中，現保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保存編號為CGMCC5992。黃孢原毛平革菌CICC40719，購自中國工業微生物菌種保藏中心。

1.1.2培養基

玉米芯粉固體發酵培養基：稱取一定量玉米芯粉和水，按照質量比1 ∶[KG-*3]3混合，分裝在直徑15 cm、無熱力學應變性的塑料盤中，每盤60 g，并在121 ℃滅菌1 h。[HJ]

1.2方法

1.2.1玉米秸稈、玉米芯預處理

將同一批次、產地、采收季節的玉米秸稈、玉米芯，用小型藥物粉碎機粉碎成粉末，并將粉末過100目篩，密封于塑料保鮮袋中，于背光、干燥處儲藏備用。

1.2.2固態發酵

在無菌條件下，將試管斜面中的菌種接種到已滅菌的含15 g麥麩、20 mL水的250 mL三角瓶中，28 ℃培養4～7 d后轉接到玉米芯粉的發酵培養基中，每盤接種 6 g，混勻后28 ℃培養30 d。為在發酵過程中能保持培養基濕度，所有塑料盤均用保鮮膜密封。

1.2.3粗酶液制備

發酵結束后，稱取5 g固態發酵基質于250 mL三角瓶中，加入100 mL蒸餾水，28 ℃、150 r/min振蕩提取1 h，-4 ℃冷凍離心后獲得的上清液即為粗酶液，置于1.5 mL的離心管中-18 ℃保存備用。

1.2.4.3纖維素酶活性的測定

采用測定羧甲基纖維素酶活性（CMC）的方法測定纖維素酶活性。

葡萄糖標準曲線的制作：稱取1 g于105 ℃烘至恒質量的葡萄糖，加水定容至1 L，得1 g/L的葡萄糖標準溶液。分別移取上述標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，加水補至2 mL，加入2 mL DNS試劑，加塞后在沸水浴中加熱 10 min，冷卻后定容至15 mL，用分光光度計測550 nm波長下的吸光度，以濃度-吸光度繪制標準曲線。

測定步驟：取0.5 mL粗酶液，再分別吸取1.5 mL CMC溶液，50 ℃水浴保溫30 min；對照樣用0.5 mL稀釋酶液，加入1.5 mL醋酸緩沖液，50 ℃水浴30 min，再吸取DNS試劑 2 mL，搖勻后具塞，沸水浴反應10 min，冷卻后補加水至 15 mL，振蕩混勻，用對照調零點，于550 nm下測吸光度[16]。1 min內由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活性單位（U）。纖維素酶（CMC）活性計算方法如下：

[JZ（]CMC酶活性=[SX（]葡萄糖質量×2×1 00060[SX）]（U/g）。[JZ）][JY]（3）

1.2.4.4半纖維素（木聚糖酶）酶活性的測定

木糖標準曲線的制作：稱取1 g于105 ℃烘至恒質量的木糖，加水定容至1 L，得1 g/L木糖標準溶液。分別移取上述標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，加水補至2 mL，加入2 mL DNS試劑，加塞后在沸水浴中加熱10 min，冷卻后補水定容至 15 mL，用分光光度計在550 nm波長下測吸光度，以濃度-吸光度繪制標準曲線。

測定步驟：取粗酶液0.5 mL，再吸取1%木聚糖溶液 1.5 mL，搖勻，50 ℃水浴1 h，取出后，再吸取2 mL DNS試劑搖勻，加塞立即沸水浴反應10 min，冷卻后補加水定容到 15 mL，輕輕上下搖勻，對照用0.5 mL稀釋酶液加1.5 mL醋酸緩沖液，不加木聚糖溶液。按上述步驟，用對照調零點，于550 nm下測吸光度[17]。1 min內水解木聚糖生成相當于 1 μmol 木糖等還原物質的量為1個酶活性單位，以U/g表示。半纖維素（木聚糖酶）酶活性計算方法如下：

[HS2][JZ（]半纖維素酶活性=[SX（]木糖質量×2×1 00050[SX）]（U/g）。[JZ）][JY]（4）

1.2.5木質素降解率的測定

稱取一定量（G）樣品（過40目篩）置于圓底燒瓶中，加入2 mol/L鹽酸100 mL，5～10 min內煮沸，并持續保持微沸60 min。趁熱用已知質量的玻璃坩堝抽濾，并用沸水反復沖洗玻璃坩堝及殘渣，至濾液呈中性。用少量丙酮沖洗殘渣至抽下的丙酮液呈無色，并抽凈丙酮。將玻璃坩堝置于105 ℃烘箱中烘2 h后，在干燥器中冷卻 30 min 稱質量G1，直至恒質量。將酸性洗滌纖維加入72%硫酸，在20 ℃消化3 h后過濾，并沖洗至中性。將殘渣烘干稱質量（G2），并灼燒灰化稱質量（G3），G3與G2的差值即為木質素含量。木質素降解率計算方法如下：

[HT9.，6"][JP2]木質素降解率=[SX（]未發酵秸稈中木質素含量-發酵后秸稈中木質素含量未發酵秸稈中木質素含量[SX）]×100%。[HT][JY]（5）[JP]

2結果與分析

[HTK]2.13株菌株產木質素降解酶、纖維素酶、半纖維素酶的比較[HT]

2.1.1葡萄糖和木糖標準曲線如圖1所示，葡萄糖標準曲線方程為y=0.953 7x-0.090 3，r2為0.999 2；如圖2所示，木糖標準曲線為y=1.026x-0.022 5，r2為0.999 0。說明其適合用于葡萄糖、木糖含量的測定。

2.1.23株菌株產木質素過氧化物酶的分析

如圖3所示，米曲霉在固態培養18 d時木質素過氧化物酶活性達到最大值，為1.79 U/g DS。JS-1008菌株產酶活性較低，在培養 9 d 時酶活性達到最大值，為0.39 U/g DS。黃孢原毛平革菌培養15 d時產酶活性最大， 為0.40 U/g DS。米曲霉產木質

素過氧化物酶能力高于菌株JS-1008、黃孢原毛平革菌，但是米曲霉產酶活性出現最大值的時間較JS-1008菌株、黃孢原毛平革菌明顯滯后，這可能是因為木質素降解酶是次生代謝產物，米曲霉菌在生長后期限氮的條件下利于酶的產生，生長前期米曲霉菌體利用培養基中的氮等營養成分進行細胞快速生長，后期氮源消耗到一定程度才進入產酶期。而該培養基對于JS-1008菌株、黃孢原毛平革菌沒有產生限制作用，產酶時期提前。

2.1.33株菌株產錳過氧化物酶的分析

如圖4所示，米曲霉能產生較高的錳過氧化物酶活性，在發酵12 d時酶活性最高，為2.27 U/g DS，而菌株JS-1008、黃孢原毛平革菌產錳過氧化物酶活性相對較低，最高僅分別為0.52、0.51 U/g DS。JS-1008菌株不能促進產酶的原因可能是匍枝根霉能分泌大量淀粉酶，這種酶降解秸稈中的淀粉后產生部分β-環糊精，有研究表明β-環糊精對錳過氧化物酶的產生有一定抑制作用[18]，此外淀粉酶會降解淀粉，產生大量葡萄糖，造成碳源過剩抑制菌體生長，從而也抑制了錳過氧化物酶的分泌。

2.1.43株菌株產纖維素酶的分析

纖維素酶是使纖維素

降解生成葡萄糖的酶的總稱，主要有葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶，這3種酶協同作用可將天然纖維素降解為葡萄糖。如圖5所示，在發酵20 d時，黃孢原毛平革菌、米曲霉產纖維素酶活性都達到最大值，分別為2.54、1.69 U/g DS，JS-1008菌株在發酵8 d時酶活性最高，為218 U/g DS。黃孢原毛平革菌在發酵6 d時酶活性迅速上升，12～20 d時酶活性趨于穩定。米曲霉在發酵12 d后到達酶活性迅速增長期，16～20 d是酶的穩定生產期，但酶活性并不高，是3株菌株中產酶活最低且產酶時間最遲的菌株，這種現象可能是由于米曲霉能產生葡聚糖內切酶、外切酶，但產生β-葡萄糖苷酶能力弱，使纖維二糖積累造成產物抑制。JS-1008 菌株的產酶能力較米曲霉強，且產酶時間明顯提前，但酶活性達到最高后很快降低，并沒有出現產酶的穩定期。

2.1.53株菌株產半纖維素酶（木聚糖酶）的分析

微生物產生的半纖維素酶主要是指β-D-l，4-木聚糖酶、β-木糖苷酶，β-D-1，4-木聚糖酶的主要水解產物為木二糖及其以上的低木聚糖，β-木糖苷酶可以作用于低聚木糖的末端，釋放木糖。如圖6所示，與米曲霉、菌株JS-1008相比，黃孢原毛平革菌產半纖維素酶的酶活性最高，在固態發酵16 d產生高達10.86 U/g DS的木聚糖酶活性。菌株JS-1008在發酵8 d時即達到酶活性最大值，為5.64 U/g DS，但菌株 JS-1008 無產酶的穩定期；米曲霉酶活性最低，12～20 d是產酶較為穩定的時期，但酶活性最高時也僅為4.42 U/g DS。木聚糖酶是一種誘導酶，需要將秸稈中的淀粉降解為小分子物質后才能誘導菌株產生，3株菌株產木聚糖酶的趨勢與產纖維素酶的趨勢大致相同。

2.23株菌株降解木質素的比較

[CM（24]如圖7所示，米曲霉木質素降解率達 7.23%；菌株

JS-1008 木質素降解率僅為4.14%；而黃孢原毛平革菌對木質素的降解率最高，達到11.00%。米曲霉能產生活性較高的與降解木質素有關的酶，因此降解率較高；而黃孢原毛平革菌能產生高活性的纖維素酶、半纖維素酶，破壞木質素與半纖維素之間緊密結合的化學鍵，使木質素游離被降解，所以木質素降解率最高，雖然黃孢原毛平革菌分泌錳過氧化物酶和木質素過氧化物酶的酶活性不高，但能分泌葡萄糖氧化酶和乙二醇氧化酶等產H2O2的酶，這可能也是造成黃孢原毛平革菌降解率最高的原因。

3結論

米曲霉CGMCC5992產木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶等與降解木質素有關的酶的活性最高，但產纖維素酶、半纖維素酶的能力較弱，對木質素的降解率為7.17%，可認為米曲霉是產酶專一性較強的菌株，具有用于生產木質素降解酶的潛力，也可考慮與產纖維素酶、半纖維素酶活性高的菌株進行混菌發酵，降解秸稈木質素和纖維素。

菌株JS-1008雖然具有一定的降解木質素的能力，但與黃孢原毛平革菌、米曲霉CGMCC5992相比，產降解木質素相關的酶及纖維素酶、半纖維素酶的活性較低，且降解木質素的能力較差，對菌株JS-1008的應用范圍需要進一步研究。

黃孢原毛平革菌產木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶的水平低于米曲霉，但產纖維素酶、半纖維素酶的活性最高，且木質素降解率也最高。因此，黃孢原毛平革菌常被廣泛應用于纖維素和木質素材料的降解中。

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