有機質(zhì)譜應(yīng)用于抗體類藥物結(jié)構(gòu)解析的研究進展

趙永強，劉 鋒，桑志紅，李 梅，王 娜，何 昆

(國家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850)

有機質(zhì)譜應(yīng)用于抗體類藥物結(jié)構(gòu)解析的研究進展

趙永強，劉 鋒，桑志紅，李 梅，王 娜，何 昆*

(國家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850)

抗體類藥物因其靶向性，能夠直接與目標特異結(jié)合，并且藥物副作用小、毒性低，在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景。質(zhì)譜(MS)以其快速、高靈敏度和高分辨率成為抗體藥物結(jié)構(gòu)分析的重要手段，為藥物的質(zhì)量控制和安全性方面提供了強有力的技術(shù)支撐。該文針對快速發(fā)展的有機質(zhì)譜技術(shù)在抗體類藥物的氨基酸序列、高級結(jié)構(gòu)以及修飾鑒定方面的應(yīng)用進行了綜述。

有機質(zhì)譜；抗體；結(jié)構(gòu)解析;綜述

近年來，單克隆抗體藥物進行靶向治療得到廣泛應(yīng)用，并已成為一種普遍的生物治療手段，現(xiàn)今美國FDA已經(jīng)批準了多達20種抗體藥物上市，同時，近300種單克隆抗體藥物正處于研發(fā)階段[1]。2014～2019年間，美國有4個、歐洲及其他國家有6個單抗產(chǎn)品專利到期，國內(nèi)外大批醫(yī)藥廠商瞄準市場，不斷擴大研發(fā)和生產(chǎn)規(guī)模，單克隆抗體的壟斷地位也將動搖[2-3]。抗體及抗體偶聯(lián)藥物的完整分子量約在150 kDa，其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)極易導(dǎo)致不均一性，也給抗體藥物的完整解析帶來極大難度。國際上，美國FDA在已發(fā)布的生物仿制藥指導(dǎo)文件中對抗體完整結(jié)構(gòu)解析做了詳細闡述；目前，國內(nèi)仍缺乏明確的質(zhì)量標準來評價和約束單抗藥品市場。有機質(zhì)譜作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的強有力檢測手段，應(yīng)用CID/ETD/HCD等[4-6]技術(shù)依據(jù)不同的離子碎裂方式，使鳥槍法鑒定氨基酸序列的技術(shù)在蛋白質(zhì)領(lǐng)域不斷發(fā)展和完善，已成為單抗藥物及其仿制藥結(jié)構(gòu)鑒定的必備工具。

1 抗體類生物大分子完整分子量及氨基酸序列分析的研究

20世紀80年代以來，軟電離技術(shù)成為有機質(zhì)譜的強大助力，尤其是基質(zhì)輔助激光解吸附電離(MALDI)和電噴霧電離(ESI)在大分子蛋白檢測中發(fā)揮了重大作用[7]。MALDI-TOF-MS產(chǎn)生單電荷離子，反射模式下檢測范圍為500～5 000 Da，線性模式一般檢測>5 000 Da，同時隨著檢測蛋白分子量的增加，會表現(xiàn)出質(zhì)量準確度和分辨率降低的情況，使峰寬和峰形無法達到滿意的效果[8]。ESI-MS產(chǎn)生多電荷離子，譜圖結(jié)果較單電荷離子復(fù)雜，但彌補了檢測范圍的不足，原始數(shù)據(jù)可通過軟件去卷積處理[9]。Shin等[10]應(yīng)用LC-MS方法對曲妥珠單抗完整蛋白及其亞基的相對分子量進行了檢測，從完整蛋白水平獲得了曲妥珠單抗的氨基酸全序列確認，并使氨基酸序列覆蓋率達到100%；同時，糖基化分析是通過對游離的N-連接寡糖進行2-AB熒光標記后再用LC-FLR-MS方法進行檢測，最后對糖基化修飾進行結(jié)構(gòu)解析和確認，聯(lián)合使用這些分析方法，并同時比對了3批不同批號和不同工藝的曲妥珠單抗的異同，能夠有效地對抗體類藥物進行日常質(zhì)量檢測和深度表征,同時有效控制抗體藥物的質(zhì)量，從而對曲妥珠單抗藥物的質(zhì)量控制提供了依據(jù),為病人提供了安全可靠的生物治療藥品。

單克隆抗體的分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前認為仿制藥必須與原研藥的氨基酸序列一致才可稱為仿制藥，否則會被認為是一種新的抗體藥物，同時仿制藥需要保證安全性和有效性，要達到兩個基準，對醫(yī)藥廠商而言非常具有挑戰(zhàn)性[11-12]。目前，最常用的方法是采用電噴霧離子化，必要時使用離子淌度等技術(shù)增加分離效果，以及LC-MSE技術(shù)全面展示抗體完整的序列結(jié)構(gòu)[13-14]。Xie等[15]對候選生物仿制藥IgG1單克隆抗體的完整分子量、氨基酸序列，以及翻譯后修飾進行識別和量化，利用肽圖譜和數(shù)據(jù)獨立采集的液質(zhì)中交替的低和高碰撞能量掃描模式LC-MSE，精確鑒定生物仿制藥和創(chuàng)新藥中幾個氨基酸殘基的差異在重鏈序列之間。這些結(jié)果表明，準確完整的質(zhì)量測定、糖譜分析和LC-MSE肽譜可作為一套常規(guī)工具，用于監(jiān)測單克隆抗體候選生物仿制藥和創(chuàng)新藥的質(zhì)量。

2 單克隆抗體藥物高級結(jié)構(gòu)的研究

單克隆抗體等蛋白質(zhì)藥物療效的發(fā)揮取決于蛋白的高級結(jié)構(gòu)，高級結(jié)構(gòu)的變化可能會導(dǎo)致藥物在治療時產(chǎn)生非預(yù)期的有效性和安全性隱患[16-17]。X-射線晶體衍射[18]和核磁共振[19]是研究蛋白高級結(jié)構(gòu)的傳統(tǒng)方法，但實際上，這兩種方法均有局限性，對于單克隆抗體這類分子量大、空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜的藥物并不能直觀完整地反映蛋白結(jié)構(gòu)。

近年來，質(zhì)譜技術(shù)在研究蛋白高級結(jié)構(gòu)方面進入了新的領(lǐng)域，氫氘交換-質(zhì)譜聯(lián)用(HDX-MS)成為研究單克隆抗體等生物藥高級結(jié)構(gòu)的有力工具[20-21]。其原理是將待測樣本浸入重水溶液中，蛋白的氫原子與重水的氘原子發(fā)生轉(zhuǎn)換，根據(jù)交換速率的快慢對蛋白的空間構(gòu)象進行評價。HDX主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)構(gòu)象的研究，修飾后構(gòu)象動力學(xué)，折疊/重折疊，蛋白質(zhì)-配體/蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白聚集[22]。Mo等[23]應(yīng)用HDX-MS技術(shù)驗證了蛋氨酸的氧化對IgG抗體生物學(xué)功能的影響，并提供了非常有價值的信息。這一重要研究可以協(xié)助(CQAs)評估抗體的治療。同時，HDX-MS還可以檢測到低含量的蛋氨酸氧化引起的局部構(gòu)象變化。對于單克隆抗體，更多的是在多肽水平-HDX進行高級結(jié)構(gòu)可比性研究，比對并定位原研藥與Biosimilar、Biobetter之間高級結(jié)構(gòu)的差異[24-25]。 Pan等[26]基于HDX-MS結(jié)合蛋白水平Top-down技術(shù)與多肽水平Bottom-up聯(lián)用技術(shù)，使殘基信息與亞基級信息形成互補，完整解析了2批次貝伐珠單抗及1批次原研藥結(jié)構(gòu)的一致性，結(jié)果顯示重鏈覆蓋率87%，輕鏈覆蓋率74%，并且HDX對重、輕鏈檢測數(shù)據(jù)顯示3批樣品的高級結(jié)構(gòu)無明顯差異。該方法也成為目前抗體藥物高級結(jié)構(gòu)檢測的標準流程，將抽象的概念轉(zhuǎn)化成數(shù)據(jù)信息既體現(xiàn)了其廣泛的應(yīng)用范圍，也在空間結(jié)構(gòu)細微差別的解析中體現(xiàn)了直觀性和準確性。

3 抗體藥物糖基化修飾的研究

單抗藥物藥效的發(fā)揮、穩(wěn)定性以及免疫原性，很大程度上與翻譯后修飾相關(guān)，尤其是蛋白N-糖譜在抗體藥物治療中顯著影響單克隆抗體的生物學(xué)功能，并在很大程度上取決于宿主細胞的基因型和培養(yǎng)條件，因此會導(dǎo)致N-糖基化的不均一性[27-28]。作為抗體藥物最主要的翻譯后修飾，變異形式主要有脫巖藻糖化、唾液酸化、末端半乳糖的數(shù)目不同等[7]。由于單抗藥物在生產(chǎn)過程中存在多種糖型及修飾位點的變化，導(dǎo)致不同批次生產(chǎn)的抗體可能會有不同的藥效及體內(nèi)穩(wěn)定性。因此，糖型解析也成為抗體藥物質(zhì)量控制的一個至關(guān)重要的檢測項目。

MALDI-TOF-MS被應(yīng)用于早期糖型的解析中，Raquel等[29]使用正離子模式的MALDI-TOF 以及負離子模式ESI-MS 對經(jīng)過PNGase-F釋放的N-糖基進行了分析，通過比對脫糖前后抗體的肽質(zhì)量指紋譜差異，獲得了尼妥珠單抗的N-糖鏈結(jié)構(gòu)信息。但深入研究糖結(jié)構(gòu)及糖含量信息，則需依靠液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。經(jīng)典方法是進行2-AB熒光標記，通過熒光檢測器(FLR)進行分析[30]。Shang等[31]開發(fā)了一個高效表征單克隆抗體及相關(guān)糖蛋白的方法，應(yīng)用傳統(tǒng)的PNGaes F釋放糖基，2-AB標記，基于Q-TOF與HILIC技術(shù)，采用三氟乙酸代替甲酸銨為流動相條件，可實現(xiàn)高分辨率和高靈敏度鑒定低豐度N-糖基結(jié)構(gòu)。Jefferis等[32]詳細報道了重組抗體的糖基化的重要性，抗體藥物屬于生物大分子藥物,其生物功能的發(fā)揮離不開復(fù)雜的翻譯后修飾，糖基化修飾作為抗體最重要的翻譯后修飾,對于抗體的生物活性和體內(nèi)代謝有著重要的作用。Huang等[33]研究了液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對可變區(qū)域糖基化對抗體清除率的影響，發(fā)現(xiàn)20%的人免疫球蛋白的N-糖基化位點均位于C(H)2區(qū)域，利用LC-MS技術(shù)結(jié)合多種酶切的方法，明確了糖修飾的具體位置是在CDR2的重鏈可變位置，同時證明了雙鏈低聚糖缺乏，半乳糖的清除率比在FV域其他結(jié)構(gòu)稍快。2015年，Waters公司研發(fā)了RapiFluor-MS技術(shù)，替換2-AB熒光試劑，并將前處理時間縮短至30 min，且標記效率以及熒光信號質(zhì)量均有顯著提高。

抗體偶聯(lián)藥物(ADCs)是近年來抗腫瘤抗體藥物研發(fā)的熱點和潮流[34-35]。作為一種特別的翻譯后修飾類型，ADC藥物是將小分子細胞毒性物質(zhì)通過中間連接體(MCC)偶聯(lián)到單克隆抗體特定氨基酸殘基上，如半胱氨酸、賴氨酸側(cè)鏈氨基，通過抗體的靶向作用將細胞毒性物質(zhì)作用到靶標，達到治療作用。目前有超過40種臨床用ADC藥物處于研發(fā)階段[36]。以獲得FDA批準的治療HER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌藥物Trastuzumab emtansine(T-DM1)[37]為例，小分子藥物美登素(DM1)與連接體(MCC)由1個硫醚結(jié)構(gòu)連接，形成1個修飾基團，分子量約為956.36 Da。而通常的ADC藥物含有0～8個不等的小分子藥物基團[38]。目前關(guān)于ADC藥物結(jié)構(gòu)解析的文獻報道，更多是關(guān)注不同偶聯(lián)異構(gòu)體的完整出峰以及平均藥物與抗體的偶聯(lián)比例(DAR)。Marcoux等[39]應(yīng)用原位離子淌度質(zhì)譜(native IM-MS)準確解析了T-DM1 平均偶聯(lián)藥物比例及不同異構(gòu)體的分布情況，從完整蛋白水平反映出該抗體偶聯(lián)藥物的結(jié)構(gòu)信息，為抗體偶聯(lián)藥物的結(jié)構(gòu)解析提供了技術(shù)手段。Chen等[40]對T-DM1及其仿制藥完整蛋白(DAR)進行了準確解析，還對92個偶聯(lián)位點(88個賴氨酸位點和4個N端位點)進行了全面解析，實際鑒定到82個偶聯(lián)位點，同時比對了在不同結(jié)構(gòu)域中賴氨酸偶聯(lián)位點的相對強度，由此反映了偶聯(lián)比率的差異。該結(jié)果為抗體偶聯(lián)藥物的深入研究指出了方向，并建立了評價指標。

4 展 望

單克隆抗體等生物大分子不同于常規(guī)生物藥，其分子量巨大，氨基酸存在突變的幾率高，并且高級結(jié)構(gòu)復(fù)雜、糖基化形式不均一，尤其是抗體偶聯(lián)藥物制備工藝復(fù)雜，增加了結(jié)構(gòu)解析的難度，諸如小分子藥物偶聯(lián)位點的完整解析，游離小分子藥物痕量檢測等均難以依靠傳統(tǒng)或單一的檢測方法來實現(xiàn)。同時，出于對抗體生物藥安全性以及產(chǎn)業(yè)保護的考慮，國內(nèi)外藥監(jiān)部門近年來也在不斷完善并提升抗體藥物質(zhì)控標準。Chen等[40]聯(lián)合中國食品藥品檢定研究院建立了基于ADC藥物 Kadcyla?和 Adcetris?原研藥與仿制藥結(jié)構(gòu)確證的方法，從藥物完整分子量、一級結(jié)構(gòu)以及偶聯(lián)藥物修飾等方面進行了一致性評價，綜合解析了原研藥與仿制藥細微結(jié)構(gòu)的異同。總之，為了應(yīng)對日益擴大的抗體藥物市場以及對藥物質(zhì)量控制標準的不斷提高，確保臨床用藥的安全性，建立系統(tǒng)的分析平臺以及形成一套基于LC-MS/MS的多項目綜合解析體系已成為抗體結(jié)構(gòu)解析的必然趨勢。

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Research Progress on Application of Organic Mass Spectrometry in Structural Analysis of Antibody Drugs

ZHAO Yong-qiang，LIU Feng，SANG Zhi-hong，LI Mei，WANG Na，HE Kun*

(National Center of Biomedical Analysis，Beijing 100850，China)

With their targeting abilities，small sid-effects and low toxicity,antibody drugs could be directly combined with target specific，and they have broad application prospects in clinical practice.With its rapidness，high sensitivity and resolution，mass spectrometry(MS) has become an important means to analyze the structure of antibody，which provides a strong technical support for quality control and safety of the drug.In this paper，the rapid application development of organic mass spectrometry in the consistency of the amino acid sequence of antibody class，advanced structure and post translational modification(PTMs) are reviewed .

organic mass spectrometry；antibody；structural analysis;review

2016-09-28；

2016-11-09

新藥創(chuàng)制重大專項(2014ZX09304311-001)；國家科技支撐計劃(2015BAK45B01)；科技基礎(chǔ)性工作(創(chuàng)新方法)專項(2012IM030300)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.008

O657.63；O629.7

A

1004-4957(2017)02-0201-04

*通訊作者：何 昆，博士，副研究員，研究方向：藥物分析、蛋白質(zhì)組學(xué)，Tel：010-66930306，E-mail：hk@proteomics.cn